全 文 ：第 27卷 第 2期 生物化学与生物物理学报
1 95 9年 3月 AC A T1 B 0C HI〕工 I C A e t B lt )p H Y SI C A SI NI O A
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海枣曲霉木聚糖酶的纯化及
末端序列研究 `
江 均 平 严 自 正 张 树 政
(中国科学院微生物研究所 , 北京 1 0 0 8 0)
摘 要
海枣曲霉鼓曲经水浸提 、 硫酸铁盐析 、 凝胶过滤 、 离子交换层析及 H P L O 分子排阻层析制
备了 P A G E . S D斗 P A G B 、 P A G E 酶谱及 H P L C 纯的木聚糖酶。
木聚糖酶经测定不含半胧氨酸及二硫桥结构 。 用蛋白质序列 自动分析仪测 定 了 瓦端 14
个氨基酸序列 ; 利用梭肤酶 A 方法测出了 C 端 6 个氨基酸序列 。 比较不同来源木聚糖酶末端
序列 , 发现海枣曲霉木聚糖酶与 6 种不同来源的木聚搪酶的 N 端序列有很大程度的同源 性 ,
并具有特定的通读结构… T hr 二心 1y’ 二 lG y’ 二 T尹… 。 其 C 端氨基酸序列也与两种酶有一定的
伺源性。
关键词 木聚糖酶 ; 糖普酶 ;末端序列测定 ;海枣曲霉
木聚糖酶 ( 1 , 4 一月一 x y l a n 二 y l a n o h y d r o l a o e , E O . 3 . 2 . 1 . 8 ) 以内切方式水解木 聚籍
汾子中 月一1 , 4一木糖昔键 , 其水解产物主要为木二糖与木二糖以上的寡聚木糖 , 也有少量
木糖和阿拉伯糖 。 该酶不仅对于降解自然界大量存在的木聚糖起着重要作用 ; 同时它亦
有着潜在的应用前景 , 如在造纸工业用它作为纸浆的漂 白剂山 , 故而引起人们的极大兴
趣 。 近来 , 已从细菌、 放线菌 、 酵母 和曲霉中分别提取了木聚糖酶 , 并发现这些来源不同的
木聚糖酶氨基酸序列有很大同源性 [“ 气
我们实验室曾对海枣曲霉 (A即盯 g乱乙二: 夕h 。成玩感南 ) 木聚糖酶的性质进行过研 究m ,
本文进一步报道此酶部分序列 以及探讨此酶与其它来源的木聚糖酶的同源性。
材 料 与 方 法
一 、 菌种
海枣曲霉 A S 3 . 3 143 为本所原纤维素酶组从海南土样中分离 , 菌种保藏室提供 , 本所
齐祖同教授鉴定并定名 。
二 、 主要化学试剂与仪器
落叶松木聚糖与 R e m a n z o l b ir l l a n七 b l u e R (R B B )为 S i gam 产品 。 D E A E 一S e p h护
本文 工9 9 3 年 u 月 19 日收到 , 修改稿 1 994 年 1 月 4 日收到。
. 中国科学院资助项目。
缩写 : D T N B : 5 , 卜D i t h i o b证 (2一 i t r o加 u 么0 10 ac id ) ; B B B : B6 幽那 0 1 b r i l li a n t bl ue R .
生物 化 学 与 生物物 理 学报 盯 卷
d ex A
一
50
、
Sep ho d ex G一 10 0 及 L MW Ki 七蛋 白质为 P ha rm a ei a产品。 H L PO柱 T SK
G0 20 SW 为 L KB 产品。 其它试剂为分析纯或优 质 纯 。 U V一扮0一 2分光光 度计 由
S hi m a d zu 生产。 230 H L PC由W时 e rs生产。 1 21 MB 氨基酸 自动分析仪系 B e e km a n产
品。 4 77 A蛋 白 /多肤序列仪系 AB 工产品。
三 、 方法
1
.木聚糖酶活 力测 定 同前文 m。
2
.蛋 白质浓度 测 2 80 nm处 的吸光度 , 按 E圣怎一 2 8 . 1 计算蛋白质浓度阴。
3
. 聚丙 烯酞胺凝胶垂直平板电泳 ( P A G E ) 按 D a v 加 法进行 , 凝胶浓度 10 多 , 电
极缓冲液为 p H 8 . 3 T ir s一且C l 缓冲液 。
4
.
