全 文 ：第 9卷 第 l期
1 9 9 3年 5月
广 西 科 学 院 学 报
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9
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桃榔蛋白酶的分离 、 纯化及性质的研究 *
陈 强 叶启腾 李春香 胃寿平
广西亚热带作物研究所 南宁 53X( X) 1) (广西农业大学 南宁 习以力习
摘共 在枕梆属的月抽叼口 p栩 . 的果实中 , 发现了丰富的蛋白水解酶 . 我们称
之为扰梆醉 (内商必山下用硫酸按将果肉汁分级盐析获得粗酶制品 , 用 D E犯层
析分出三个蛋白水解活性峰 . 其中层析成分 5为主要活性组分 , 等电聚焦电泳证
实该组分均一 , 等电点在 p川 . 9 左右 , 用 SD S一 PA GE 电泳法测算褥分子盘为
礴月以力。
10
一 ,砌刀L 的掩卜 、 , 口随 B、 l从 、 D n怕 可计量地使酶失 活 . gH Z` 、
户口班 B抑翻了的酶可为 ED,〔A恢复活性 . 一定时间内琉基乙醇能令酶活性增加 。
二异丙基级礴酸虽可抑制酶活性 . 但先加半耽氛酸 , 后加二异丙基奴磷酸 , 可使
这种抑制不能实现 . 证明恍榔醉是琉蕃酶 .
酪蛋白做底物 , 拢梆酶反应的最适温度为 印 ℃ , 最适 pH 为 pH l . 该酶的
p H 稳定性很好 , p H 6一 12 都表现了很高活性 . 醉液于 p H 6 ~ 12 中解小时活性
基本不变 ; 该醉还表现了极高的乙醉耐受力 , 在 50 % ~ 为% 的乙醉中都显示出
高括性 . 它还附受加的呱盐酸肛 , 功% 曲拉通 , .0l mo 转的二琉苏籍醇 ·
关挂词 枕梆 蛋白阵 挠榔蛋白旅
1 材料和方法
.1l 恍梆曲的制备 取果肉榨汁 , 盐析得粗酶 . 经柱层析 . 取其中层析成分 5干燥成酶制
剂 . 并以木瓜酶 、 菠萝酶 、 剑麻酶作对照材料 .
I J 蛋白水解酶活性测定
1二 i 酪蛋白法 :lI 除注明外 , 酶童用 .0 05 叱加止 , 并按定盆比例加入试剂 .
11 2 0 卜仃酪蛋白法川 : 酶用盘 lgtn 了证 .
1妇2 年 12 月 7 日收稿
. 国家自然科学羞金资助项 目。
DOI : 10. 13657 /j . cnki . gxkxyxb. 1993. 01. 012
第 9卷 第 1期 陈强等 :桃榔蛋白酶的分离 、 纯化及性质的研纪
2研究内容和分析
. 1 2恍榔酶的分布和活性情况
. 2L I 桃榔酶在植株的分布 :取植株不同部位组织直接榨汁测定活性 , 结果见表 1.
裹 1 植株不同部位组织的榨汁率 、 活性和汁液活性
(酷蛋白法一 即萦外单位 )
.言 .矿一 ~巡竺 茎 果实柄 果皮 呆肉
组织活性 (W目 5 l 岌幻 0 妞目呱
汁液榨取率 (o0/ 2 26 15 ,
针液活性 (咙 ) 68 3 15 0 曰目 )
结果表明 , 酶是非均一地分布于桃榔植物组织的不同部位 . 主要存在于果肉中 .
.2 1 2 不同果期的果实的含酶量及制荆活性 :
分取果期为种子刚形成 、 果实充分长大及果实成熟变软的扰榔果 , 并各取其果肉 100
克榨汁制成硫按酶制剂 , 计算它们的得率并测定活性 , 结果见表 .2
表 2 不同成熟度桃梆果的榨汁率及硫铁酶制剂活性
(酪蛋白法测活性 )
果 期 种子刚形成
千克果肉得汁盈
千克果肉得粗醉
克` ,
}
` , 0
(克 ) ! 25 . 3
果实充分长大 果实成熟变软
5 80 5印
活性 (万单位 /克 )
38
.
