全 文 ：第 29卷　第 2期 　　　　　　　　　　　　　　　　西　南　林　学　院　学　报　　　　　　　 Vol.29　No.2
　 2009年 4月 　　　　　　　　　　　　JOURNALOFSOUTHWESTFORESTRYUNIVERSITY　　　　　 Apr.2009　
＊　收稿日期:2008-12-31　　＊＊为通信作者
基金项目:国家 “ 948”项目(No.2004-4-60)资助;北京农学院三项基金重点项目资助;云南省重点建设学科西南林学院森林培育学
基金项目(500018)资助。
作者简介:高家翔(1984—), 男 , 云南昆明人 , 硕士生 , 主要从事园林植物分子生物学方面的学习与研究。
作者 E-mail:eraserhead59146@hotmail.com;　通信作者 E-mail:hcz70@163.com;yangkai8978@ 126.com
早园竹叶绿体 atpA基因序列及系统进化分析＊
高家翔1, 2 , 胖铁良 2, 3 , 唐　征2 , 张　兰 2, 3 , 何承忠4＊＊ , 杨　凯2＊＊
(1.西南林学院 园林学院 ,云南昆明 650224;2.北京农学院农业应用新技术北京市重点实验室 ,北京 102206;
3.河北农业大学 生命学院 ,河北 保定 071001;4.西南林学院资源学院 ,云南昆明 650224)
摘要:在构建叶绿体 DNA基因组文库的基础上 ,克隆了早园竹叶绿体 atpA基因 ,与禾本科水稻 、玉米
等 11种植物 atpA基因的 SNP对比分析发现 ,早园竹与供试禾本科植物叶绿体 atpA基因序列间共有
110个 SNP位点 ,其中与水稻 Indica, Japonica和野生稻之间仅有 1个 SNP位点;与玉米 、高粱 、甘蔗及
杂交甘蔗之间有 2个 SNP位点;而与小麦 、大麦 、匍茎剪股颖和黑麦草之间的 SNP位点较多。基于
atpA基因序列和编码氨基酸序列构建的 Neighbor-joining系统进化树显示 ,供试的禾本科植物在系统
进化上可划为 2个进化类群和 4个进化亚群 ,水稻与早园竹处于同一亚群。表明早园竹在进化关系
上与水稻最近 ,其次与甘蔗 、玉米和高粱进化关系较近 ,而与麦类及其近缘植物的进化关系较远。
关键词:早园竹;禾本科植物;atpA基因;序列分析;系统关系
中图分类号:Q943.2　　　文献标识码:A　　　　　文章编号:1003-7179(2009)02-0031-06
　　竹子属于禾本科 (Poaceae)竹亚科 (Bambuso-
ideae)多年生常绿单子叶植物 ,是禾本科植物中形
态构造较为独特的类群 ,以开花周期长 、假小穗 、木
质秆 、复合分枝 、发达的根系和地下茎营养体的分生
繁殖区别于其他禾本科植物。作为禾本科植物中最
原始的亚科之一 ,竹类植物集原始和进化特征于一
体 ,在进化中具有与其他亚科不同的独特路线 ,其系
统地位及系统学研究对于整个禾本科中的进化关系
研究具有重要意义 [ 1-3] 。然而 ,相对于水稻 (Oryza
sativa)等重要禾本科作物 ,针对竹类植物在禾本科
内的系统研究较少 ,使竹亚科在禾本科中的系统位
置和进化关系一直没有达到共识 。目前 ,虽然依据
形态学 、不同来源(核基因组 、叶绿体基因组或线粒
体基因组)的基因序列或同一来源不同基因的序列
开展了竹亚科的系统分类地位研究 ,但获得的结果
也都有所差异[ 3-6] 。
随着分子生物学的发展 ,基于基因序列测定的
分子数据已被广泛应用于物种分类学 、系统学和种
群遗传学的研究。植物叶绿体 DNA(chloroplast
