全 文 ：第 9卷第 12期 南阳师范学院学报 Vol.9 No.12
2010年 12月 JournalofNanyangNormalUniversity Dec.2010
收稿日期:2010-10-15
作者简介:卢维宏(1984-),山西运城人 ,硕士研究生,主要从事植物真菌病害防治方面的研究.
来自南阳玉米穗腐病样品的玉蜀黍
赤霉菌的分离及其特性鉴定
卢维宏1, 2 ,黄思良 2 ,陶爱丽1 , 2 ,黎起秦 1 ,王要芳 3
(1.广西大学 农学院 , 广西 南宁 530005;2.南阳师范学院 生命科学与技术学院 ,河南 南阳 473061;
3.广西师范大学 生命科学学院 , 广西 桂林 541004)
　　摘　要:2009年在河南省西峡县 、唐河县采集得到玉米穗腐病样品 , 样品经病原分离和单孢子纯化后 , 得到 3个菌株
Gz1、Gz2与 Gz3(GenBank登记号分别为:HM769949、HM769950与HQ110051).在致病性测定的基础上进行了 rDNA-ITS序
列分析 , 其结果表明 3个菌株均与玉蜀黍赤霉菌(Gibberelazeae)有 99%的同源性 , 用软件 MEGAversion4.0构建基于
rDNA-ITS序列系统发育树 , 3个菌株均与玉蜀黍赤霉菌在 100% boostrap水平相聚于同一群;菌株 Gz1、Gz2与 Gz3的菌落
形态和分生孢子特征均与文献描述的玉蜀黍赤霉菌相符.为此实验选取了 Gz1作为代表性菌株对玉蜀黍赤霉菌的部分生
物学特性做了研究.
关键词:玉米;玉蜀黍赤霉菌;致病性;形态特性;ITS序列
中图分类号:S432.9+8　　　文献标识码:A　　　文章编号:1671-6132(2010)12-0045-05
　　玉米是世界上重要的粮食 、饲料及工业原料.
2009年我国玉米播种面积为 3071.67万 hm2 ,产量
为 1595.5亿 kg.随着食品工业和饲料产业的发
展 ,玉米在粮食作物中的地位日益上升 ,玉米加工
业被称为 “黄金产业 ”[ 1] .镰刀菌是引起玉米茎腐
病和穗腐病的主要病原菌之一 ,其不仅影响玉米的
产量 ,同时也严重危害玉米的品质 ,尤其是病原菌
产生的毒素还影响到玉米作为食品原料的安全性.
近年来镰刀菌引起的玉米穗腐病在我国逐年加重 ,
其中优势种为串珠镰刀菌(Fusariumverticilioide),
次优势种为禾谷镰刀菌 (Fusarium graminea-
rum)[ 2-3] .作者从河南省南阳市采集的玉米病穗
样品中 ,分离获得了玉蜀黍赤霉菌 (Gibberelaze-
ae),并对该病原菌及其生物学特性进行了鉴定 ,以
期为当地玉米病害防控提供依据.
1　材料和方法
1.1　供试菌株的分离与纯化及致病性测定
1.1.1　供试菌株的分离与纯化
2009年 9月在西峡县 、唐河县发现镰刀菌引
起的玉米穗腐病 ,首先对采集的病穗症状进行描
述 ,然后取病部籽粒 ,用 75%酒精处理 10 s,用质
量浓度为 1 g/L汞表面消毒 5 min,无菌水冲洗 3
次 ,置于马铃薯葡萄糖琼脂(PDA)平板上 28 ℃下
培养 3 d,挑取菌落边缘菌丝体 ,转接于 PDA斜面
上保存.分离物经单孢分离纯化 [ 4]后获得单孢菌
株 Gz1、Gz2、Gz3作为本实验的供试菌 (其中 Gz1
与 Gz2取自西峡县二郎坪村;Gz3取自唐河县油
田).
