全 文 ：书第 41卷 第 10期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol．41 No．10
2013年 10月 JOUＲNAL OF NOＲTHEAST FOＲESTＲY UNIVEＲSITY Oct． 2013
1)国家“863”项目(2011AA100201)和“十二五”科技支撑项目
(2012BAD01B0302)。
第一作者简介:王泽亮，男，1978年 12月生，北京林业大学生物
科学与技术学院，博士研究生;四川省林业科学研究院，助理研究员。
收稿日期:2012年 12月 16日。
责任编辑:潘 华。
河北杨 CBF类基因的克隆及其进化1)
王泽亮
(四川省林业科学研究院，成都，610081)
秦鹏飞 郭洪英 庄国庆 宋跃朋 安新民 张志毅
(宣汉县林业局) (四川省林业科学研究院) (林木育种国家工程实验室(北京林业大学) )
摘 要 CBF转录因子属于 AP2 /EＲEBP 转录因子家族，是植物特有的一类转录因子，在植物应对外界非
生物胁迫的过程中起了非常重要的作用。在前期克隆河北杨 PhCBF4a、PhCBF4b 基因的基础上，通过同源克隆
方法，从河北杨中继续分离出其它 CBF 类基因:PhDＲEB66、PhDＲEB67 － 1、PhDＲEB67 － 2、PhDＲEB68、
PhDＲEB69、PhDＲEB70。与 PhCBF4a、PhCBF4b基因相似，这 6 个基因包含 AP2 区域、核定位位点(NLS)以及
AP2区域侧翼的两个 CBF类基因所特有的基序。与相应毛果杨基因比对分析发现，这 8个河北杨基因可分为 3
个 Groups(旁系同源基因群) ，其中 2个各包括 3个基因，1个包含 2个基因，河北杨旁系同源基因及其与毛果杨
直系同源物之间在氨基酸水平上表现出了较高的序列一致性。进化分析结果显示，CBF 基因可分为真双子叶
植物分支与单子叶植物分支。真双子叶植物分支又可以分为 3 个分支，可分别由 3 个河北杨 CBF 旁系同源基
因群所代表，显示在从共同的双子叶祖先分离之前或分离过程中，杨树 CBF 基因经历了复制与趋异的进化过
程。PAML分析检测到 PhCBF4a基因在进化过程中承受了正向的选择压力，表明其在河北杨响应并适应外界
胁迫中的重要作用。表达分析结果显示河北杨 CBF 类基因能够应答干旱、低温、高温、盐及 ABA 胁迫，显示了
其在调控河北杨胁迫抗性中的作用。
关键词 河北杨;CBF;DＲEB;进化;胁迫
分类号 S792．119
Cloning and Evolution of CBF-like Genes in Populus hopeiensis /Wang Zeliang(Sichuan Academy of Forestry，Cheng-
du 610081，P． Ｒ． China) ;Qin Pengfei(Forestry Bureau of Xuanhan County) ;Guo Hongying，Zhuang Guoqing(Sichuan
Academy of Forestry) ;Song Yuepeng，An Xinmin，Zhang Zhiyi(National Engineering Laboratory for Tree Breeding，
NDＲC，Beijing Forestry University)/ / Journal of Northeast Forestry University．－2013，41(10)．－75～81
CBF transcription factor，belonging to AP2 /EＲEBP family and specific to plant，plays an important role in plant re-
sponse and adaptation to abiotic stress． Previously，PhCBF4a /4b genes were characterized from Populus hopeiensis． The
other six CBF-like genes，PhDＲEB66，PhDＲEB67-1，PhDＲEB67-2，PhDＲEB68，PhDＲEB69 and PhDＲEB70 were
cloned． Similar to PhCBF4a /4b，the cloned genes contain all conserved domains in other CBF transcription factor，such as
AP2 domain，nuclear location signals，the CBF signature sequences which bracket the AP2 domain，and the hydrophobic
clusters which contribute towards the total trans-activating potential of CBF． Eight CBF genes of P． hopeiensis were assigned