2
117
.
5
4
.
1
11 0
从表 2中可见 ,
都降低 .
只,
果实充分长大时酶量最大 , 活性最高 , 成熟变软的果实含酶量和活性
.2 2 扰榔酶的提取纯化及纯度鉴定
.2 .2 1 提取工艺
采果一 剥取果肉~ 榨取果肉汁~ 30 % 饱和度硫酸按去杂一 上请补足 50 % 饱和硫酸
一 _ ~ ~ 一 , _。 、 : _ ~ ~ 透析~ , , _ _ t _ _ 、 、 _ _ _ _ ~ ~ _ ~ ~ 一 。 _ 一 , ,一 ~铁取沉淀~ 干燥为粗酶军 ’调 p珊尹去沉淀一 D E 52 层析 , 取层析成分 5 ~ 干燥 (酶制
剂 ) 得率见表3 和表4 . 粗酶回收率达 74 . 5% , 酶制剂回收率为47 . 5% .
.2 2 ? D E52 柱层析分离及等电聚胶电泳鉴定
采用岛津 L C一 6A 高效液相层析系统作酶分离 , 柱用 D E52 , 柱大 l . sc m x 30 c m, 甘
箩酸缓冲液 p H g . 5, 2 . 5 x 10 一 ` 3 mo l压 , 伊旧 4 )2 50 ; 梯度洗脱 , 20 lrn 洒 . 见图 1 .
图 1 中可见 D E 52 柱层析酶能分离出 8 个在 280n m 处有吸收的蛋白峰 , 其中 2 、 4 、 5
峰有活性 , 第 5蛋白衅为主要活性成分 。 从表 4 中可见 D E 52 分离的第5 成分回收率为 637% ,
护、 原 料到 成 品 为 回收 率 为47 . 5 ” ` 。 虽然我们也曾用 C M 32 、 2 , Q月心 5 、 50 等柱进行分
广 西 科 学 院 学 报 19 93 年
衰3 硫袂法枕娜旅创取回收率
项 目 果 肉 什 液 粗 醉
活力( 紫外单旬萄 曰众 !3 8别叉】 !1. 72 万
重 t( 克) 】以刀5 的 阳. 5 1
总活力 汾并万单位) 创洲幻 铭目 利7 1
以果肉为羞救的衡力回收百分率 l加 81. 0. 7 45
一 居析时 邓 On m吸收曲线
森
倒喊冲众浓度由跪
价活性峰
ǎ 1ù一 a七) ,0的t(口亡`)
尹 z 咤洲尹尸碑沪尹
.尸 . `沪
洲尸一
气心。(昌另)Q·oà
户产尸尸户尹 尹
沪沪沪 .
产尸沪碑尸户 洲}
1田 150 公幻 25 O j 阅 二努介
圈 1 〔 〔公层析圈
离 , 离子浓度均超过 I么. 1瓜 .分离效果都不如DE 52, 而 D E52 分离时的 p H和离子强度也
都不是常规范围了 。
衰 ` D砂兑层析枕娜阵回收率
项 目 总 t 蛋白 t 活性 总活性 回收率 纯化倍欲
恤 ) 伽 g ) (万 u ) (州吨盆白 ) %
上样情况 1仍 1丘 0 1盯 3龙 曰 .7 1吐
层析成分 5 姑 .9 7 1 79 期
第9 卷 第 l期 陈强等 :枕榔蛋白酶的分离、 纯化及性质的研究 .”
2 .2 . 3等电聚焦鉴定层析成分 5
等电聚焦电泳采用 L K B公司 M t u ilp h or l的 pH 3
.