S D S一 P A G E 按 L ae m m l 法进行 , 凝胶浓度 12 . 5多 , 电极缓冲液 p H S . o3
5
. 木聚糖踌 P A G E 酶谱 按文献 83[ 介绍的方法进行。 将 2石0 m g R B B一 木 聚 糖 ·
用 1 0 m l 蒸馏水加热溶解 , 然后同 20 m 1 3多 (评 /V ) 的热琼脂 糖 溶 液 (用 0 . 2 m ol / L 、
p H 5
.
0 乙酸缓冲液配制 )混匀 , 并铺成 0 . 7 m。 厚的 R B B 一木聚糖琼脂平板。 待木聚糖
酶 P A G E 结束后 , 将凝胶板紧贴于琼脂糖板上 , 于 40 ℃ 保温反应至对光观察出现透明带 1
为止 , 然后用 p H 5 . 4 、 0 . 0 5 m ol / L 缓冲液 : 9 5多 乙醇溶液 ( 1 : 2 , V / V )脱色。
6
. 自由疏基测 定 0 . 6 m l 蛋白质溶液加 0 . 石m 1 4多 S D S一 1血g / m l E D T A (N a办
榕液 (用 p且 8 . 0 、 0 . 1 m ol / L 磷酸 缓 冲 液 配 制 ) , 再加 句琳 D T N B 溶 液 ( 4 n l g / m l,.
p H 8
.
0
、
0
.
1 m ol / L 磷酸缓冲液配制 ) , 反应 1 5 分钟 , 测 4 12 n m 吸光度叻 。
7
. 二硫桥浏 定 取 O万m l 蛋白质溶液加到有刻度的试管中 , 再加 0 . 72 9 脉素 ,.
0
.
05 m l 0
.
1 m ol / L E D T A (N惋 )及 0 . 5 m 1 2 . 石多 新配制的 N a B H ` 溶液 , 用水定 溶 至
1
.
5 m l
, 然后加 1 滴正辛醇 , 在 40 ℃ 下变性及还原 5小时 , 取出通氮气 , 加入 0 . 2 5 lm l
m ol / L K H少o4 一 0 . 2 m ol / L H OI 溶液 , 并使溶液完全润湿试管壁 , 6 分钟后加 l m l 丙
酮 , 密封 , 将试管内的液体来回倒几次以便使残余的 N a B R ; 完全分解 。 通氮气 5 分钟 , 加.
0
.
25 m 1 0
·
C l m ol / L D T N B 水溶液 , 用水定容至 3 m l , 通氮气 2 分钟 , 密封 , 于 1 5 分钟 ·
后 测 412 n m 的吸光度1t 们 。
8
.
N 末端氛基酸序列浏 定 1 0 秘 g 木聚糖酶上 47 7 A 蛋 白 /多肤序列仪进 行 氨基 -
酸序列测定 。
9
.
C 末端 氛基酸序列测 定 3 . s m g 木聚糖酶溶于 4 0 0 灿1 蒸馏水 中 , 加 8肋 1 10 芳
S D S 溶液 , 10 o0 C 水浴 5 分钟 , 冷却后加 40 0 户1 p H 8 . 0、 0 . 1 m ol / L 磷酸氢二钠一柠檬酸
缓冲液 , 最后加 8 0 灿 1梭肤酶 A ( 1 坦g/ m l) , 3 0o C 下反应 , 间隔一定时间取出一定体积反
应液 , 加等体积 1 m ol / L 醋酸溶液中止反应 , 离心去沉淀 , 用氨基酸 自动分析仪测定上清
掖中氨基酸的含量 , 根据其出现先后和数量来推算氨基酸序列 。
10
. 半耽氛酸含黄 采用过 甲酸氧化法进行测定 1[ 1、
结 果
一 、 酶的提纯
1
. 粗酶的制备 麦鼓 , 按 1 : 1 . 5 加入自来水 , 装入三角瓶内 , 灭菌后接入培养好盼
匀 期 海枣曲霉木聚塘酶的纯化及末端序列研究
种曲 , 28 ℃ 培养 3 天 , 加入 3 倍于麦鼓重量 的蒸馏水 , 1 5o C 浸泡 4 小时 , 四层纱布过滤得
粗酶液 。
2
. 硫 酸按 分级盐析 粗酶液缓慢加入硫酸钱至 3 5界 饱和度 , 离心取上清液 , 并追
加硫酸钱至 7 6多饱和度 , 离心取沉淀并用少量蒸馏水溶解 , 然后冷冻干燥 , 置扩 C 冰箱中
保存 。
3
.