into three paralogous groups，two genes in one group and three genes in each of the other two． The paralogs and the genes
with their orthologs in P． trichocarpa show higher amino acid sequence identity． The phylogenetic analysis using known CBF
homologs reveals that all Eudicot CBF genes are separately clustered from Monocot CBF genes． The Eudicot CBF family
with three clades，represented by above three paralogous groups，shows that the Populus CBF genes are duplicated and di-
verged before or during speciation from the common Eudicot ancestor． Moreover，positive selection is detected in PhCBF4a
with PAML，and the expression profiles show that the CBF genes of P． hopeiensis can respond to drought，cold，heat，NaCl
and ABA stress． All these reveal their important roles responsive to environmental stresses in P． hopeiensis．
Keywords Populus hopeiensis;CBF;DＲEB;Evolution;Stress
在自然条件下，植物的生长发育受到干旱、低
温、盐碱等各种环境胁迫条件的影响，为了适应外界
的胁迫环境并维持自身的生长发育，植物已经从分
子、细胞及生理生化水平上进化出完整复杂的胁迫
响应机制。在分子水平上，外界的各种胁迫条件诱
导了植物一系列基因的表达，其表达产物不仅直接
提高了植物的胁迫耐受性，还可能进一步参与了植
物体内胁迫信号的转导过程。近年来，许多研究者
已经从各种植物中克隆到了一系列胁迫响应基因，
其中 CBF 类基因即是其中重要的一类，属于 AP2 /
EＲEBP 转录因子家族 DＲEB 亚家族 A－1 类转录因
子(即 CBF /DＲEB1)［1］。
自 Liu 等［2］与 Stockinger 等［3］从拟南芥中克隆
到 CBF转录因子之后，许多同源基因已经从小麦、
水稻、番茄、胡杨等单子叶与双子叶植物分离出
来［4－7］。通过分析其功能，研究者发现 CBF 转录因
子能够应答外界的环境胁迫并激活其下游一系列基
因的表达，而且过量表达 CBF 类基因能够提高转基
因植株对干旱、低温等胁迫的抗性。
河北杨(P． hopeiensis Hu et Chow)属杨柳科
(Salicacae)杨属(Populus L)白杨派(Section Leuce
Duby)树种，主要分布在我国西北与华北干旱半干
旱地区，具有抗旱、抗寒、耐瘠薄、根蘖性强等特性，
是优良的用材林与水土保持林树种［8］。在前期基
础上，本研究从河北杨中克隆了 6 个 CBF 类转录因
子，并对其进行了序列分析、系统发育及表达模式分
析，为进一步研究河北杨 CBF 类基因的功能及河北
杨胁迫耐受性机理奠定了基础。
1 材料与方法
1．1 试验材料与处理方法
选取河北杨幼嫩枝条，剪成小段流水冲洗干净
后，在超净工作台上用 75%乙醇浸泡 30 ～ 60 s，再用
0．1% HgCl2 溶液灭菌消毒 3～5 min，无菌水冲洗 3～5
次。剪去伤口后，将茎段接种于 MS+BA0．5 mg /L+
NAA0．1 mg /L 培养基上进行培养。培养室条件为
16 h冷荧光光照，温度为(25±1)℃。培养 5 ～ 7 周
后，选择长势良好的无菌材料在同样培养基上进行
继代培养。
选择生长健壮的扩繁无菌材料，剪成小段后接
种到 MS+IBA0．4 mg /L 培养基中，诱导获得河北杨
无菌生根苗。5～7 周后，选取长势良好且一致的生
根苗进行胁迫处理实验。河北杨组培苗干旱胁迫处
理参照 Pelah 等方法［9］。将 3 ～ 5 株生根无菌苗从
培养基中取出，置于 Parafilm 膜上使其自然失水至
原鲜重的 90%、80%、70%、50%(即分别失水 10%、
20%、30%、50%) ，后置于塑料袋中 3 h，对照则直接
置于塑料袋中 3 h。低温与高温处理，将生根苗转移
至 4 ℃或 37 ℃，分别处理 0、0．5、1、2、5、10、24 h。盐