1.1.2　致病性测定
依据 Koch法则 [ 5] ,将单孢菌株 Gz1、Gz2、Gz3
在 PDA平板 28℃培养 3d,用直径 5mm的打孔器
切取菌落边缘菌饼 ,分别刺伤接种到 3 ～ 4叶期的
玉米苗的叶片和成株期的玉米果穗上 , 25 ℃ ～
28℃下套袋保湿培养 , 3 d后观察发病情况 ,描述
症状.分别以接纯 PDA的玉米苗和玉米果穗作对
照.每处理设 3个重复.对接种发病的叶片和果穗 ,
取病健交界组织 ,用 75%酒精处理 10 s,用质量浓
度为 1 g/L汞表面消毒 3 min,无菌水冲洗 3次后
置于 PDA平板上 28 ℃下培养 3 d,镜检再分离物
与原接种体菌株的形态特征.
1.2　病原菌的鉴定
1.2.1　形态学鉴定
主要以病原菌的形态特征 、危害症状为依据.
以水作为浮载剂制作临时玻片在显微镜下观察 、拍
照病原菌分生孢子的形态 ,测量其大小 ,并与相关
文献 [ 6]进行比对.
1.2.2　分子鉴定
将 3株供试菌在适温下活化后分别转接至装
有马铃薯葡萄糖液体培养基(PDB)的锥形瓶中 ,在
28℃180 r/min摇床培养 2 ～ 3 d,用灭菌漏斗(内
垫 3层灭菌擦镜纸)进行过滤 ,灭菌水冲洗菌丝体
南阳师范学院学报　 第 9卷　
至滤出液澄清后 ,用牙签挑少量菌丝体于灭菌的研
钵中 ,加入适量液氮 ,迅速将其研磨成粉末 ,转移适
量粉末于 1.5 mLEP管中 ,加入 700 μL的裂解液
(NaCl2.92g、EDTA0.78 g、Tris0.3g、PVP0.5 g、
SDS1 g、重蒸水 50 mL), 65 ℃水浴 1 h后 ,离心
(12000 r/min, 4℃)10 min,取上清 ,加入等体积的
苯酚∶氯仿∶异戊醇 =25∶24∶1(v/v)的混合有机溶
剂 ,离心(12000 r/min, 4 ℃)10 min,取上清 ,用同
样的混合有机溶剂再重复抽提 2次后加入 2倍体
积的预冷无水乙醇和 1 /10体积的醋酸钠(NaAc),
-20 ℃沉淀过夜 , 离心 (12000 r/min, 4 ℃)10
min,弃上清 ,用 75%乙醇清洗沉淀 3次 ,晾干后加
入 25μL的重蒸水溶解沉淀 ,置于 -20 ℃冰箱备
用.用一对真菌 rDNA-ITS(internaltranscribed
spacer)通用引物 ITS1(5′-TCCGTAGGTGAACCT
GCGG-3′)和 ITS4 (5′-TCCTCCGCTTATTGATAT-
GC-3′)扩增供试菌株的 rDNA-ITS片段.PCR产物
送至大连宝生物有限公司 (TaKaRaBiotechnology
(Dalian)Co., Ltd.)进行纯化和测序后 , 用 ht-
tp://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi的 BLAST
程序进行同源性比较 , 并用软件 MEGAversion
4.0[ 7]构建基于 rDNA-ITS序列的系统发育树.
1.3　生物学特性
1.3.1　温度对病原菌营养生长的影响
将病原菌株 Gz1在 PDA平板上 28℃下培养3d,
用灭菌的内径 5mm的打孔器切取菌落边缘菌饼 ,转
接至新的 PDA培养基平板中央 ,将 PDA平板分别置
于 7℃、10℃、13℃、16℃、19℃、22℃、25℃、28℃、
31℃、34℃、37℃、40℃、43℃下恒温培养 ,第 3天测
量菌落直径.每处理设 3个重复[ 8] .