5~10八旧 lp h o枷 系统 .将单丙烯
酸胺配成9 2 .1 %溶液 , 取 .3 s m L ; 甲叉双丙烯酞胺 .0 9% 液取 lmL
, 加水 .7 s m L ,加入 p 3H . 5
~ 10 的两 性 电解质 A m p ho iln l功L , 抽气 15 分钟 , 再加入过硫酸按 .0 s m L 制成 10 . c3 m
气 长 , 25 cm 宽的胶板 , 正极为 lmo 转磷酸 , 负极为 1伽 l压 Na o H . 以浓缩的层析成分 5加
10 一伽1压 珑a Z 透析上样 , 预电泳 10 伏 , 30 分钟升至 80 伏 , 1小时后再升至 10 0
伏 , 电泳 2 小时当电流降至 4 毫安左右不能再降时停止 . 电泳后胶板的 14/ 用考马斯亮兰
染色处理并作光谱扫描 , 以观察酶制剂的纯度 , 计量其等电点及对应的含盆 . 结果如图 .2
0
产,闷田
0 ” 以幻
21
产 尹
2 1叨 , , 0
图 2 枕梆酶等电聚焦电泳扫描图
由图 2 可见 , 经 D E 52 层析的酶制剂较纯 , 等电点在 p 3H . 9 左右 . 余下的胶板在对
应等电点为 p 3H .9 9 的位置上切下胶体 , 用浓度为 5 X 10 ~ Z mo 转 的 E D T .A一 半脱氛酸溶
液处理后进入系统测定活性 . 结果显示该蛋白带有活性 , 证明该蛋白带确是蛋白酶 .
.2 .2 4 枕榔蛋白酶的 S D S 一 P A G E 电泳测定分子量
采用 L胶 .B 的 M ul it p h or n 电泳仪 , s D s 一 P A G E 法 . 做 3 段胶 , 聚丙烯酸胺凝胶浓
度分别为 .3 75 % 、 .7 5% 、 12 % . 胶尺寸分别是 .2 Icm 、 .0 gcm 、 c6 m . 以 L人 :B 的标准蛋白
试剂 (分子量分别是 132 0 、 17 20 、 30 0 、 450 0 、 “ 0 0 、 780 0) 做对照与扰榔蛋白酶共
电泳 , 条件为先用 10 毫安 、 13 伏电泳 2 小时 12 分钟 , 然后升到 13 毫安 、 205 伏电泳 4
小时 50 分钟 , 取出胶固定 , 用考马斯 2R 50 染色 。 用相对迁移率及其分子盆对数作半对数
图 (见图 3) , 测算得恍榔蛋白酶的分子量约是 4 0 0 。
广 西 科 学 院 学 报 19 9 3年
刃旬 3 0
翻卜余 x,。[
0 0
.
1 .0 3
相对迁移率 ( fR )
田 3 5此 一 P AG七电泳中各蛋白质分子全对数与相对迁移率图
U 枕御酌活性中心的鉴定
.2 1 1 按方法所示 , 将专一性 琉基试剂 : 碘 乙酸 (认 A ) 、 对 抓汞 苯 甲酸 少CM称
I殆伪 、 连四硫酸钠 (N助 5 4 0 6) 、 5, 5’ 一 二硫双 (2 一 硝荃苯 甲酸 ) (口 n侣 )、 琉羞乙
醉、 半耽氛酸 (C y S功 ;经基试剂 : 二异丙基奴磷酸 (D即 ) 、 对甲基笨成酸氛 ( PM S称金
属试剂 : 乙二胺四乙酸 (班打拘分别作用于梳榔酶 , 终浓度和结果如表 .5
从表 5看到 , 扰梆酶似可为典型的琉基试剂 功刁 曲转 的 幼八 、 H g( 工 、 P 口随 B 抑
制 , 且抑制情况随试荆全增加而增加 , 抑制后 的酶不为 1. 5 x 10 一 2咖呱 的 C丫S H 激
活 , 10 一 二 l瓜的 曰刀沐 可羞本恢复 H梦工 、 PC M B抑制的酶活性 , 单独使用 10 一 1 . 呱
的 C丫S H 、 琉基乙醉 、 班介人 看不出酶活性有大变化 , 可见它似依赖于琉荟 . 但与木瓜
醉 、 菠萝酶 、 剑麻酶等典型的琉基酶比较 , 枕梆协对琉基试荆的敏感性雄了两个吸注级 ,
桂榔酶不受 10 一 3伽狐 的 卜区2 5 0 0 6 的形响 (这大概是位置效应等因素形响所致 ) ;