S e p h o d e x G 一1 0 0 柱层析 取适量上述冰冻干燥酶用适量蒸馏水溶解 , 然后进
行 S e P h a d e x G一 1 0 0 柱层析 ( 3 . 0 e m 丫 1 0 0 e m ) , 洗脱液为 P H 5 . 2 、 0 . 0 2 m o l / L 乙酸缓冲
液 , 流速为 30 m l/ h 。 分部收集 , 检 测酶活力并收集有酶活力的洗脱液 。
4
.
D E A E 一 eS p h ad ex A
一
50 柱层析 将上步酶液直接加到 已 用 0 . 0 2 m ol / L 、 p H
石 . 2 乙酸缓冲液平衡好的 D R A E 一 eS hP a de x A一 50 柱上 ( 2 . 6 o m 只 30 c m ) , 先用 3 0 0 m l 含
O
.
O2 5 m ol / L N
a 0 1 的同一缓冲液洗脱 , 然后用含 0 . O2 5 m ol / L一 3 m ol / L N a 0 1 的 乙酸缓冲液进行梯度洗脱 (各 60 0 m l) 分部收集 , 检测酶活力 , 共出现 4 个活力峰 (图 1) 。 收集
峰 3 并进行透析 、 冷冻干燥 。 置 o4 C 保存。
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H P L O 上述提纯的木聚糖酶再上 H P L C 分子排 阻柱 ( T S K G 20 0 SW ) , 用
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.
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、
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.
l m ol / L 乙酸缓冲液或 o . l m ol / L N a H CO 3 溶液进行洗脱 , 层析结果如图 2 。
分别收集峰 1、 2 、 3 并检测酶活力 , 峰 2 具有木聚糖酶活力 , 将峰 2 洗脱液透析冻干。
二 、 纯度鉴定
将上述经 H P L O 纯化的木聚糖酶进行 P A G E 、 S D S一P A G E 分析 , 结果均为一条蛋白
带 (图 3 ) 。 P A G E 酶谱分析也只有一条相应的酶带 (图 3 ) 。 H P L O 分子排阻层析检侧为
一个蛋白峰 (图 4 ) 。 说明此样品达到很高均一性 , 以下试验均用此纯化样品进行 。
三 、 结构测定
1
. 自由筑基 在 S D S 和 E D T A 存在下 , 用 D T N B 测定总自由琉基 , 结果无颜色
反应 , 表明木聚糖酶不含自由琉基 。
2
. 二硫桥 用 s m ol / L 脉素变性 , 再经 N a B瓦 还原 , 用 D T N B 测定琉基含量 , 结
果无颜色反应 , 表明木聚糖酶不含二硫桥 。

2期 海枣曲霉木聚 嗜酶的纯化及末端序列研究
人一 5 0柱层析及 HL PO分子排 阻层析可得到均一 的木聚糖酶 。 本方法比过去纯化方法〔刀少
了一步异 丙醇分级沉淀 , 多了一步 H P L O 分子排阻层析 , 因最后一步采用了 H P L O 分子
排阻层析 , 所得样品更适用于蛋白质分子结构测定。
本文研究的木聚糖酶不含半胧氨酸 , 据报道 A即 . 丽 g即 产的木聚糖酶也不含半胧氨
酸川〕或只含有痕量半胧氨酸〔13 , 来源于 B a赫 U锵 夕。耐乙肪 的木聚糖酶分子只含有一个半
肤氨酸闭 , 这说明它们的分子结构中都不存在二硫桥 。 相对而言 , 无二硫桥结构的蛋 白质
分子在变性剂存在下或受热时容易变性失活 。 前文发现木聚糖酶在 。 . 02 5 m m ol / L S D s
存在时活力下降 31 . 4 % , 当 S D S 浓度为 o . l m m ol / L 时 , 酶活力全部丧失闭 。 这可能是
由于木聚糖酶分子中缺乏二硫桥结构 , S D S 容易使之变性失活之故。
海枣 曲霉木聚糖酶与 6 种不同来源的木聚糖酶的 N 一端氨基酸序列有很大程度 的 同
源性 , 并发现这几种酶具有特定的通读结构 : … hT .r 二 G 1y’ 二 G 1y’ 二 T yr … (图 6 A ) ; 同样
C 一端氨基酸序列也和 2 种酶有一定程度的同源性 (图 6 B ) 。 这些酶分别来源于细菌 、 放线
菌 、 酵母 和霉菌 , 这说明不同来源的木聚糖酶可能有共 同起源 , 同时也说明结构与功能的
统一性 。
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参 考 文 献
