全 文 ：新疆三芒草 DＲEB基因片段的克隆
梁红艳1，2 (1．三门峡职业技术学院生化工程系，河南三门峡 472000;2．石河子大学农学院，新疆石河子 832003)
摘要 ［目的］克隆新疆三芒草 DＲEB基因片段。［方法］利用 PCＲ技术和 ＲACE技术，从新疆沙漠边缘抗旱植物三芒草中克隆抗旱相
关基因 DＲEB片段。［结果］研究克隆到了 4个 DＲEB基因片段。［结论］该研究为进一步获得 DＲEB基因全序列和研究植物抗旱分子
机理、培养抗旱作物品种奠定了基础。
关键词 新疆三芒草;DＲEB;克隆
中图分类号 S544 + ． 9 文献标识码 A 文章编号 0517 －6611(2013)11 －04725 －02
DＲEB Gene Fragments Clone of Aristida pennata in Xinjiang
LIANG Hong-yan (Biochemical Engineering Department，Sanmenxia Polytechnic，Sanmenxia，Henan 472000)
Abstract ［Objective］The paper was to clone DＲEB gene fragments of Aristida pennata in Xinjiang． ［Method］Using the PCＲ and ＲACE tech-
nology，the segments of drought － resistant related gene DＲEB were cloned from A． pennata at the edge of desert in Xinjiang． ［Ｒesult］Four
DＲEB gene fragments were cloned． ［Conclusion］The study laid a foundation for the further obtainment of complete sequence of DＲEB gene，
study of drought － resistant molecular mechanism of plants and cultivation of drought － resistant crops varieties．
Key words Aristida pennata in Xinjiang;DＲEB;Clone
作者简介 梁红艳(1978 － )，女，山西忻州人，讲师，硕士，从事生物技
术方面的研究，E-mail:hongyanliang2001@ aliyun． com。
收稿日期 2013-03-18
水资源短缺可严重影响植物的生长发育，造成作物减产
和生态环境恶化，是制约我国内陆地区农业生产的主要因素
之一［1］。提高作物的抗旱能力，积极培育耐旱作物品种及高
效利用有限的淡水资源是现代植物育种工作急需解决的
问题。
DＲEB(干旱应答元件结合蛋白)转录因子能调控多个与
干旱、高盐及低温耐性有关的功能基因表达［2］，所以可利用
DＲEB转录因子来改良作物的抗旱性能。目前，人们已在烟
草［3］、小麦［4］、大麦［5］、水稻［6］、玉米［7］、番茄［8］等植物中找到
了相似的转录因子，为 DＲEB转录因子在改良植物抗逆性基
因工程中的应用创造了条件。
三芒草(Aristida pennata)为禾本科(Poaceae)三芒草属
植物，主要分布于我国新疆、内蒙古等省(区)，抗旱能力极
强［9］，可作饲料，且抗高温、耐盐碱，是重要的沙漠草本植物
之一。目前，尚未见对三芒草进行 DＲEB 基因克隆的报道。
笔者以新疆三芒草为研究材料，利用 PCＲ 技术和 ＲACE 技
术，克隆抗旱相关基因 DＲEB 片段，为进一步获得该基因全
序列，研究植物抗旱分子机理、培育抗旱作物品种奠定基础。
1 材料和方法
1． 1 材料 供试三芒草植株采自北疆沙漠边缘，冻存后用
于总 ＲNA的提取;ＲNA提取试剂盒、反转录试剂盒、回收试
剂盒均购自上海生工生物工程技术服务有限公司(上海生
工)，EcoＲⅠ限制性内切酶、T4 连接酶、Marker 等试剂材料由
三门峡职业技术学院生化工程系实验室提供，所用 T载体为
pGEM-T，购自 Promaga公司。
1． 2 引物设计与合成 利用小麦、山羊草等禾本科植物
DＲEB基因的保守区设计简并引物，引物设计软件为 Prime
Premier5． 0，引物序列为 5-GNTTYMGNGGNGTNMGNCA-3和
3-CGNＲANCGNKCNTGNTTＲ-5，由上海生工生物工程技术
服务有限公司合成。
1． 3 DＲEB基因片段的克隆 用 ＲNA 提取试剂盒提取三
芒草的总 ＲNA，具体步骤参考试剂盒说明书，略加改动;总
ＲNA经琼脂糖凝胶电泳检测后，通过反转录试剂盒，按表 1
体系和步骤获取 cDNA第 1链;再按表 2 的反应体系和程序
进行 PCＲ，PCＲ反应产物置于 －20 ℃保存。