胁迫与 ABA处理，将生根组培苗从培养基中取出，
分别在 250 μmol /L NaCl溶液与 100 μmol /L ABA溶
液中进行培养，处理 0、0．5、1、2、5、10、24 h。同时，
以水培养的生根苗作为对照。处理完成后，植物材
料于液氮速冻并保存于－70 ℃备用。
1．2 基因克隆
试验材料 ＲNA 提取、cDNA 合成及 CBF4a、
CBF4b基因克隆见 Wang［10］。河北杨其它 CBF 类基
因通过同源方法克隆:根据 NCBI 基因库相应的毛果
杨(P． trichocarpa)基因序列设计引物，以失水 30%的
植物材料的 cDNA 为模板进行 PCＲ 反应，电泳、切
胶、纯化回收后，与载体连接并转化、克隆、测序。
1．3 序列分析方法
普通序列分析工具为 DNAMAN5． 2． 2(Lynnon
Biosoft) ，引物设计利用 Primer5．0 设计。核苷酸或
氨基酸序列比对工具为 ClustalX1．83［11］。CBF 基因
AP2结构及其二级结构预测使用 PＲOSITE(Http:/ /
www． expasy． org /prosite)与 PredictProtein(Http:/ /
www．predictprotein． org /newwebsite / submit． php)在线
服务器。进化树构建使用 Phylip3． 69 软件包［12］。
适应性进化使用 PAML4．5［13］。使用的相关杨树序
列通过与毛果杨基因组数据(http:/ / genome．jgi－psf．
org /Poptr1 /Poptr1． home． html)与杨树 EST 数据库
(http:/ /www．populus．db．umu．se / index．html)Blast 分
析得到。
1．4 基因半定量表达分析
根据河北杨 CBF 类序列设计特异引物，使用
Takara公司 Ex Taq DNA 聚合酶体系进行(Takara，
Dalian，China)。20 μL 反应体系如下:13．25 μL 超
纯水，2．0 μL 10×缓冲液，2．0 μL 2．0 mmol /L dNTP，
0．8 μL 10 μmol /L引物，1 μL模板，0．15 μL Taq DNA
聚合酶。PCＲ 扩增程序:94 ℃，5 min;25 ～ 30 循环
(94 ℃，20 s;58 ℃，20 s;72 ℃，30 s) ;72 ℃，5 min。4
℃保存。通过琼脂糖凝胶电泳检测基因的表达变
化。杨树 ACTINII－like gene(Accession:EF145577)
作为内参基因。
2 结果与分析
2．1 河北杨 CBF类基因克隆与序列分析
在前期研究的基础上，根据 GenBank 数据库中
毛果杨 CBF类基因序列设计引物，从河北杨中克隆
了其它 6个 CBF类基因:PhDＲEB66、PhDＲEB67－1、
PhDＲEB67 － 2、PhDＲEB68、PhDＲEB69、PhDＲEB70
(Accession: KC344271、 KC344272、 KC344273、
KC344274、KC344275、KC344276) ，其命名顺序依据
相应的毛果杨基因命名(图 1)。这些基因的氨基酸
序列包含了其它 CBF类基因所特有的保守结构域，
如 AP2区域、核定位位点(NLS)以及 AP2 区域两侧
的两个 CBF类基因所特有的基序及 3’端的 LWSF
基序(图 2) ，因此这 6个新得到的基因为植物 AP2 /
EＲEBP 基因家族中的 CBF 类基因，加上前期获得
的 PhCBF4a、PhCBF4b 基因(Accession:EU862341、
EU862342) ，总共获得 8个河北杨 CBF基因。
图 1 河北杨 CBF类基因 PCＲ产物电泳图
67 东 北 林 业 大 学 学 报 第 41卷
I、II表示 CBF类基因特有的基序;双下划线表示可能的核定位位点;箭头与螺旋结构分别表示 β折叠片的 3条链与 α螺旋结构;星号与实心三
角表示与顺式作用原件结合中可能起重要作用的保守氨基酸残基;单上划线表示表示疏水域。
图 2 河北杨 CBF类基因氨基酸序列比对
同时，蛋白结构分析发现这 8 个 CBF 基因的
AP2结构域，形成了由 3 个反向平行的链组成的
折叠和 1 个兼亲性的螺旋结构，是与 CＲT /DＲE
顺式作用元件结合的区域［14］。在 AP2 区域，第 14
位的缬氨酸(V)与第 19 位的谷氨酸(E)被认为在
植物 DＲEB 亚家族与 DNA 顺式元件的特异性结合
中起了非常重要的作用［1］，这 2 个氨基酸残基在这
8个 CBF基因中均保守存在。同时研究［14－15］发现:
AP2区域有 12 个保守的氨基酸残基，在 AP2 区域
与 DNA顺式元件结合的过程中，可能起了非常重要
的作用，这些氨基酸残基(Ｒ3、G4、Ｒ6、Ｒ8、S /G10、
K12、E16、Ｒ18、Ｒ25、W27、T30、H41)在获得的 CBF