而受 D F P 、 PM S F 之类经基试剂的抑制 , 那么此酶会不会含活性 O H 基? 由于 别M S F 、
P CM B
、
D介怕 等不溶于水故用了高浓度乙醉配制 , 它们的抑制又会不会是乙阵抑例的假
象? 曰刀人能除去汞盐对醉的抑制 , 这否定了酶活性对金属的可能依赖 . 为了确定或排除
醉活性中心含 SH 基 、 O H 基或是有酸性蛋白酶的可能 , 且由于 目前普遍把蛋白酶按活性
中心分为四类 : O H 酶 、 SH 酶 、 金属酶 、 酸性蛋白酶 田 , 故研究采用排除法来确定酶的活
性中心 , 并进一步设计了如下实脸 。
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十刊
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即 广 西 科 学 院 学 报 19 9 3 年
习 J扰榔酶对乙醉的耐受性
用不同浓度的乙醉配制酶液 , 并以木瓜酶作对照 40 ℃ 预热 15 分后进入测定系统 , 结
果如表 .6
衰 ` 枕梆陇对乙醉的耐受性蒸 0 25 % 50 % 75 %木瓜醉 枕榔醉 木瓜酶 枕梆醉 木瓜醉 拢梆醉 木瓜醉 扰榔醉0 让夕. O勿犯 .0 1醉 0 . 3 14 .0佣 4 O刀 6 0朋 3 02 辫
1为 OJ 巧 O刀6 .0 1匆 OJ 10 0 .06 9 0 3 15 0 .以巧 住别习
1龙 0邃舀 仅乙 , .0 137 .0 30 1 O刀12 029 3 O众犯 众Z均
1月 ) 0 仅刀 7 0 0 .洲 5 0 0 2场 0 02肠
从表 6中可见桂娜酶对乙醇的耐受性极强 . 于 50 % 乙醉和 75 % 乙醉中 O . D 值各为
a 326和 0 . 2 94 , 分别比在水中的 O。 值 0 . 242 高 34 . 7 1% 和 2 2 , l% . 同时 ,于 50% 乙醉中 120
分钟扰梆酶仍与水中的始活性相当 , 可见扰榔酶确是为P C M B 、 PM S F 、 D T N B 所抑制的 .
2 3 3 半脸氮酸对酶的保护作用
由表 5 中看出 , D F P 对扰榔酶的抑制浓度偏高 , 故本试验中酶量降至原设定方法的
l /4
, 并在加入 D即 前后 15 分钟各加入o . l lon lL/ 的半耽氨酸 , 观察酶活性变化 , 结果如表 .7
表 7 半眯氮酸对碗与 D FP作用时的保护
篇过 D F P 先加 ( 5 x 10 一礴口幻】压 ) 先加 .0 lmo l几 0( 万x 10一闷斌幻 lL/ ) D F p · C、 S H后加 C丫S H 后加 D F P
扰梆醉 O刀】3 .0工 5 0 . 101 .0 10 1
枯草杆菌蛋白醉 0 0 0 Q 3 I I
表 7 中可见在使用 D FP 时 , 不论加与不加半胧氨酸 , 典型的丝氨酸 O H 基酶 、 枯草
杆菌蛋白酶活性均为 0 . 而对于扰榔酶来说 , 0 . lm 。呱 C丫S H 虽不能恢复 D FP 抑制了的
活性 , 但在先加入足量的琉基试剂 CYS H 时 , 酶活性中心不受 D FP 影响 。 这一试脸证实
了扰榔酶活性中心不含 O H 基 , 因为琉基试剂对 O H 基是不应有保护作用的。 也提示了琉
基作为此酶催化基团的可能 . 为了证实酶是否为酸性蛋白酶 , 又设计了如下试脸 。
2入4 p H 对扰榔酶的形响
将酪蛋白用几组缓冲液配成 p H 3 ~ 13 的底物系列 , 并将酶用缓冲液调成相应的 p H,
40 ℃ 保温 30 分钟后进入侧定系统 , 结果如图 4 . 另将酶置于室温 、 p H l l 中 , 在不同时
间测定活性 (测定活性时调回 p H刀 . 结果如表 8 .
