全 文 ：华北农学报·2011，26(6) :20 -26
收稿日期:2011 － 09 － 01
基金项目:国家牧草产业技术体系
作者简介:徐 博(1982 －) ，男，吉林人，在读博士，主要从事牧草分子生物学研究。
通讯作者:孙启忠(1959 －) ，男，内蒙古五原人，研究员，博士，博士生导师，主要从事草地生态与牧草生产技术研究。
朝鲜碱茅 Δ’-吡咯啉-5-羧酸合成酶(P5CS)
基因的克隆及表达分析
徐 博1，2，任 伟3，徐安凯3，王志锋3，孙启忠1
(1．中国农业科学院草原研究所，内蒙古呼和浩特 010010;2．中国农业科学院 研究生院，北京 100081;3．吉林省农业科学院，吉林公主岭 136100)
摘要:脯氨酸在提高植物抗逆性方面起着非常重要的作用。本研究以朝鲜碱茅茎叶组织提取的 RNA 为模板，根
据已报道的 P5CS基因同源序列设计引物，通过 RT-PCR法扩增出 1 个 P5CS的 cDNA序列，全长 2 158 bp，是一个完
整开放阅读框，编码含 716 个氨基酸的蛋白，Genebank登陆号为:HQ637435。与其他植物 P5CS 基因进行同源性比对
的结果显示，朝鲜碱茅 P5CS基因的核苷酸和氨基酸序列与小麦的同源性最高。并对其信号肽、疏水性、跨膜结构、二
级结构和主要功能域做了预测。半定量 RT-PCR结果表明，PuP5CS基因在朝鲜碱茅的根部和叶片均有表达，但是根
部的表达量较低，叶片中的表达量较高，在 4 种胁迫处理条件下，表达规律也不尽相同。
关键词:朝鲜碱茅;Δ-吡咯啉-5-羧酸合成酶;基因克隆
中图分类号:Q78 文献标识码:A 文章编号:1000 － 7091(2011)06 － 0020 － 07
Molecular Cloning and Expression Analysis of Delta 1-pyrroline-5-carboxylate
Synthetase(P5CS)Gene in Puccinellia chinampoensis
XU Bo1，2，REN Wei3，XU An-kai3，WANG Zhi-feng3，SUN Qi-zhong1
(1． Grassland Research Institute，Chinese Academy of Agriculture Science，Huhhot 010010，China;
2． Graduate School，Chinese Academy of Agriculture Science，Beijing 100081，China;3． Academy of
Agriculture Sciences of Jilin Province，Gongzhuling 136100，China)
Abstract:Delta 1-pyrroline-5-carboxylate synthetase(P5CS)plays a critical role in improving the stress toler-
ance of plants． In this study，the full length cDNA sequence of P5CS gene was cloned from Alkaligrass(Puccinellia
chinampoensis)leaves using RT-PCR method，the primers were designed according to the homologous P5CS gene se-
quences of other plant species． Sequence analysis showed that the nucleotide sequence of this gene is 2 158 bp，con-
taining a complete open reading frame and encoding 716 amino acids，Genebank:HQ637435． Nucleotide and amino