基因中大部分也同样保守存在，这些保守结构域与
保守的氨基酸残基显示获得的 CBF 基因能够与
CＲT /DＲE顺式元件结合。在 CBF 因子转录激活区
域，Wang等［16］发现 6 个疏水域(Hydrophobic clus-
ter，HC)的存在，并通过试验证实 HC2－5 正向调控
了转录因子的激活功能。在河北杨 CBF 类基因中，
除了 PhDＲEB67－1，其余基因均具有这 4 个疏水域，
暗示其能够激活下游基因的表达。
PhDＲEB67－1、PhDＲEB67－2 基因是由同一对
引物扩增的，只是在克隆测序过程中，得到了两个高
度类似的序列，在核苷酸水平上，其序列一致性达到
97．8%，只有 17 个不一致的单核苷酸突变及 2 个插
入缺失片段(3核苷酸与单核苷酸)。这些碱基的突
变导致 PhDＲEB67－1基因提前出现了终止密码子，
最终导致与 PhDＲEB67－2 相比，PhDＲEB67－1 基因
在 3’端转录激活区，缺失了 38 个氨基酸残基的片
段 (图 3)。同 PhCBF4a /4b 类 似，我 们 推 测
PhDＲEB67－1、PhDＲEB67－2也是 1对等位基因。
Tuskan 等［17］认为毛果杨 PtDＲEB66 /67 /68 基
因编码区包含内含子。经过序列比对分析，结果显
示 PhDＲEB66、PhDＲEB67 － 1、PhDＲEB67 － 2、
PhDＲEB68、PhDＲEB69、PhDＲEB70 基因至少在编码
区不包含内含子(扩增引物是在 5’与 3’非编码区
设计的，因此获得到基因包含完整的编码区，但不是
全长基因) ，尽管在推测的内含子两端为“GT···
AG”结构(图 4 显示 PhDＲEB66，其余未列)。我们
推测 Tuskan等是通过电子注释方法得到的毛果杨
PtDＲEB66 /67 /68基因。
2．2 河北杨 CBF类基因系统发育分析
利用 8 个河北杨 CBF 类基因序列筛选杨树
EST数据库，分别获得了 PhDＲEB69、PhCBF4a /4b
基因的同源序列:POPLAＲ．2402． C1、Q031D09。使
用河北杨、毛果杨 CBF 基因及 POPLAＲ．2402． C1、
Q031D09进行系统发育分析，结果发现:8 个河北杨
基因可分为 3 个 Groups(旁系同源基因群) ，其中 2
个 Group 各包括 3 个基因(分别包括 PhDＲEB66、
PhDＲEB67 － 1、PhDＲEB67 － 2 与 PhDＲEB70、Ph-
CBF4a、PhCBF4b) ，1个包含 2 个基因(PhDＲEB68、
PhDＲEB69) (图 5A)。对河北杨旁系同源基因及其
与毛果杨直系同源基因的序列一致性进行进一步比
对，结果如表 1所示:河北杨旁系同源基因在氨基酸
水平上表现出了较高的序列一致性(54%至 87%) ，
而且与毛果杨直系同源物之间的氨基酸序列一致性
更高(71%至 97%)。
77第 10期 王泽亮等:河北杨 CBF类基因的克隆及其进化
框形所示为 67－1基因提前出现的终止密码子。
图 3 河北杨 PhDＲEB67－1 /67－2基因核苷酸序列比对
箭头所示为起始与终止密码子;框形所示为内含子位置。
图 4 河北杨与毛果杨 DＲEB66基因核苷酸序列比对 PtDＲEB66g基因为基因组基因
表 1 河北杨 CBF类基因直系与旁系同源基因序列分析
基 因
P． hopeiensis P． trichocarpa
直系同源比对
编码区一致的
核苷酸比对 /%
配对长
度 /bp
一致的氨基
酸比对 /%
配对长
度 /aa
旁系同源比对
编码区一致的
核苷酸比对 /%
配对长
度 /bp
一致的氨基
酸比对 /%
配对长
度 /aa
毛果杨 EST数据库比对
匹配 ID
一致的核
苷酸 /%
配对长
度 /bp
PhDＲEB66 PtDＲEB66 74．11 873 71．28 289 91．22 885 70．55* 294*
PhDＲEB67－1 PtDＲEB67 73．61 864
PhDＲEB67－2 PtDＲEB67 74．45 861 73．43 286
PhDＲEB68 PtDＲEB68 81．90 768 79．22 255 63．44 782 54．86 257
PhDＲEB69 PtDＲEB69 95．55 696 94．37 231 POPLAＲ．2402．C1 94．00 946
PhDＲEB70 PtDＲEB70 97．14 768 97．65 255 90．31 774 87．42 257
PhCBF4a PtDＲEB71 97．99 747 97．18 248 Q031D09 98．00 806
PhCBF4b PtDＲEB71 96．12 747 95．56 248 Q031D09 94．00 805
注:* 表示是 PhDＲEB66与 PhDＲEB67－2比对结果。
利用 Phylip3．69 软件包，使用 JTT 氨基酸替代 模型，将杨树 CBF基因与 GenBank数据库下载的玉
87 东 北 林 业 大 学 学 报 第 41卷