DNA, cpDNA)属于母性遗传 ,相对于核基因组分子
量小 ,结构简单 ,序列保守 ,突变率较低 ,遗传稳定 ,
cpDNA分析被认为是研究系统发生和群体遗传学
的理想方法 ,并被广泛应用[ 7-9] 。
早园竹 (PhylostachyspropinquaMcClure)属于
竹亚科刚竹属 , 是竹亚科中比较高级的竹种之
一[ 2] 。本研究以叶绿体 atpA基因作为进化分析对
象 ,对早园竹和水稻 、玉米 (Zeamays)、大麦 (Hor-
deumvulgare)、小麦 (Triticumaestivum)等禾本科作
物的叶绿体 atpA基因序列进行比较分析 ,以期了解
早园竹与水稻 、玉米 、大麦和小麦等禾本科植物之间
的亲缘关系 ,为早园竹在禾本科植物中分类学地位
的确定提供分子生物学依据。
1　材料与方法
1.1　材料来源
供试材料早园竹幼嫩叶片采集于中国林业科学
研究院北京良乡竹藤资源圃。
1.2　早园竹叶绿体基因组 DNA的提取
依照龚小松等 [ 10] 的方法提取早园竹叶绿体
DNA,用 1%琼脂糖凝胶电泳检测 DNA质量 ,经紫
外分光光度计测定 DNA的浓度后 ,于 4℃冰箱内保
存备用。
1.3　早园竹叶绿体基因组 DNA文库的构建
采用 10U限制性内切酶 EcoRI部分酶切 10μg
早园竹叶绿体基因组 DNA,反应体积为 100μL, 37
℃酶切 15min,终止反应后通过 0.8%琼脂糖凝胶
电泳分离 、回收 1 ～ 2kb长度酶切 DNA,将回收的部
分酶切 DNA片段与以限制性内切酶 EcoRI酶切并
经牛肠碱性磷酸脂酶处理的 pUC18载体连接;连接
产物转化感受态大肠杆菌(Escherichiacoli)Top10;
铺平板培养进行文库的滴度测定 ,获得 3.04 ×105
个重组克隆 。同法构建早园竹叶绿体基因组 DNA
限制性内切酶 HindII部分酶切后的 DNA文库 ,获
得约 2.9×105个重组克隆。
1.4　序列分析与系统进化树构建
早园竹叶绿体基因组 DNA文库克隆后 ,由北京
金螺旋生物科技中心测序 ,测序结果采用 BLAST软
件与 GenBank数据库中的序列进行比对分析 ,依据最
大相似性原则确定早园竹 atpA基因序列。在 Gen-
Bank中检索获得其他禾本科植物叶绿体 atpA基因
序列 ,植物名称和编号分别为:水稻 [ O.sativaIndica
Group(NC008155)] 、水稻 [ O.sativaJaponicaGroup
(NC001320)] 、野生稻 [ O.nivara(NC005973)] 、高粱
[ Sorghumbicolor(NC008602)] 、甘蔗 [ Sacharumofi-
cinarum(NC006084)] 、杂交甘蔗 [ S.hybridcultivar
SP.80.3280 (NC005878 )] 、 玉 米 [ Z. mays
(NC001666)] 、匍 茎 剪 股 颖 [ Agrostisstolonifera
(NC008591)] 、小麦 [ T.aestivum(NC002762)] 、黑麦
草 [ Loliumperenne(NC009950)]和大麦 [ H.vulgare
subsp.vulgare(NC008590.1)] 。
32 西　南　林　学　院　学　报　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　第 29卷
　　使用 ORFFinder(htp://www.ncbi.nlm.nih.