acid sequence analysis revealed that PuP5CS shares high identity with the orthologs from Triticum aestivum． And its
signal peptide，hydrophobicity /hydrophilic，trans-membrane domain，secondary structure and main functional do-
mains were predicted． Semi-quantitative RT-PCR analysis showed that PuP5CS expressed in different tissues，but
the expression in root was lower，and in leaf much higher． Various elevated levels of PuP5CS expression have been
detected when exposed to 4 different stress experimental treatment，and the results was not the same．
Key words:Puccinellia chinampoensis;P5CS;Gene clone
细菌、真菌和植物在遇到高盐、干旱和低温等外
界恶劣环境时，常通过积累体内脯氨酸来达到渗透
调节的作用［1］。脯氨酸作为一种细胞相容性的有
机小分子物质，具有调节细胞渗透势、稳定蛋白质、
膜系统和亚细胞结构以及清除活性氧的作用，是一
种重要的渗透调节保护剂［2］。已有研究表明，植物体
内脯氨酸的合成有两条途径，根据起始氨基酸分别命
名为谷氨酸(Glu)途径和鸟氨酸(Orn)途径。其中谷
氨酸途径在干旱胁迫和缺少氮素的情况下起主导作
用［3］，谷氨酸在 Δ-吡咯啉-5-羧酸合成酶(Delta 1-
6 期 徐 博等:朝鲜碱茅 Δ-吡咯啉-5-羧酸合成酶 (P5CS)基因的克隆及表达分析 21
pyrroline-5-carboxylate synthetase，P5CS)的作用下发
生磷酸化和谷氨酸-γ-半醛还原形成吡咯琳-5-羧酸
(P5C) ，P5C再在 Δ-吡咯琳-5-羧酸还原酶(P5CR)催
化下生成脯氨酸［4］。可以看出，P5CS 具有谷氨酸激
酶(γ-GK)和谷氨酰-γ-半醛脱氨酶(GSADH)的活性，
是一个双功能酶，催化脯氨酸合成过程中的前 2 步反
应［5］，是脯氨酸合成途径的限速酶。
研究发现，在水分胁迫下，拟南芥体内的脯氨酸
含量与 P5CS基因的 mRNA 表达水平成正相关，而
与 P5CR基因的 mRNA 表达水平没有明显的相关
性，无论是干旱、盐胁迫或是 ABA，都不能明显提高
P5CR的表达水平［6］。转入 P5CR 基因的烟草的脯
氨酸含量增长不明显，而转 P5CS 基因的烟草的脯
氨酸水平却显著提高［7］。此外，在转基因水稻(Ory-
za sativa)［8］、马铃薯(Solanum tuberosum)［9］、黑麦草
(Lolium perenne)［10］、冰草(Agropyron cristatum)［11］
和菜豆(Phaseolus vulgaris)［12］等植物的研究中发
现，单独转化 P5CS 基因就可以提高植株脯氨酸的
含量，起到抗旱、耐盐的作用。因此 P5CS 是植物通
过谷氨酸途径合成脯氨酸的关键酶。
目前，P5CS 基因已经在豇豆(Vigna unguicula-
ta)［5］、大豆(Glycine max)［13］、拟南芥(Arabidopsis
thaliana)［14］、蒺 藜 苜 蓿 (Medicago truncatula
Gaertn)［15］、紫花苜蓿(Medicago sativa)［16］、水稻
(Oryza sativa)［17］ 和 小 叶 杨 (Populus simonii
Carr)［18］等植物中陆续被克隆，但是有关碱茅 P5CS
基因的研究尚未报道，而碱茅作为盐碱地的先锋植