表 1 反转录体系及步骤
试剂 用量 操作步骤
总 ＲNA 0． 1 ～0． 5 μg 混匀，离心 3 ～ 5 s 后，70℃
水浴 5 min，置于冰上冷却，
离心机收集液体
Oligo(dT)18 primer (0． 5
μg /μl)
1 μl
DEPC H2O 补足至 10 μl
5 × reaction buffer 4 μl 冰上加入左侧成份，混匀，
离心 3 ～ 5 s，37 ℃水浴 5
min
ＲibolockTM inhibito (20
U /μl)
1 μl
10 mmol /L dNTPs 2 μl
反转录酶(200 U /μl) 1 μl 42 ℃水浴 60 min 后，70 ℃
水浴 10 min，停止反应，置
于冰上
ddH2O 补足至 20 μl
表 2 PCＲ扩增体系及程序
反应体系 用量∥μl 扩增程序
primer(20 ng /μl) 1． 0 94 ℃预变性，2 min→
Oligo(dT)18(0． 5 μg /μl) 3． 0 (94 ℃变性 30 s→退火温
Mg2 + 15 mmol /L 1． 0 度，1 min→72 ℃延伸 45
10 × PCＲ Buffer 2． 5 s)，39个循环→72 ℃延
dNTPs(10 mmol /L) 0． 5 伸 10 min→4 ℃备用
cDNA 0． 5
Taq酶(5 U /μl) 0． 5
ddH2O 16． 0
安徽农业科学，Journal of Anhui Agri． Sci． 2013，41(11):4725 － 4726，4728 责任编辑 朱琼琼 责任校对 况玲玲
DOI:10.13989/j.cnki.0517-6611.2013.11.122
琼脂糖电泳检测 PCＲ 产物后，先用试剂盒回收特异片
段;再依次进行大肠感受态细胞的制备(GaCl2 法)、连接反
应(回收片段 4 μl + 2 × Lig Buffer 5 μl + T载体 0． 5 μl +连接
酶)和热击转化;然后在 LB平板上通过蓝白斑挑阳性克隆，
提取质粒并进行质粒酶切(体系为 EcoＲⅠ1 μl + 10 × Buffer 2
μl +质粒 5 μl + ddH2O补足至 20 μl)，酶切完毕进行琼脂糖
电泳检测，经鉴定的阳性克隆可进行序列测定。
2 结果及分析
2． 1 三芒草 DNA、总 ＲNA 的提取及 cDNA 的获得 利用
ＲNA提取试剂盒提取了新疆三芒草的总 ＲNA(图 1)，在此
基础上反转录获得了 cDNA。
图 1 新疆三芒草总 ＲNA的提取
2． 2 三芒草 DＲEB基因特异片段的获得 以三芒草的 cD-
NA为模板，用设计的 DＲEB简并引物进行扩增，扩增产物用
1． 2%琼脂糖凝胶进行电泳，结果如图 2 所示。扩增产物条
带分布范围较大，不能有效区分扩增片段的数量，因此改用
分辨率更高的聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)进行检测(图
2)，发现扩增产物包含 4 个特异片段，分子量在 600 ～ 1 000
bp之间。
图 2 琼脂糖凝胶电泳(左)和 PAGE电泳(右)结果
2． 3 三芒草 DＲEB 基因片段的克隆 用试剂盒回收琼脂
糖电泳检测的 PCＲ产物，经与 T载体连接后，转化至大肠杆
菌感受态细胞中，筛选到 4个阳性克隆，提取其中的质粒，并
进行酶切和检测，结果如图 3 所示，筛选的 4 个阳性克隆中
的基因片段分子量并不相同，印证了前述聚丙烯酰胺凝胶电
泳的结果。
注:M． DNA Marker;h4为 4个阳性克隆的酶切产物。
图 3 重组质粒的酶切结果
3 结论与讨论
该研究从北疆沙漠边缘抗旱植物三芒草中提取了总
ＲNA，利用 PCＲ技术和 ＲACE技术，克隆到了 4 个与抗旱相
关的 DＲEB基因片段。
近年来，很多学者对 DＲEB 转录因子进行了研究，如潘
孝武等［10］利用拟南芥 DＲEB1序列在水稻全基因组中进行检
索，得到 9 个同源基因。其中，有 3 个基因的保守区域与
DＲEB1存在较高相似性。李聪等［11］通过 ＲT-PCＲ技术对转
OjDＲEB基因的烟草进行研究结果表明过量表达 OjDＲEB基
因可提高烟草的耐盐能力，与野生型对照相比，转基因烟草
的叶绿素含量和 SOD酶活性大幅增大，而 MDA含量和电解
质渗透率却下降近一半。王源等［7］将用玉米 ZmDＲEB3 基
因参与构建的植物表达载体转化玉米自交系吉 444、Mo17，
并对 7株草甘膦抗性植株进一步进行 PCＲ-Southern检测，得
到 2个同时整合 EPSPS标记基因和 ZmDＲEB3 目的基因的
转基因株系。文益东等［12］对转 AtDＲEB2A基因苜蓿的研究
发现，AtDＲEB2A基因的超量表达提高了转基因苜蓿的耐碱
能力，在碱胁迫(100 mmol /L，pH 8． 5)下，相对质膜透性及丙
二醛含量显著降低，叶绿素含量和根系活力明显提高。