1.3.2　pH值对病原菌营养生长的影响
按 1.3.1的方法将病原菌株 Gz1接种于 pH
4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0
的内装 100mLPDB培养基的锥形瓶中 ,在 28 ℃
下静置培养 5d,用已知重量的 3层滤纸过滤 ,标记
后于 80 ℃下烘干 12 h,称重 ,得菌丝体干重 [ 8] .每
处理设 3个重复.
1.3.3　病原菌对碳 、氮源的利用
碳 、氮源基本培养基配方:K2HPO4 1 g、KCl
0.5g、MgSO4· 7H2O0.5 g、FeSO4 0.01 g、琼脂粉
17 g、水 1000mL.测试不同碳源对菌株 Gz1生长影
响时 , 1000 mL基础培养基中加入 2 gKNO3作为
氮源 ,再分别加入不同的碳源 30 g;测试不同氮源
时 , 1000mL基础培养基中加入 20g葡糖糖作为碳
源 ,然后分别加入不同氮源 2g[ 9] .将供试菌在适温
下活化 3 d后 ,用内径 5 mm的打孔器切取菌落边
缘菌饼 ,接种于培养基平板中央 ,在 28℃中恒温培
养 5d,观察菌落形态并测量菌落直径.每处理设 3
个重复.
2　结果
2.1　田间及人工接种症状
该病害主要从玉米穗梢部开始发生 ,导致玉米
籽粒干瘪 ,条件适宜时籽粒上有白色霉层(病原菌
的菌丝体),该病害也可通过果穗中玉米螟钻孔处
进行侵染 ,被侵染的籽粒变为褐色 ,病斑处有红色
斑点(图 1A和 1B).通过微伤口进行人工接种 , 25
～ 28 ℃保湿培养 3d后接菌处出现水渍状椭圆形
的病斑 ,上有稀疏的白色菌丝体 ,后期病斑变为红
褐色(图 1D和 1F),对照组不发病(图 1C和 1E).
图 1　Gibberelazeae引起的玉米穗腐及其接种症状
A和 B.自然发病玉米果穗;C.果穗接 PDA空白对照;D.果穗接
种菌株 Gz1的发病症状;E.叶片接 PDA空白对照;F.叶片接种菌
株Gz1的发病症状.
2.2　致病性测定
对接种发病的果穗及叶片进行病原菌再分离 ,
再分离菌株在 28℃培养 3 d时的菌落形态与原接
种体一致 ,经测量其孢子形态及大小也与原接种体
一致 ,验证了柯赫氏法则 ,说明菌株 Gz1、Gz2与
Gz3均为玉米的致病菌.
2.3　病原菌的形态
将供试菌株在 PDA培养基上 28℃下培养 3 d,
菌落圆形 ,菌丝体毛絮状 ,生长旺盛 ,后期中央菌丝
体由白色转为洋葱红色或者鲜红色(图 2A).大型分
生孢子呈镰刀形或者纺锤形 ,具 3 ～ 5个隔膜 ,极个
别 1个隔膜(图 2B),随机测量 100个大型分生孢子
大小为:(19.7 ～ 50.3)μm×(2.8 ～ 5.4)μm(平均
32.9 μm×3.9μm);小型分生孢子极少见.供试菌
的形态与玉蜀黍赤霉菌 Gibberelazeae[ 6]相符.
·46·
　第 12期 卢维宏等:来自南阳玉米穗腐病样品的玉蜀黍赤霉菌的分离及其特性鉴定
图 2　玉蜀黍赤霉菌 Gibberelazeae菌株 Gz1的形态
A.菌落;B.大型分生孢子
2.4　分子鉴定
利用 rDNA-ITS序列的通用引物 ITS1和 ITS4
对 3个菌株(Gz1、Gz2、Gz3)的 DNA进行 PCR扩增
后 ,经 1%琼脂糖凝胶电泳结果显示扩增产物大小
约 500bp的片段(图 3).经测序后发现 ,所获得的
菌株 Gz1、Gz2与 Gz3的 ITS片段分别为 508 bp、
504 bp与 506 bp(GenBank登记号 分别为:
HM769949、HM769950与 HQ110051).