物，是一种宝贵的盐生植物种质资源［19］。因此，本
研究利用 RT-PCR 的方法在朝鲜碱茅(Puccinellia
chinampoensis)中分离到一个 P5CS 的同源新基因，
命名为:PuP5CS，对其序列进行相关生物信息学分
析，并研究了其在不同人工胁迫条件下的表达情况，
为进一步研究脯氨酸在碱茅中的抗寒、耐盐碱作用
机制奠定基础。
1 材料和方法
1． 1 材料
植物材料为朝鲜碱茅，由吉林省农业科学院草
地所提供。将种子用 15%的次氯酸钠溶液消毒 15
min，无菌水清洗 5 次，置于洁净的培养皿中，暗培养
直至种子萌发。然后将幼苗移栽至培养基质中(黑
土∶ 蛭石 ∶ 珍珠岩 = 3 ∶ 1 ∶ 1) ，每盆 12 株，于 20℃ /
15℃ (昼 /夜)温室中正常生长，大约 14 d 后，待其
长出五叶一心时，处理备用。为了研究 PuP5CS 基
因的表达情况，本试验设计了以下 4 种不同的胁迫
处理:盐胁迫 (1． 5% NaCl)、碱胁迫 (1． 5%
Na2CO3)、干旱胁迫(20% PEG)和盐碱复合胁迫
(1． 5% NaCl + 1． 5% Na2CO3)。分别于处理的 0，
3，6，12，24，48 h 剪取碱茅叶片和须根，液氮速冻
(－ 70℃)保存。
TRNzol试剂为北京天根公司提供，PMD18-T 载
体、Taq酶产品由 TakaRa公司提供，反转录酶、琼脂
糖凝胶回收试剂盒由MBI Fermentas公司提供，大肠
杆菌 DH5α 为本实验室保存，其余为国产分析纯
试剂。
1． 2 总 RNA的提取
取不同处理的朝鲜碱茅叶片，参照北京天根公
司的 TRNzol试剂说明书逐步提取总 RNA，质量和
浓度的确定采用 1． 0%甲醛变性凝胶电泳检测。
1． 3 RT-PCR
以提取的总 RNA为模板，经反转录合成 cDNA
第一链。根据已发表的 P5CS 基因序列设计一对全
长引物 P1(5-GCGGCCATGGCCACCGCGGACC-3)
和 P2(5-CTCATTGCAAAGGAAGGTTCTTATG-3) ，
由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。以反
转录产物 cDNA 作为 DNA 模板，在 25 L 体系中加
入下列成分:DNA template 1 μL，P1 1 μL，P2 1 μL，
ddH2O 10 μL，PCR-Mix 12 μL。扩增条件为:94℃预
变性 1 min，94℃变性 30 s，55℃退火 30 s，72℃延伸
2 min，32 个循环。
1． 4 P5CS基因的克隆及测序
将 RT-PCR产物在 1%琼脂糖凝胶上电泳，并用
试剂盒回收目的片段。取回收产物与 pMD18-T Vec-
tor连接过夜。转化感受态大肠杆菌 DH5α，筛选阳性
克隆。将阳性重组子培养后快速提取质粒并鉴定。
然后将样品送上海生工生物工程有限公司测序。
1． 5 序列分析
PuP5CS基因生物信息学分析采用下列方法:
①核苷酸序列同源性比对由 NCBI的 BLAST程序进
行。②氨基酸的多重序列比较，等电点，分子量的预
测以及进化树的构建由 DNAMAN 软件完成。③蛋
白质疏水性、跨膜结构、二级结构分别由 Protscale，
TMHMM和 HNN软件来预测，使用信号肽预测工具
SignalP分析信号肽。④蛋白质保守结构域(Do-
mains)由 Smart程序来推测。
1． 6 朝鲜碱茅 PuP5CS 基因在不同胁迫处理下的
组织表达分析
用上述方法提取不同处理条件下朝鲜碱茅叶片
或根部总 RNA，反转录合成 cDNA。根据测序后的
全长序列设计 5端引物(5-GCAACGACTAAGAT-
22 华 北 农 学 报 26 卷
TCCTGTTCTT-3)和 3端引物(5-CTCATTGCAAAG-
GAAGGTTCTTATG-3) ，以 Actin 基因为内标(Gene-
bank登录号:FJ545641) ，采用半定量 RT-PCR 的方
法分析 PuP5CS 基因的表达情况，反应条件为退火
温度 56℃，24 个循环，反应产物用 1%琼脂糖凝胶