米、水稻、大麦、葡萄、拟南芥、桉树、番茄、甘蓝型油
菜、荠菜等 CBF 基因进行系统发育分析，构建
Neighbor－Joining 树(图 5B) ，结果表明 CBF 类基因
分为单子叶与双子叶植物亚家族，各亚家族基因又
分为更小的类群。CBF 双子叶亚家族基因可以分
为 3个分支，可分别由河北杨旁系同源基因群所代
表，显示了在从共同的双子叶植物祖先分离(Speci-
ation)之前或分离过程中，杨树 CBF 基因即经历了
复制(Duplication)与趋异(Divergence)的过程。在
双子叶亚植物 CBF家族的 3 个分支中，PhDＲEB70、
PhCBF4a、PhCBF4b所在的分支(Clade2)包括了更
多类植物的 CBF基因，而且这一分支又可以分为更
小的亚分支(SubClade)。在 Clade2 分支中，CBF 基
因的分类，部分的平行于物种分类(Taxonomic classi-
fication) ，例如到目前为止，所有鉴定的荠菜与甘蓝型
油菜 CBF基因位于一个亚分支(SubClade2) ，而番茄
与马铃薯 CBF基因位于另一分支中(SubClade3) ，表
明部分 CBF基因是在物种或其祖先物种形成之后才
开始进行复制与趋异的进化过程。
图 5 CBF类基因系统发育分析
2．3 河北杨 CBF类基因进化分析
应用 Yang等［13］PAML(Phylogenetic Analysis by
Maximum Likelihood)软件包中的 Codeml 程序，采用
两种模式检测了河北杨 CBF基因适应性进化，并利
用 likelihood ratio(LＲ)统计方法来检验其适合度。
第一种模式是 Branch模式，比较 Free－ratio model与
One －ratio model;第二种模式是 Site模式，在这种模
式下，分别在密码子替代模型 M1a、M2a、M7 和 M8
下进行计算。在 Branch 模式下，包括全部基因序
列，2△l= 57．002，P = 7．9×10－8，结果符合 Free－ratio
model，可认为检测到河北杨 CBF 基因的某些分支
存在正向选择，即图 6A 所示 PhCBF4a 分支、
CBF4a /4b祖先分支与 DＲEB67－1 /67－2 祖先分支。
为了在分析中包括更多位点，排除 PhCBF4b 与
PhDＲEB67－1基因后，结果如图 6B 所示，结果仍显
示 PhCBF4a 基因分支，其 ω ＞ 1，即可以认为 Ph-
CBF4a基因在进化过程中承受了正向的选择压力。
在 Site model 下，在河北杨 CBF 类基因中没有检测
到正向选择的位点。
图 6 Free－ratio model PAML分析结果
97第 10期 王泽亮等:河北杨 CBF类基因的克隆及其进化
2．4 河北杨 CBF类基因表达模式分析
如图 7 所示，干旱条件下，PhDＲEB67 － 1、
PhDＲEB68 基因持续上调表达，PhDＲEB69 基因在
胁迫处理 30%时表达量最高，而后表达量降低，
PhDＲEB66、PhDＲEB67 － 2、PhDＲEB70 基因表达量
基本没有变化，也就是说其表达量不受干旱胁迫条
件的调控;在低温条件下，PhDＲEB66 基因仅有痕量
的表达，PhDＲEB67 － 1、PhDＲEB67 － 2、PhDＲEB68、
PhDＲEB69基因均上调表达，且在低温处理 2 h后表
达量最高，然后表达量下降，而 PhDＲEB70基因表达
模式与其余基因不同，其表达量先逐渐下降，至低温
处理 5 h后检测不到，而后表达量又逐渐开始增加;
在高温胁迫条件下，除了 PhDＲEB68 基因检测不到
表达外，其余河北杨 CBF类基因均上调表达，且在 5
或 10 h时表达量最高，而后表达量下降。以水培养
植 株 作 为 对 照，PhDＲEB66、PhDＲEB67 － 1、
PhDＲEB67－2、PhDＲEB68 在 NaCl 胁迫条件下能够
维持 较 稳 定 的 表 达 水 平;而 PhDＲEB67 － 2、
PhDＲEB68、PhDＲEB69在 ABA 处理 0．5 h 后表达水
平即到达最高，而后表达量缓慢降低，其中，
PhDＲEB67－2基因的表达量明显高于其余 2 个基
因，而且在 10 h 时也维持较高的水平。对于 Ph-
CBF4a /4b基因，干旱、低温处理能够较强的诱导其
表达，高温处理不能诱导表达［18］。
综上结果说明河北杨 CBF 类基因能够不同程
度的应答干旱、低温、高温胁迫，而且不同的 CBF 基
因可能主导了不同的胁迫信号转导途径。
图 7 河北杨 CBF类基因在胁迫条件下的表达模式
3 讨论
在前期克隆 PhCBF4a /4b 基因的基础上，通过
同源克隆方法，从河北杨中获得了其它 6 个 CBF 类
基因:PhDＲEB66、PhDＲEB67 － 1、PhDＲEB67 － 2、
PhDＲEB68、PhDＲEB69、PhDＲEB70。这些基因均包
含了其它 CBF 类基因所特有的保守结构域(AP2、