DＲEB主要由 DＲEB1 和 DＲEB2 2 个亚家族成员组成，
分别受低温和干旱诱导，是调控植物对多种非生物逆境胁迫
相关基因表达的转录因子之一［13］。因此，运用分子生物技
术，通过转化 DＲEB类转录因子进行作物抗逆性改良，有着
广阔的前景，是今后抗性育种的重要方向。
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(下转第 4728页)
6274 安徽农业科学 2013 年
随着消毒时间的增加，外植体污染率降低，成活率升高，当消
毒时间为 11 min 时，成活率开始降低，为 73． 33%。
表 1 不同消毒时间对‘盛夏红酒’成活率的影响
消毒时间
min
处理
瓶数
污染数
个
污染率
%
成活数
个
成活率
%
8 45 21 46． 67 a 21 46． 67 c
9 45 16 35． 56 b 27 60． 00 d
10 45 8 17． 78 c 37 82． 22 a
11 45 9 20． 00 c 33 73． 33 b
注:同列不同小写字母表示差异显著(P ＜0． 05)，下同。
2． 2 不同浓度 6-BA对‘盛夏红酒’愈伤诱导的影响 由表
2可看出，‘盛夏红酒’在③号培养基上愈伤组织诱导率显著
高于其他 3 种培养基，愈伤组织诱导率最高，达 57． 14%。
①、②和④ 3 种培养基的愈伤组织诱导率差异不显著。因
此，‘盛夏红酒’初代培养最佳培养基为 MS + 6-BA 2． 0 mg /L
+ IBA 0． 2 mg /L。
表 2 不同培养基对‘盛夏红酒’愈伤诱导的影响
培养基
编号
接种数
个
成活数
个
愈伤块
数∥块
愈伤组织
诱导率∥%
① 30 22 7 31． 82 b
② 30 19 6 31． 57 b
③ 30 21 12 57． 14 a
④ 30 18 8 44． 44 b
2． 3 不同培养基对‘盛夏红酒’增殖的影响 将诱导出的愈
伤组织转入含不同激素配比的继代培养基中，1周后，淡黄色
的愈伤组织逐渐变绿，开始产生许多新生芽点。由表 3 可
知，‘盛夏红酒’在MS +6-BA 1． 5 mg /L + IBA 0． 2 mg /L培养
基上的繁殖系数最高，达 4． 9，且芽体健壮。因此确定 MS +
6-BA 1． 5 mg /L + IBA 0． 2 mg /L为最佳的增殖培养基。
表 3 不同浓度生长调节剂对‘盛夏红酒’继代培养的影响
增殖培养基 繁殖系数 不定芽生长状况
MS +6-BA 1． 5 mg /L + IBA 0． 2 mg /L 4． 9 叶翠绿，较健壮
MS +6-BA 2． 0 mg /L + IBA 0． 2 mg /L 3． 5 叶翠绿，苗弱
MS +6-BA 2． 5 mg /L + IBA 0． 2 mg /L 3． 0 叶翠绿，苗细，弱
2． 4 生根培养 从表 4可看出，NAA 0． 5 mg /L为‘盛夏红
酒’最适生根浓度，此时生根率、平均根数和平均根长度最
高，分别达 92． 5%、3． 35 条、3． 75 cm。当 NAA 的浓度超过
0． 5 mg /L时，生根率降低，因此最佳生根培养基为 1 /2MS +
NAA 0． 5 mg /L。
表 4 附加不同浓度生长调节剂对‘盛夏红酒’生根的影响
生根培
养基
接种数
个
生根
株数
条
生根率
%
每苗平
均根数
条
平均根
长度
cm
1 /2MS + NAA 0． 1 mg /L 80 60 75． 0 b 2． 45 3． 14
1 /2MS + NAA 0． 3 mg /L 80 62 77． 5 b 2． 87 3． 35
1 /2MS + NAA 0． 5 mg /L 80 74 92． 5 a 3． 35 3． 75
1 /2MS + NAA 0． 7 mg /L 80 56 70． 0 b 2． 55 2． 30
2． 5 炼苗和移栽 表 5结果表明，移栽苗在蛭石∶草炭体积
比1∶ 1基质中的成活率高于草炭和蛭石处理，达 95%，因此蛭
石∶草炭 =1∶ 1是最佳的移栽基质。
表 5 不同基质类型对‘盛夏红酒’出苗的影响
基质类型 出苗率∥% 死亡率∥%
草炭 90 10
蛭石 91 9
蛭石∶草炭 = 1∶ 1 95 5
3 结论
试验以大花萱草‘盛夏红酒’健壮花梗为外植体进行组
织培养，发现:0． 1%升汞消毒 10 min 是最佳的处理时间，成
活率为 82． 22%;初代培养最佳培养基为 MS + 6-BA 2． 0
mg /L + IBA 0． 2 mg /L;MS +6-BA 1． 5 mg /L + IBA 0． 2 mg /L
为最佳增殖培养基;1 /2MS + NAA 0． 5 mg /L是最佳生根培养
基，生根率达 92． 5%;移栽基质采用蛭石∶草炭 = 1∶ 1最好，成
活率高，达 95%。
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