电泳进行分析。
2 结果与分析
2． 1 朝鲜碱茅 PuP5CS基因的克隆与分析
用设计的全长引物对朝鲜碱茅 cDNA 进行扩
增，获得了 2 100 bp 左右的条带(图 1)。将此条带
进行回收，连接转化，筛选阳性克隆，挑取阳性克隆
摇菌提取质粒，经 PCR鉴定，电泳后也得到约 2 100
bp的条带(图 2) ，并且与 cDNA的 PCR扩增产物电
泳位置相同。对测序结果进行分析表明，获得的
PuP5CS基因全长 2 158 bp，包括起始密码子(ATG)
和终止密码子(TAG) ，是一个完整的开放阅读框，
编码 716 个氨基酸，推测其蛋白质分子量为:77． 68
kDa，等电点:6． 10，并登陆 Genebank:HQ637435。
将其核酸序列用 NCBI 的 BLAST 程序检索比对发
现，与其他植物的 P5CS基因有着较高的同源性:小
麦(Triticum aestivum)92%，水稻(Oryza sativa Japon-
ica)86%，甘蔗(Saccharum)85%，玉米(Zea mays)
84%，大麦(Hordeum vulgare)78%，猕猴桃(Actinidia
chinensis)74%，赖草(Leymus secalinus，部分)92%，
珍珠粟(Pennisetum glaucum，部分)84%，獐茅(Aelu-
ropus sinensis，部分)85%。测序结果和核苷酸序列
的同源性对比验证了该基因的准确性。
M． Marker，从上至下:15，10，5，2． 5，1 kb。
M． Marker，from up to down:15，10，5，2． 5，1 kb．
图 1 RT-PCR电泳
Fig． 1 The electrophoresis of RT-PCR
2． 2 信号肽的预测与分析
神经网络算法的预测结果表明(图 3) ，PuP5CS
编码蛋白的原始剪切位点分值(C 值)、信号肽分值
(S值)和综合剪切位点分值(Y 值)均比较低，无氨
基酸残基位点，因此，它可能不存在导肽酶切位点，
没有信号肽，是一个非分泌蛋白。
2． 3 疏水性的预测与分析
蛋白质疏水性分析对于研究其跨膜特征和二级
结构有着重要的指导意义，通常认为，氨基酸分值越
低亲水性越强和分值越高疏水性越强。如图 4 所
示，PuP5CS 编码氨基酸序列的第 408 位氨基酸分
值最高，为 2． 789，疏水性最强，第 70 位氨基酸分值
最低，为 － 2． 589，亲水性最强，而就整体分析而言，
亲水性氨基酸均匀分布在整个多肽链中，没有明显
的疏水性区域，因此，推测 PuP5CS 编码蛋白是一个
亲水性蛋白。
－ ．负对照。
－ ． Negative control．
图 2 阳性克隆 PCR鉴定
Fig． 2 The PCR of positive cloning
C score．原始剪切位点的分值;S score．信号肽的分值;
Y score．综合剪切位点的分值。
C score． Score of cleavage site;S score． Score of signal peptide;
Y score． Score of comprehensive cleavage sites．
图 3 PuP5CS编码蛋白信号肽分析
Fig． 3 Analysis on the signal peptide encoded by PuP5CS
图 4 PuP5CS编码蛋白的疏水性 /亲水性预测
Fig． 4 Predicted hydrophobicity /hydrophilic for PuP5CS
2． 4 跨膜结构域的预测
TMHMM的预测结果表明(图 5) ，朝鲜碱茅
P5CS蛋白的整条肽链位于细胞膜外面，不具有跨膜
结构域，与疏水性分析结果相一致，与水稻［17］和黑
麦草［7］P5CS蛋白的分析结果相类似。
6 期 徐 博等:朝鲜碱茅 Δ-吡咯啉-5-羧酸合成酶 (P5CS)基因的克隆及表达分析 23
图 5 PuP5CS编码蛋白跨膜结构域的预测结果