gov/gorf/gorf.html)软件和 DNAMAN软件推导出早
园竹和其他禾本科植物叶绿体 atpA基因编码的氨
基酸序列 ,并分别对叶绿体 atpA基因的核苷酸序列
和氨基酸序列进行比对分析。按照最大同源性的原
则 ,应用 MEGA4.0软件对早园竹和相应禾本科植
物叶绿体 atpA基因的核苷酸序列和氨基酸序列进
行排序 ,采用 Kimura-2-Parameter模型计算核苷酸差
异值 ,运用邻接法 (Neighbor-JoiningMethod)构建
系统进化树 ,并用 “Bootstrap”自展数 1 000次自举检
测各分支的置信度。
2　结果与分析
2.1　早园竹及其他禾本科植物叶绿体 atpA基因核
酸序列的变异
克隆获得的早园竹叶绿体 atpA基因核酸序列
长度为 1 524 bp,与其他 11个禾本科植物叶绿体
atpA基因核酸 SNP(singlenucleotidepolymorphism)
位点进行分析后发现 , 12个禾本科植物样本的 atpA
基因核酸序列之间共存在 110个 SNP位点 ,其中早
园竹与水稻 Indica, Japonica和野生稻之间仅在第
1 173位点处存在 1个 SNP位点 ,其余碱基完全一
致;与玉米 、高粱 、甘蔗和杂交甘蔗之间的序列在第
99和 1 203两个位点处出现 SNP位点 ,其余一致;与
小麦 、大麦 、匍茎剪股颖和黑麦草之间的 SNP位点
较多 ,达到 103个(图 1)。
2.2　早园竹及其他禾本科植物叶绿体 atpA基因编
码氨基酸序列的变异
采用 ORFFinder和 DNAMAN软件推导出 12
个禾本科植物叶绿体 atpA基因编码的氨基酸序列 ,
其中早园竹叶绿体 atpA基因共编码 507个氨基酸
(图 2)。对氨基酸序列的比对结果显示 , 12条氨基
酸序列间共存在 24个差异位点 ,其中早园竹与水稻
Indica, Japonica以及野生稻之间的所有氨基酸序列
完全相同 ,无差异位点出现;与甘蔗 、杂交甘蔗 、高粱
以及玉米之间的氨基酸序列在第 288和 305位点处
发生变异 ,存在 2个差异位点;其余差异位点均出现
在早园竹与小麦 、大麦 、匍茎剪股颖和黑麦草氨基酸
序列之间(图 2)。
33第 2期　　　　　　　　　　　　　　高家翔等:早园竹叶绿体 atpA基因序列及系统进化分析
2.3　12种禾本科植物的系统进化树分析
基于 Kimura-2参数模型 ,应用 MEGA4.0分析
软件 ,对获得的 12种禾本科植物叶绿体 atpA基因
核苷酸序列和编码的氨基酸序列采用邻接法分别构
建分子系统进化树 ,并用 “Bootstrap”自展 1 000次检
验各分支的置信度。从系统进化树的拓扑结构可以
看出 ,基于核苷酸序列和氨基酸序列的聚类结果完
全一致 ,将 12种禾本科植物聚分为 2个大群 ,每个
大群又可以进一步细划为 2个亚群。第 1大群中包
括了早园竹 、水稻 、玉米 、高粱和甘蔗 ,其中早园竹
和水稻以 98%以上的置信度聚合为 1个亚群 ,玉
米 、高粱和甘蔗以 99%以上的置信度聚合在一起 ,
构成了第 1大群的另 1个亚群 。第 2大群由大麦 、
小麦 、匍茎剪股颖和黑麦草构成 ,其中大麦和小麦
以 99%(基因碱基序列 )或 68%(氨基酸序列)的
置信度聚合为 1个亚群 ,而匍茎剪股颖和黑麦草
以 94%以上的置信度聚合为第 2大群的另 1个亚
群 ,见图 3 , 4。
34 西　南　林　学　院　学　报　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　第 29卷