图 4 中可见扰御醉在 p H 7 以下活性急骤降低 , 至 p H3 时活性近为 。 , 于 p H S 以上时活
性上升加快 , 在 pgH .6 ~ 1 之间有最高活性 . 于 p H 13 时酶活性还有 p H 7 时的 14/ . 可
见此酶极耐碱 . 由于酸性蛋白酶最适催化条件在 p ZH ~ 4 , 且往往对 ED T A 抑制敏感 ,
第 9卷 第1 期 陈强等 :枕梆蛋白能的分离、 纯化及性质的研究
柠橄酸系统
巴比妥盐胜系统
翻砂氮载化钠系统
礴敌组二钠 、红载化拍系统
饭化钠 .
盆筑化幼系统
口
0 0
.
3 合 ~ ~ . - -~
r 州
图 4株梆醉的 p H形响图
衰8 枕娜礴于 p川1 的室盔保存牌况
时间0 2 水8 4肠
OD 印 Hl l )0 . 4邓0 . 4盆 认月加0 3 .7 40 .老衬
括性 %叨 呢` 眠 Ig 7 .3 砚1
水 OD 0 .钻0 2 .朽0 5. 40 3 . 4加0 .们 l
水 借性 均 叨1 以6 明 兑 9肠夕
可见枕梆酶不是酸性蛋白酶 。
由于醉的活性琉基在孩性条件下极易筑化成双硫键 , 而此酶于室温中 p H l 置 24 小
时仍无明显变化 , 至 % 小时仍保存了原活性的 69 % , 这样的稳定性在琉基蛋白酶中是未见
报道的 , 即是说对醉的活性中心是否为硫羞提出了疑问 . 按陈惠黎先生指出的 : “二硫键
可作为活性中心 , 切的说法 , 扰梆碑又会不会是含 . 二硫键的催化中心 , 呢? 为此我们
设计了如下试脸 .
幼 .5 D T T 、 琉基乙醉和酶作用试脸
若酶活性中心含二硫键 , 那么二硫键一断裂 , 酶即失活 . 为此设计了在高 p H印H S .刀
条件下 , 用传统的 一 s一 S拆分试剂 4[, 习 D T 和琉基乙醇对桃榔酶进行处理 , 以观察它们
对扰榔酶的影响 . 为了增加试剂与酶接触 , 还加进了尿素 “ 玫幻转 或 s m o切叻. 结果如表
9
、
10
.