Fig． 5 Trans-membrane domain prediction result of PuP5CS
h． α-螺旋;e．延伸;c．随机卷曲。
h． Alpha helix;e． Extended;c． Random coil．
图 6 PuP5CS二级结构预测结果
Fig． 6 Secondary structure prediction
result of PuP5CS
Ⅰ． ATP结合位点;Ⅱ．假想的亮氨酸保守域;Ⅲ．谷氨酸激酶保守域;Ⅳ． NADPH结合保守域;Ⅴ．谷氨酸半醛脱氢酶保守域; ．苯丙氨酸位点。
Ⅰ． ATP binding site;Ⅱ． Conserved Leu zipper;Ⅲ． Glu-5-kinase domain;Ⅳ． NADPH bingding domain;
Ⅴ． GSA-DH domain; ． Indicate Phenylalanine．
图 7 PuP5CS氨基酸序列与其他植物同源序列的比对
Fig． 7 Comparison of the amino acid sequences about PuP5CS with other plants
24 华 北 农 学 报 26 卷
2． 5 二级结构的预测分析
蛋白质二级结构是构成三级结构的基础，对了
解其空间结构和功能有着重要意义。预测结果表明
(图 6) ，PuP5CS编码蛋白的肽链有 301 个氨基酸参
与了 α-螺旋结构，占到了 42． 04%;有 290 个氨基酸
构成了随机卷曲，占到了 40． 50%;有 125 个氨基酸
参与了延伸链结构，占到了 17． 46%;其中 α-螺旋结
构和随机卷曲占据了大多数。
2． 6 保守结构域的预测与对比
朝鲜碱茅 PuP5CS的高度保守区域与其他高等
植物是一致的，包括 5 个主要功能域:谷氨酰激酶
(GK)结构域，谷氨酸半醛(GSA)结构域，亮氨酸结
构域，ATP 和 NADPH 结合位点，说明 PuP5CS 基因
在朝鲜碱茅脯氨酸合成中起重要作用。除谷氨酰激
酶(GK)结构域外，其他 4 个功能域的差异都较小，
说明 P5CS蛋白质的主要功能域相对保守。已有的
研究表明，豇豆 VaP5CS 氨基酸序列的 129 位点［5］
和黑麦草 LpP5CS氨基酸序列的 128 位点［7］均存在
脯氨酸的保守反馈抑制位点 －苯丙氨酸(Phenylala-
nine，F) ，该位点的突变能使脯氨酸合成酶的反馈抑
制作用丧失［20］。本研究中朝鲜碱茅 PuP5CS 氨基
酸序列的 130 位点也发现苯丙氨酸，说明其活性可
能被高浓度脯氨酸所抑制(图 7)。
2． 7 氨基酸同源性分析与系统进化树的构建
利用 DNAman 序列分析软件对朝鲜碱茅
PuP5CS蛋白氨基酸序列和其他 6 种植物进行对比
(图 7) ，发现它们之间的相似性很高，依次为:小麦
(AY888045)94%，水 稻 (D49714)87%，甘 蔗
(EU113257)86%，玉米(BT083588)86%，猕猴桃
(U92286)76%，大麦(AK251855)73%，与核苷酸的
同源性分析结果基本一致。表明朝鲜碱茅与同属的
禾本科植物有着很高的氨基酸序列同源性，但是在
长期的进化过程中，由于生长方式和环境的不同，造
成不同物种又具有自身的特异性。其中禾本科大麦
的 P5CS 氨基酸序列有些特殊，N 端比其他植物多
出 13 个氨基酸。
从构建的 P5CS 氨基酸序列系统发育树状图
(图 8)可以看出:以 0． 020 为结点，可以分为 4 组，
第 1 组为:苜蓿、蓖麻、四季豆和杨树;第 2 组为:拟
南芥和芸薹属;第 3 组为:甘蔗、玉米、水稻、小麦和
朝鲜碱茅;第 4 组是大麦。其中朝鲜碱茅和小麦的
同源关系最近，大麦和其他植物 P5CS 氨基酸序列
的同源关系比较远，这与前面核苷酸序列的同源性
分析结果相一致。
图 8 进化树分析
Fig． 8 Analysis of homology-tree
2． 8 不同胁迫处理下 PuP5CS 基因在朝鲜碱茅叶
和根中的表达
半定量 RT-PCR结果表明，PuP5CS基因在朝鲜