侧翼基序、NLS、LWSF) ，证实了其属于 CBF /DＲEB1
类基因。在 AP2区域，同 PhCBF4a /4b一致，这 6个
基因包含同样的保守氨基酸残基及形成基本一致的
二级结构，说明这些基因同样能与相应的 CＲT /DＲE
顺式作用原件结合。在河北杨 CBF 基因 3’转录激
活区，除了 PhDＲEB67－1 基因，其它几个新克隆的
基因均包括 4个正向调控激活功能的疏水域(HC2－
HC5) ，尽管在 HC5区域有氨基酸的缺失，但单个疏
水域的序列缺失被认为不会显著影响 CBF 基因的
转录激活作用［16］。的确，PhCBF4b基因同样在 HC5
区域有序列缺失，但是其同样可以激活下游基因的
表达，尽管其激活活性低于 PhCBF4a 基因［20］。由
于 PhDＲEB67－1基因缺失了 HC4与 HC5，其作为转
录因子的激活活性可能显著下降，甚至不具有激活
活性。
河北杨、毛果杨每 1个 CBF 类基因均存在其旁
系同源基因，这可能来源于最近一次的杨树基因组
08 东 北 林 业 大 学 学 报 第 41卷
复制事件［17］。而且，在杨树 EST 数据库，只筛选到
PhDＲEB69、PhCBF4a /4b 基因的同源序列，表明
DＲEB69、DＲEB71(CBF4a /4b)基因在杨树基因组中
被更多的转录，其功能可能相对保守或重要。
拟南芥基因组包含 6 个 CBF 类基因，CBF1－3
基因被认为主要参与了拟南芥低温胁迫响应过程，
而 CBF4 基因主要参与了干旱信号转导过程［19］。
而且，作用于 CBF /DＲEB1 基因的松弛选择压力
(Ｒelaxed Selection)被认为导致了其南方种源低温
耐受性降低［20］。在群体水平上，拟南芥 CBF2 基因
转录区与启动子区核苷酸多态性降低，表明其在进
化过程中经历了选择性清除作用(Selective Sweep) ，
而 CBF1与 CBF2基因启动子区分别经受了平衡选
择或中性选择作用，其转录激活区则包含显著的正
向选择位点［21］。与其进化驱动力相关联，在功能
上，AtCBF2基因能够逆向调控 CBF1 与 CBF3 基因
的表达，而 AtCBF1与 AtCBF3 基因则协同调控了类
似的下游基因的表达［22－23］。在河北杨 CBF 基因
中，尽管没有检测到正向选择位点，但在 Branch 模
型下，检测到 PhCBF4a 基因经历了正向的选择压
力，这可能显示了 PhCBF4a基因在河北杨响应并适
应外界胁迫中的重要作用。而且，在 CBF 基因系统
进化树上，PhCBF4a基因所在分支包含更多的 CBF
基因，进一步说明了这一类基因的重要性。同时，河
北杨 CBF 类基因能够不同程度的应答干旱、低温、
高温、盐及 ABA胁迫，而且不同的 CBF 基因可能主
导了不同的胁迫信号转导途径，其中，PhDＲEB70 基
因在低温胁迫中的表达模式明显与其它基因不同，
其是否同 AtCBF2基因一样，能够调控其它 CBF 类
基因，需要进一步确认。
本研究克隆了河北杨其它 6 个 CBF 类基因并
对其序列进行了分析鉴定，这些基因是否同 Ph-
CBF4a /4b基因一样能够激活下游基因的表达、如
何参与河北杨胁迫信号转导过程、其功能是否有差
异以及是否一定程度上导致了河北杨较强的抗逆
性，需要进一步的研究。
参 考 文 献
［1］ Sakuma Y，Liu Q，Dubouzet J G，et al． DNA-binding specificity
of the EＲF /AP2 domain of Arabidopsis DＲEBs，transcription fac-
tors involved in dehydration-and cold-inducible gene expression
［J］． Biochem Biophys Ｒes Commun，2002，290(3) :998－1009．
［2］ Liu Q，Sakuma Y，Abe H，et al． Two transcription factors，
DＲEB1 and DＲEB2，with an EＲEBP /AP2 DNA binding domain，
separate two cellular signal transduction pathways in drought-and
low temperature-responsive gene expression，respectively，in Ara-
bidopsis［J］． Plant Cell，1998，10(8) :1391－1406．
［3］ Stockinger E J，Gilmour S J，Thomashow M F． Arabidopsis thali-
ana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional acti-
vator that binds to the C-repeat /DＲE，a cis-acting DNA regulatory