广 西 科 学 院 学 报9 9 1 3年
表 , 镜娜眺于 书℃ 如以瓜尿幸中与琉醉的作用
次 0 礴口幻 l压尿素0 10 一 1 . 呱 口】T 3 x 一0一加 l压 琉基乙醉 10 一 ’ om l压 D T T 3 x OI 一 l的 1压 琉荃乙醉活性 % 】口 处 0 105 .5 9 1 . 7 158
衰 10 拚娜曲于 旬 ℃ 翻 d 仄尿素中与琉醉的反应
次 无 尿 素 8即 l压 尿索0 10一 ’ . 1压 3 x 10 一 ’ m 0 1压 10一 ’ 口幻 l压 3 x lo 一 ’ 即转 0口 IT 琉基乙醇 D T T 琉基乙醉 尿宜对照反 25 1的 见 5 l的 O 42 110 . 8 10 1` 7应时 印 1田 5 1 . 5 106 , O
间
(分) 叨 10 1 . 7 盯. 5 106 . 3 .40 6 9 5 1.07 0
3闭 10 1 . 5 们 . 2 103 . 0 12 . 3 37 . 6 .97 1
】月旬 9 5 36 9 5. 1 0 28 . 2 引 . 5
从表 9 和表 10 看出 , p H .S 7 时加入 3 x lo 一 1mo l压 的疏基乙醇 , 无论是在 35 ℃ 或 40
℃ 短时间内扰榔酶活性都略有提高 , 特别是再加入 4伽l压尿素 , 酶活性高达 158 % 。 由
于琉基乙醉是温和的二硫键拆分试剂 , 它可将二硫键还原而增 加琉基酶的活性 . 而 D 户n ,
作用更激烈 , 较少的量即可令蛋白质的结构二硫键断裂 。 a e la n d l4[ 指 出 , 二疏苏糖醇和
二琉赤鲜塘醉将蛋白二硫键还原折分只需 0 . I lon lL/ 浓度就够了 , 长时间的琉基乙醇作用
也一样 , 它最终也会将蛋白质结构二硫键断裂而令酶失活 . 疏基乙醇在碱性 ( p H S . 9) 且有
尿素存在时使枕榔酶活性显著增加 , 只能说明酶琉基被还原而被疏醇激活 , 这当然只能证
实扰榔酶是一个琉基酶 , 而否定了此酶活性中心含二硫键 . (除陈惠黎先生文提及 , 我们
没有查到过蛋白水解酶 , 甚至酶有以二硫键这种无解离基团的组分做为活性中心的。 )
.2 4 金属离子对恍榔酶的影响
将各种金属离子分别加入酶液中 , 使离子的最终浓度为 1。 一 3 m 。呱 ,40 ℃ 保温 30 分钟
即进入 D ln ,测定系统 .
衰 n 金属离子对桃娜的活性的影晌
名称 Q , , 掩冲 aB 卜 gH 十 孔 , + eF 卜 M g Z+ M o Z+ C沪+ S n Z+ B产+ M n Z + 0 2+ S b Z+ 瓦 2+ Z价中 配 , 对照
活性 .0 义抖 扣口 1亏 n n飞弓R 住03 8 0 .仪经 .0 08 6 .0 03 78 .0例 2 .0 20 0 . 1 17 .0 25 8 .0 03 6 0 . 339 .0 33 .0 佣 4 .0 20 7 0 . 138 a 36
o(
.
D 值 )
从表 U 我们可看出大部分金属离子对扰榔酶影响不明显 , 但 gA + 、 H g Z十 、 eF 3十 、
M o Z十
、
M n Z 十 对酶影响较大 , 浓度 10 一 3 切狐就已使酶基本失活了 , 这也正是和疏基
酶的性质相符合的 .
第9卷 第 l 期 陈强等: 桃榔蛋白酶的分离 、 纯化及性质的研究 3 8
2占 枕榔酶对一些主要蛋白变性剂的耐受性
用不同浓度的盐酸肌 、 十二烷基肌酸钠 (s ar ko s yl )、 曲拉通 ( T巧 to n10 0 )和酚等主要
的蛋白变性剂配制酶液在室温放置 30 分钟后进入测定系统 。 结果见表 1 2、 13 、 14 .
表 1 2不同浓度盐酸肌对枕梆酶的影晌
盐酸盆
加l向
0
.
D
0
水对照
0. 3印 0. 3印 0. 闷佣 ! 0. 4 4 5
注: 加 如阅】压 以上盐酸胜时反应液不能过滤 , 故没做 .