图 3　供试病原菌株的 rDNA-ITS的 PCR产物
1.菌株 Gz1;2.菌株Gz2;3.菌株 Gz3;M.DNAmarker(DL2000)
　　测序后的 rDNA-ITS序列用 htp://blast.nc-
bi.nlm.nih.gov/Blast.cgi的 BLAST程序进行同源
性比较发现 , 3株病原菌与 GenBank中的玉蜀黍赤
霉菌 Gibberelazeae有 99%的最大同源性.以细交
链孢菌(Alternariaalternana)为外群菌 , 21株 12种
镰刀菌的 rDNA-ITS序列为参比序列 , 用软件
MEGAversion4.0构建基于 rDNA-ITS序列的系统
发育树显示 , 3个供试菌株(Gz1、Gz2和 Gz3)均与
Gibberelazeae在 100% bootstrap水平相聚于同一
群(图 4),表明从南阳市西峡县及唐河县采集的玉
米穗腐病样品中分离获得的 3株镰刀菌均属玉蜀
黍赤霉菌.
2.5　病原菌生物学特性
2.5.1　温度对病原菌营养生长的影响
选取供试菌株 Gz1测定温度对其营养生长的
影响(图 5).该菌的生长温度范围为 7 ℃ ～ 40 ℃,
适温为 22℃ ～ 31℃,最适温度为 25 ℃,低于 7℃
或高于 40℃菌丝停止生长.
2.5.2　pH值对病原菌营养生长的影响
供试菌株 Gz1的营养生长的 pH值范围为
4.0 ～ 9.0,在 pH6.0与 8.0时菌丝体生长量有 2个
高峰(图 6),以 pH8.0时的菌丝体干重最大.总体
上该菌株的营养生长对 pH要求不严格 ,在 pH值
中性两侧均可生长 ,但是在 pH为 8时营养生长
最好 ,说明该菌株更适宜在微碱性环境条件下
生长.
图 4　基于 ITS序列构建的系统发育树
注:括号中为相关菌株的 GenBank的登记号;分支位置中的数字表示 bootstrap支持率;尺标表示每个核苷酸位点上的 0.05替换值.
·47·
南阳师范学院学报　 第 9卷　
2.5.3　病原菌对碳源 、氮源的利用
菌株 Gz1在供试碳源中均能生长(见表 1),其
中蔗糖 、D-果糖 、甘露醇的利用效果最好 ,葡萄糖 、
D-半乳糖 、木糖醇 、木糖 、L-阿拉伯糖 、乳糖 、可溶性
淀粉次之 ,山梨糖和麦芽糖的利用效果最差;对于
所测试的 8种氮源 ,该菌株都能很好地利用(见表
2).
表 1　不同碳源对菌株 Gz1营养生长的影响
碳源 菌落直径a/mm 菌落形态 气生菌丝丰度
蔗糖 77.1 菌落白色 ,圆形 , 稠密的绒毛状 ++++
D-果糖 80.6 菌落白色 ,圆形 , 稠密的细绒毛状 ++++
葡萄糖 72.5 菌落中央红色 , 边缘白色 ,稠密的羊毛状 ++++
D-半乳糖 72.2 菌落白色 ,圆形 , 较稠密的羊毛状 +++
木糖醇 73.7 菌落白色 ,圆形 , 稀疏的羊毛状 +
木糖 72.3 菌落白色 ,圆形 , 稠密的绒毛状 ++++
L-阿拉伯糖 71.6 菌落白色 ,圆形 , 较稠密的绒毛状 +++
乳糖 68.3 菌落白色 ,圆形 , 较稀疏的羊毛状 ++
甘露醇 82.4 菌落白色 ,圆形 , 较稠密的羊毛状 +++
可溶性淀粉 68.0 菌落白色 ,圆形 , 较稠密的羊毛状 +++
山梨糖 62.6 菌落中央浅红色 , 边缘白色 ,较稀疏的羊毛状 ++
麦芽糖 61.2 菌落白色 ,圆形 , 较稠密的羊毛状 +++
a表中的菌落直径均为 3个重复的平均值.