3　讨　论
植物叶绿体基因组(cpDNA)为闭环双链 DNA,
约占植物总 DNA的 10% ～ 20%,长度一般为 120 ～
220kb,与核基因组相比 ,叶绿体基因组较小 ,多拷
贝且结构简单 ,仅有 2个作为一个遗传单位进化的
反向重复区 ,容易通过测序得到基因序列 。cpDNA
基因序列保守 ,核酸替代速率相对较低 ,有独立的进
化路线 ,不依赖于其他任何数据即可构建分子系统
树 ,对其进行分析 ,可为从历史和系统发育的角度解
释生物多样性提供可靠和准确的信息 ,被认为是研
究系统发生和群体遗传学的理想材料[ 11-13] 。 Olm-
stead等 [ 14]对适用于系统学研究的叶绿体基因进行
了筛选 ,认为叶绿体 atpA基因属保守编码基因序
列 ,适合于进行大类群的系统与进化分析 。进一步
研究也发现 ,叶绿体基因 atpA位于叶绿体基因组的
大单拷贝区 , 编码叶绿体 ATP合成酶 (ATPsyn-
thase)CF1-α亚基蛋白 ,在进化过程中有高度的保守
性 ,可提供足够的系统发育信息 ,在较高分类阶元的
比较序列研究中具有一定价值 [ 15 -16] 。
本研究克隆了早园竹叶绿体 atpA基因 ,并对其
序列进行了测定 。通过对早园竹和水稻等其他禾本
科植物叶绿体 atpA基因的核苷酸序列比对 ,发现早
园竹与水稻(indica、japonica)和野生稻之间仅有 1
个 SNP位点 ,与玉米 、高粱 、甘蔗和杂交甘蔗之间的
序列有 2个 SNP位点出现 ,而与小麦 、大麦 、匍茎剪
股颖和黑麦草之间的 SNP位点较多 ,说明竹类植物
与水稻在进化过程中比其他禾本科植物分化时间要
晚 。在前期的竹类系统进化关系研究中 ,基于叶绿
体基因 rps4和 rpl16的系统学研究结果也认为竹类
与禾本科植物的亲缘关系依次为水稻 、玉米和小
麦 [ 17-20] 。韩建国等对禾本科幼苗形态特征研究得
出 ,竹子与水稻进化前期有相同的进化路线 [ 21] 。王
世金等对禾本科花型的研究结果显示 ,水稻与竹亚
科的花型有许多相似部分;进一步对禾本科叶片结
构的比较解剖研究发现 ,水稻与竹亚科有较多相似
解剖特征[ 22] 。细胞学 、比较基因组学的研究也显
示 ,竹类植物有着与水稻一样的染色体基数 (X=
12),水稻作为禾本科植物的模式物种 ,与竹类植物基
因组存在明显共性。由此可见 ,基于叶绿体 atpA基
因片段的禾本科植物系统进化研究结果与形态学和
解剖学研究结果一致。这就从多层次和多角度证明
了竹类植物与水稻具有较近的亲缘关系 ,二者之间歧
化时间晚于禾本科其他植物。本研究结果对了解竹
类植物在禾本科中的分类学地位具有重要意义。
此外 , Dufour等[ 17]对甘蔗 、高粱 、玉米之间的亲
缘关系进行了研究 ,认为甘蔗与高粱的亲缘关系较
近。 Hulbert等 [ 23]对玉米 、高粱 、甘蔗的比较基因组
连锁图的研究认为 ,玉米 、高粱和甘蔗的基因组间具
有大量的共线性 ,并且高粱和甘蔗的基因组的组成
更为相似 。本研究结果所表明的甘蔗 、高粱 、玉米 、
小麦 、大麦 、匍茎剪股颖和黑麦草之间的亲缘关系 ,
与上述研究以及传统植物分类学标准所得出的结论
一致 [ 18] 。因此 ,依据叶绿体基因组相关基因序列 ,
研究禾本科植物大类间的系统进化关系 ,是高效而
可靠的手段之一。
[参　考　文　献 ]
[ 1] 　林新春 , 方伟.竹亚科分类学研究进展 [ J] .竹子研
究汇刊 , 2005, 24(1):1-6.