表 13 曲拉通和 S田瓜呵 1对恍榔酶的影响
麒哭 仪水溶液 ) 0 . 5 1 4 5 l0 50
T ir ot n l的 0乃5 .0 飞心 .0犯5 .0 创艾】 .0 3 26 O朋 5 .0 25 0
S政 . y l .0 37 .0 0 56
表 14 不同浓度酚对 A此谈 , 果蛋白酶活性的影响
酚浓度 0 5 l 0 为 刃
o(/ ) (水溶液 )
O D 值 a 326 .0砚洲 ) .0仪幻 0 .〕刀 .0 (刀 )
盐酸肛 、 十二烷基肌酸钠 、 T h ot n 10 都是破坏蛋白质高级结构的蛋白变性剂 , 它们
常用于核酸或膜物质提取 。 从表 12 中可见盐酸孤能令酶活性增加到 12 4% (0 . 450 0/ . 360) 低
浓度 ( 1% ~ 10 % ) 的 J h幻 n 10 也令酶活性增加 , 于 0 . 5% 的 sa kor s yl 中酶活性尚能保
存一半以上 . 可见此酶的稳定性是很好的 . 但从表 14 中可看出它对酚的耐受性极差 , 这
又提示在工作中能用酚来除去恍榔酶 .
2万 恍榔酶的最适作用温度及在一些温度下的稳定性 .
在不同的反应温度下测定扰榔酶的活性 , 结果如表 15、 图 5 . 在 37 ℃ 下放置不同时
间 , 然后测定活性 , 结果如表 16 。 在 60 ℃ 下放置不同时间 , 然后测定活性 , 结果如表
17
. 室温下 (试验时为 6月份 , 气温为 27 ~ 32 ℃ ) 放置不同时间后测定活性 , 结果见
、 、 表 18 。
表 15 挑娜陇的活性与温度关系
沮度 (℃ ) 加 30 40 50 55 印 65 70 80 叨
O
.
D
.
0
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广 西 科 学 院 学 报 19 9 3年
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结果表明扰榔酶在 60 ℃下显示出最高
活性 ; 在温度 30 ℃ 左右 24 小时活性不
72 小时下降不到 20% ; 在 37 ℃ 和 60
, 活性稳定时间分别为 30 分钟和大于 20
变℃
分钟 , 可见该酶的稳定性极好 .
3 结论和讨论
从实脸结果看出 , 扰梆酶分布于枕榔
植物茎干 、 果柄等组织中 , 但主要含酶部位
仍在果肉 . 每千克果肉含酶高达 6 千万单
位 , 比菠萝的 1 千万 u/ 千克高 , 而与番木
瓜的相近 。 若要生产恍梆酶宜从果肉提取 .
只与半耽氨酸琉基结合的对抓汞苯甲酸
对酶有计量的抑制 ; D T卜B[ 、 IA A 对酶抑
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图 5 挽梆酶活性— 温度曲线制 ; 先加入半胧氛酸可保护酶不受 DFP 抑
制 ; 琉基乙醇 (于 4mo 转尿素 、 p H .S乃使酶活性增到 158 % , 证明恍榔酶是活性依赖于半
脱氨酸的疏基酶 . 但桃榔酶又不同于一般的琉基酶 , 它比菠萝酶 、 木瓜酶对疏基试剂耐
受力要高出两个数盘级 ; 5 x 10 弓 mo 转 的 Na Z s 4 0 。 对它无影响 ; 甚至于 p H 13 和在
75 % 乙醇中酶都能表现出与对照相近或高于对照 (不加试剂 ) 的活性 , 证明了扰梆酶的
结构紧密而特殊 , 这在一般的蛋白酶乃至酶体系中也是很少见的 . 因而提示了扰榔酶在生
物工程中作为工具的前景 , 尤其是在酶促合成新蛋白时 , 符合疏水条件提高得率的要求 .
第 9卷 第 l期 陈强等: 桃梆蛋白酶的分离 、 纯化及性质的研究
恍榔酶特殊的稳定性显示了它是研究蛋白质结构和功能关系的一种有价值的材料 .
但为酶家族增加了新成员 , 也为生物工程研究提供了新手段和材料 。
8 5
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参考文献
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