表 2　不同氮源对菌株 Gz1营养生长的影响
氮源 菌落直径a/mm 菌落形态 气生菌丝丰度
氯化铵 57.2
菌落圆形或扇形 ,中央白
色突起 , 基部锈红色 ,雪
花状伏贴
++
磷酸二氢铵 43.3 菌落圆形或者扇形 ,中央黄色 ,边缘白色 ,伏贴状 +
L-组氨酸 70.1 菌落圆形 , 粉红色 , 羊毛状 ++
脲 67.0
菌落圆形 , 中央粉红色 ,
边缘白色 , 绒毛状 , 背部
中央浅红色
++++
L-胱氨酸 43.4 菌落圆形 , 中央黄色 ,边缘白色 ,绒毛状 +
甘氨酸 67.3
菌落圆形 , 白色绒毛状 ,
背面中央粉红色 , 边缘
白色
+++
DL-丙氨酸 79.4
菌落圆形 , 绒毛状 , 中央
粉红色 , 边缘白色 , 羊毛
状 ,背部紫红色
++++
硝酸钠 71.5
菌落圆形 , 中心黄色突
起 ,绒毛状 ,中间浅粉色 ,
背部边缘白色 , 中央粉
红色
+++
a表中的菌落直径均为 3个重复的平均值.
3　结果与讨论
对河南省南阳市西峡县和唐河县的玉米病穗
进行采集和病原菌分离 ,获得单孢菌株 Gz1、Gz2
与 Gz3,根据柯赫氏法则对 3个菌株的致病性进行
测定 ,并结合形态学和 rDNA-ITS序列分析 ,将供试
菌株鉴定为玉蜀黍赤霉菌(Gibberelazeae).
玉蜀黍赤霉菌的无性阶段是禾谷镰刀菌(Fu-
sariumgraminearum),可以引起玉米穗腐病 ,也可
以引起小麦赤霉病 ,目前由于赤霉菌能够分泌多种
真菌毒素 [ 10] (脱氧雪腐镰刀菌烯醇 、伏马菌素 、T-2
毒素 、玉米赤霉烯酮等)而被国内外广泛关注.赤
霉病不仅影响到作物的产量 ,而且其病原菌分泌的
毒素通过食品 、饲料等途径进入食物链而危害人类
的健康.玉蜀黍赤霉菌不仅可以危害玉米果穗 ,引
起玉米穗腐病 ,同时也是引起玉米茎腐病的重要致
病菌 [ 11] ,本研究表明 ,该病菌对叶片也有致病性
(图 1F).邹庆道等人对禾谷镰刀菌引起的玉米穗
腐病和茎腐病的侵染规律和相互关系研究中表明:
引起玉米茎腐病的禾谷镰刀菌不能沿着植株体内
向上扩展到穗部引发穗腐病 ,体外气流传播是禾谷
镰刀菌侵染穗部的主要途径[ 12] .根据 2009年和
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　第 12期 卢维宏等:来自南阳玉米穗腐病样品的玉蜀黍赤霉菌的分离及其特性鉴定
2010年在河南省南阳市玉米产区的调查显示 ,由
镰刀菌或者镰刀菌与青霉菌 、曲霉菌复合侵染而引
起的玉米穗腐病在田间的发生率为 20% ～ 30%,
当玉米螟发生严重时 ,玉米穗腐病的发生率可高达
70% ～ 90%,因此 ,在防治玉米镰刀菌穗腐病时 ,除
了用杀菌剂控制病害外 ,用杀虫剂防治玉米螟也是
减轻病害发生的一个重要策略.南阳是我国重要的
玉米产区 , 本文鉴定了玉蜀黍赤霉菌为南阳玉米
穗腐病的致病菌之一 , 将对当地玉米病害的防控
提供科学依据.