[ 2] 　耿伯介 , 王正平.中国植物志:第九卷 [ M] .北京:科
学出版社 , 1995:617
[ 3] 　赵奇僧 , 汤庚国.中国竹子分类的现状和问题 [ J] .
南京林业大学学报:自然科学版 , 1993, 17(4):1-8.
[ 4] 　GROSSERD, LIESEW.OntheanatomyofAsianbam-
booswithspecialreferencetotheirvascularbundles[ J] .
WoodScienceandTechnology, 1971, 5(4):290-312.
[ 5] 　CLARKLG, ZHANGWP, WENDELJF.Aphylogeny
ofthegrassfamily(poaceae)basedonndhFsequence
Data[ J] .SystematicBotany, 1995, 20(4):436-460.
[ 6] 　MATHEWSS, TSAIRC, KELLOGGEA.Phylogenetic
structureinthegrassfamily(Poasceae):evidencefrom
thenucleargenephytochromeB[ J] .AmericanJournalof
Botany, 2000, 87(1):96-107.
[ 7] 　PALMERJD.ChloroplastDNAevolutionandbiosyste-
maticusesofchloroplastDNAvariation[ J] .TheAmeri-
canNaturalist, 1987, 130:6-29.
[ 8] 　BADENESML, PARFITTDE.Phylogeneticrelation-
shipsofthecultivatedPrunusspeciesfromananalysisof
chloroplastDNAvariation[ J] .TheoreticalandApllied
Genetics.1995, 90:1035-1041.
[ 9] 　XUDH, ABEJ, KANAZAWAA, etal.Identification
ofsequencevariationsbyPCR-RFLPanditsapplication
totheevaluationofcpDNAdiversityinwildandcultivat-
edsoybeans[ J] .TheoreticalandApliedGenetics,
2001, 102:683-688.
[ 10] 　龚小松 , 曾富华 , 阎隆飞.一种纯化高等植物叶绿体
DNA的有效方法 [ J] .武汉植物研究 , 1994, 12(3):
277-280.
[ 11] 　PALMERJD, JANSENRK, MICHAELSHJ, etal.
35第 2期　　　　　　　　　　　　　　高家翔等:早园竹叶绿体 atpA基因序列及系统进化分析
ChloroplastDNAvariationandplantphylogeny[ J] .An-
nalsoftheMissouriBotanicalGarden, 1988, 75(4):
1180-1206.
[ 12] 　WOLFEKH, LIWH, SHARPPM.Ratesofnucleo-
tidesubstitutionvarygreatlyamongplantmitochondrial,
chloroplast, andnuclearDNAs[ J] .Proceedingsofthe
NationalAcademyofSciencesofUnitedStatesofAmeri-
ca, 1987, 84(24):9054-9058.
[ 13] 　SUGIURAM.Thechloroplstgenome[ J] .PlantMolec-
ularBiology, 1992, 19(1):149-168.
[ 14] 　OLMSTEADRG, PALMERJD.ChloroplastDNAsys-
tematics:Areviewofmethodsanddataanalysis[ J] .A-
mericanJournalofBotany, 1994, 81(9):1205-1224.
[ 15] 　STOEBEB, KOWALLIKKV.Gene-clusteranalysis
inchloroplastgenomics[ J] .TrendsinGenetics, 1999,
15(9):344-347.
[ 16] 　DRAPIERD, SUZUKIH, LEVYH, etal.Thechloro-
plastatpAgeneclusterinChlamydomonasreinhardti:
functionanalysisofpolycistronictranscriptionunit[ J] .
PlantPhysiol, 1998, 117:629-641.
[ 17] 　DUFOURP, DEUM, GRIVETL, etal.Constructionof
acompositesorghumgenomemapandcomparisonwith
sugarcane, arelatedcomplexpolyploidy[ J] .Theoretical
andAppliedGenetics, 1997, 94(3/4):409-418.
[ 18] 　颜济 , 杨俊良.小麦族生物系统学:第 2卷 [ M] .北
京:中国农业出版社 , 2004:121-205.