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[ 2 〕 l e t h e r 。 , T . D . , Am i n o a c i d e o m p o s i t i o n a n d p a l t i a l eS q u e n c e o f x y l a n a s e f r o m A旷e o b哪记`毗 ·
B `o Ze e九劝10夕, L e艺艺。尹 , 1 9 8 8 , 1 0 (1 1 ) : 7 75 .
[ 3 〕 F u k u s a k i , E . , P a n b a n g er d , W . , S h i n m y o , A . e t a l . , T h e c o 二P l e ot n u C l e o t id e s e q u e n c e o f t h e x y l a ” a se
g e n e (
x y n A )
o f B ac 公乙l留 p哪翻韶 . F 丑 B S L e `一 , 1 9 5 4 , 1 7 1 : 1 9 7 .
[ 4 〕 T s u j i bo , H . , M i y a m o t o , K . , K u d a , T . e公` · , p u r i if c a t i o n , p r o卯 rt ie s , a n d p a rt i a l a m i n o a o i d eS q u e n c e s
o f t h e r m o o t a b le X y l
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16 4生 物 化 学 与 生物物 理 学报2 7卷
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刀夕夕乙么口d 口叹又刀几” 介。 几仍 e几名心 皿` e 俨。碗 0 10 9到, 1 9 9 1 , 57 ( 6) : 1 8 6 0 .
曾宇成 , 张树政 : 海枣曲霉木聚糖酶的提纯和性质。 徽 生物 学报 , 1 9 87 , 27 帕 : 34 30
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P u r if i e a t i o n a n d P a r t i a l A m i n o A e i d S e q u e n e e o f X y l a n a , e
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T h e e n z y m e w a s h o m o g e n o u s w h e n e x a m i n e d b y
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S D S一 P A G E , 且 P L O a s w e l l a s 么 y m o gr a m o n R B B 一 x y l a n .
N o o u l p h y d r y l g r o u p o a n d d i o u l p h i d e o b r i d g e w e r e d e七e e七e d w i七h D T N B . T h e
s e q u e n e e s o f 1 4 a m i n o a e id o a 七N 一七e r m i n u 3 几 n d 6 a m i n o a e id o a七 0 一七e r m i n u o w e r e
d e七e r班 i n e d . T il e a m i n o 一 t e r m i n a l s e q u e n e e 、 s h o w e d e x 七e n o i v e h o m o l o g y w i七h 七h e
旧e q u e n e e日 o f o七h e r 6 x y l a n a s e s a n d OP 日日e s 日e d a P r o p o s e d e o n 6 e n 日u s s t r u e七u r e : … T h r
… G l y … G l y … T尹… 。 T h e e a r b o x y l一 t o r而 n a l 日e妙 e n e e w a s a l o o r e l a 七e d 七。 毛h a 七 o f
o七h er , x y l a n a s e日 .
K E Y W O R D S
: 式 y l a n a o e , G l y e o s id a s e , T er m i n a l a面 n o ac id s叹 u e n o e ,
乙即。: g么不不二 s 夕人。 。二云元`