参　考　文　献
[ 1] 　徐彦.2009年中国玉米加工业发展现状及趋势 [ J] .
农业展望 , 2010(2):25-27.
[ 2] 　孔令晓 , 罗畔池.玉米穗粒腐病接种技术研究 [ J] .植
物保护 , 1996, 22(2):22-23.
[ 3] 　陈威 , 吴建宇 , 袁虹霞.玉米穗粒腐病抗病资源研究
[ J] .玉米科学 , 2002, 10(4):59-60, 101.
[ 4] 　黄思良 , 甲元啓介.糸状菌の簡易单胞子分離法の改
良 [ J] .鳥取大学農学部研究報告.1991, 44:1-3.
[ 5] 　谢联辉.普通植物病理学 [ M] .北京:科学出版
社 , 2006.
[ 6] 　LeslieJohnF, SummerellBrettA.TheFusariumLabo-
ratoryManual[ M] .BlackwelPublishing, 2006.
[ 7] 　TamuraK, DudleyJ, NeiM, KumarS.MEGA4:Mo-
lecularEvolutionaryGeneticsAnalysis(MEGA)soft-
wareversion4.0[ J] .MolecularBiologyandEvolution,
2007, 24(8):1596-1599.
[ 8] 　罗远蝉 , 黄思良 , 黎起秦.芒果蒂腐病 Diplodinasp.
生物学特性的研究 [ J] .石河子大学学报:自然科学
版 , 2004, 22(增刊):159-163.
[ 9] 　方中达.植病研究法 [ M] .3版.北京:中国农业出版
社 , 1998.
[ 10] ScarletBiseli, LutzHartig, HeinerWegner, Christian
Hummert.AnalysisoffusariumtoxinusingLC-MS-
MS:Applicationtovariousfoodandfeedmatrices[ J] .
Spectroscopy, 2005, 20(2):20-28.
[ 11] 许远 , 杨英娟.玉米茎腐病禾谷镰刀菌的系统分离
[ J] .杂粮作物 , 2005, 25(3):204.
[ 12] 邹庆道 ,许远 ,王立 ,陈捷.玉米镰孢菌穗腐病和茎腐
病侵染规律相互关系的研究 [ J] .沈阳农业大学学
报 , 2000, 10(3):487-489.
IsolationandcharacterizationofGibberelazeaefrom
thecornearrotsamplesinNanyang
LUWei-hong1, 2 , HUANGSi-liang2 , TAOAi-li1, 2 , LIQi-qin1 , WANGYao-fang3
(1.ColegeofAgriculture, GuangxiUniversity, Nanning530005, China;2.SchoolofLife
SciencesandTechnology, NanyangNormalUniversity, Nanyang473061, China;
3.ColegeofLifeSciences, GuangxiNormalUniversity, Guilin541004, China)
Abstract:CornearrotwasfoundinXixiaandTanghecountiesofNanyangcityinHenanprovincein2009.The
diseasedearsampleswerecolectedandusedforpathogenisolations.Threemonosporicisolates(Gz1, Gz12and
Gz3)wereobtained.Thepathogenicityoftheisolatestocornleavesandearswasconfirmed.TherDNA-ITSse-
quencesofthethreeisolateswereamplifiedusingprimersITS1 andITS4andtheirGenBankaccessionnumbers
wereHM769949, HM769950andHQ110051forisolatesGz1, Gz2andGz3, respectively.Basedonmorphologi-
calcharacteristicsoftheisolatesandphylogeneticanalysisoftheirrDNA-ITSsequences, thethreeisolateswere
identifiedasGibberelazeae.TheisolateGz1 wasusedastherepresentativeanditspartialcharacteristicswere
tested.
Keywords:maize;Gibberelazeae;pathogenicity;morphologicalcharacter;rDNA-ITSsequence
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