[ 19] 　NADOTS, BITTARG, CARTERL, etal.Aphyloge-
neticanalysisofmonocotyledonsbasedonthechloroplast
generps4, usingparsimonyandanewnumericalphanet-
icsmethod[ J] .MolecularPhylogeneticsandEvolution,
1995, 4(3):257-282.
[ 20] 　ZHANGW.Aphylogeneticanalysisofmonocotyledons
basedonthechloroplastgenerps4 [ J] .MolecularPhy-
logeneticsandEvolution, 2000, 15(1):135-146.
[ 21] 　韩建国 , 王培 , CLIFFORDHT.禾本科植物幼苗与进化
关系的研究 [ J] .植物研究, 1995, 15(4):465-470.
[ 22] 　王世金 , 李建华.中国主要禾本科植物花的基本类
型与系统分类 [ J] .植物分类学报 , 1989, 27(4):
247-256.
[ 23] 　HULBERTSH, RICHTERTE, AXTELLJD, etal.
Geneticmappingandcharacterizationofsorghumandre-
latedcropsbymeansofmaizeDNAprobes[ J] .Pro-
ceedingsoftheNationalAcademyofSciencesofUnited
StatesofAmerica, 1990, 87(11):4251-4255.
PhylogeneticAnalysisbasedonChloroplastatpAGene
SequencesfromPhylostachyspropinqua
GAOJia-xiang1, 2 , PANGTie-liang2, 3 , TANGZheng2 , ZHANGLan2, 3 , HECheng-zhong4 , YANGKai2
(1.FacultyofLandscapeArchitecture, SouthwestForestryUniversity, KunmingYunnan650224, China;
2.KeyLabofAppliedNewTechnologyinAgricultureofBeijingMunicipality, BeijingAgriculturalColege, Beijing102206, China;
3.ColegeofLifeSciences, HebeiAgricultureUniversity, BaodingHeibei071001, China;
4.FacultyofResources, SouthwestForestryUniversity, KunmingYunnan650224, China)
Abstract:Basedontheconstructionofchloroplastgenomiclibrary, theatpAgenewasclonedfromPhyl-
lostachyspropinquachloroplastgenome, andtheatpAgenesequenceswerecomparedbetweenP.propinquaand
other11gramineousplantspeciescolectedfromGenBank.Theresultsshowedthattherewere110 singlenucleo-
tidepolymorphisms(SNP)markersbetweenthe12 atpAgenesequences.AmongtheseSNPmarkers, therewas
onlyoneSNPmarkerblastedatpAgenesequenceofP.propinquawithatpAgenesequenceofOryzasativaIndica,
O.sativaJaponicaandO.nivara;thereweretwoSNPmarkersexistedinthesequencesofP.propinqua, Zea
mays, Sorghumbicolor, SaccharumoficinarumandS.hybridcultivar;however, thereweremoremarkersbetween
atpAgenesequenceofP.propinqua, Triticumaestivum, Hordeumvulgaresubsp.vulgare, Agrostisstoloniferaand
Loliumperenne.TheNeighbor-JoiningphylogenetictreesbasedontheatpAgenesequencesandcodingaminoacid
sequencesindicatedthatthe12 gramineousplantspeciescouldbedividedintotwomajorgroupsandfoursub-
groups, theP.propinquaandricewereclusteredtogether.ItcouldbeconcludedfromtheresultsthattheP.pro-
pinquahadthemostclosestphylogeneticrelationshipwithO.sativa, thecloserrelationshipwasforP.propinqua,
Z.mays, S.bicolor, S.oficinarumandS.hybridcultivar, butthephylogeneticrelationshipofP.propinquawith
wheatandrelativesofwheatwasfaraway.
Keywords:Phylostachyspropinqua;gramineousplants;atpAgene;sequencesanalysis;phylogeneticrela-
tionship
36 西　南　林　学　院　学　报　　　　　　　　　 　　　　　　　　　　第 29卷