碱茅的根部和叶片均有表达，但是根部的表达量较
低，叶片中的表达量较高。在根部，PuP5CS 基因受
盐胁迫、碱胁迫和盐碱复合胁迫诱导的表达量比受
干旱胁迫诱导的表达量要高，在叶片中，4 种胁迫处
理均可以诱导 PuP5CS 基因显著表达，但变化规律
不同。如图 9 所示，在盐胁迫或碱胁迫的处理条件
下，PuP5CS基因在朝鲜碱茅叶片中的表达量，于处
理 48 h最高，处理 12 h 最低，随着处理时间的逐渐
延长，总体呈现出先增加后降低，然后又升高的变化
态势。在盐碱复合胁迫的处理条件下，PuP5CS 基
因在朝鲜碱茅叶片中的表达量随着时间的延长逐渐
增加。在干旱胁迫处理的条件下，PuP5CS 基因在
朝鲜碱茅叶片中的表达量，于处理 12 h和 48 h有突
然降低的现象。总的来看，朝鲜碱茅 PuP5CS 基因
受盐、碱、干旱的诱导而显著表达，但叶片中的表达
量在 4 种胁迫处理后的 12 h均比较低。
6 期 徐 博等:朝鲜碱茅 Δ-吡咯啉-5-羧酸合成酶 (P5CS)基因的克隆及表达分析 25
A． 1． 5% NaCl;B． 1． 5% Na2CO3;C． 1． 5% NaCl + 1． 5% Na2CO3;D． 20% PEG;Actin．内参。
图 9 朝鲜碱茅 PuP5CS基因在叶和根中的表达
Fig． 9 Analysis of PuP5CS gene expression in leaf and root of Puccinellia chinampoensis
3 讨论
土壤干旱、盐渍化是影响我国粮食生产的重要
因素。随着分子生物学技术的飞速发展，植物基因
工程研究已取得很多进展［21］。通过分离克隆植物
抗旱、耐盐碱的相关功能基因，研究其相关因子的信
号转导途径，并采用转基因技术培育抗旱、耐盐碱的
农作物新品种已成为解决我国干旱、半干旱地区土
壤盐渍化的有效手段之一。盐生植物碱茅之所以能
在长期干旱和盐渍的环境中正常生长，是多种抗逆
机制综合作用的结果，大量研究表明，碱茅在盐渍环
境下，除了钠离子和钾离子的相互平衡作用
外［22，23］，体内脯氨酸的积累也起着非常重要的作
用［24，25］。因此本研究分离克隆了朝鲜碱茅 PuP5CS
基因。
研究发现它与其他高等植物 P5CS 基因的核苷
酸序列以及氨基酸序列有很高的同源性，对小麦、水
稻、甘蔗、玉米、猕猴桃、大麦和朝鲜碱茅 7 种植物
P5CS基因的 5 个主要功能域进一步比对发现也存
在很高的一致性，表明 P5CS 基因在进化上存在高
度保守性。这也是本研究能够利用同源克隆法将碱
茅 PuP5CS 基因成功分离的理论基础。同时也发现
大麦 P5CS基因的核苷酸序列和氨基酸序列与其他
禾本科植物同源序列的 N 端差异较大，表明不同物
种在长期的进化过程中，可能会在主要功能域以外
的位置发生些许变异。分子系统树的分析结果与传
统形态学的分类结果基本吻合，表明根据 P5CS 基
因信息构建的分子系统树基本上可以反映这一组物
种的亲缘关系规律。
前人对脯氨酸提高碱茅抗逆性的生理机制进行
了研究，本试验利用生物信息学的手段，对 PuP5CS
编码蛋白的信号肽、疏水性、跨膜结构和二级结构逐
一进行了分析，为更好地研究 PuP5CS 蛋白的高级
结构与功能奠定了基础，也为深入研究脯氨酸提高
朝鲜碱茅抗逆性的分子机制提供了理论依据。半定
量 RT-PCR的研究结果表明，PuP5CS基因在朝鲜碱
茅地上部分起的抗逆作用更显著。通常认为脯氨酸
在增强植物的抗寒性、抗旱性和抗盐碱性方面均有
重要的渗透调节作用，对于朝鲜碱茅而言，PuP5CS
基因在增强其抗盐碱性方面更为突出，因为试验结
果表明在不同胁迫处理后的 48 h，干旱诱导的表达
量非常少，而盐碱诱导的表达量呈增强态势。在 4
种胁迫处理 12 h 后，PuP5CS 基因的表达量由降低
转为增加，可能是随着时间的延长，引起了朝鲜碱茅
地上部其他信号转导因子的参与，激活了 PuP5CS
基因的再次表达，有待于做进一步的研究。
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