element that stimulates transcription in response to low temperature
and water deficit［J］． Proc Natl Acad Sci USA，1997，94(3) :1035
－1040．
［4］ Shen Y G，Zhang W K，He S J，et al． An EＲEBP /AP2-type pro-
tein in Triticum aestivum was a DＲE-binding transcription factor
induced by cold，dehydration and ABA stress［J］． Theor Appl
Genet，2003，106(5) :923－930．
［5］ Dubouzet J G，Sakuma Y，Ito Y，et al． OsDＲEB genes in rice，
Oryza sativa L，encode transcription activators that function in
drought-，high-salt-and cold-responsive gene expression［J］． Plant
J，2003，33(4) :751－763．
［6］ Jaglo K Ｒ，KleV S，Amundsen K L，et al． Components of the Ara-
bidopsis C-repeat /dehydration-responsive element binding factor
cold-response pathway are conserved in Brassica napus and other
plant species［J］． Plant Physiol，2001，127(3) :910－917．
［7］ Chen J H，Xia X L，Yin W L． Expression profiling and functional
characterization of a DＲEB2-type gene from Populus euphratica
［J］． Biochem Biophys Ｒes Commun，2009，378(3) :483－487．
［8］ 徐纬英．杨树［M］．哈尔滨:黑龙江人民出版社，1988:36－38．
［9］ Pelah D，Wang W X，Altman A，et al． Differential accumulation
of water-related proteins，sucrose synthase and soluble sugars in
Populus species that differ in their water stress response［J］． Phys-
iol Plant，1997，99(1) :153－159．
［10］ Wang Z L，An X M，Li B，et al． Identification and characteriza-
tion of CBF /DＲEB1-related genes in Populus hopeiensis［J］．
Forestry studies in China，2008，10(3) :143－148．
［11］ Thompson J D，Gibson T J，Plewniak F，et al． The ClustalX
windows interface:flexible strategies for multiple sequence align-
ment aided by quality analysis tools［J］． Nucleic Acids Ｒes，
1997，25(24) :4876－4882．
［12］ Felsenstein J． PHYLIP manual，version 3．2［M］． California:U-
niversity of California Herbarium，1989．
［13］ Yang Z． PAML4:Phylogenetic analysis by maximum likelihood
［J］． Mol Biol Evol，2007，24(8) :1586－1591．
［14］ Allen M D，Yamasaki K，Ohme-Takagi M，et al． A novel mode
of DNA recognition by a beta-sheet revealed by the solution struc-
ture of the GCC-box binding domain in complex with DNA［J］．
EMBO J，1998，17(18) :5484－5496．
［15］ Latini A，Ｒasi C，Sperandei M，et al． Identification of a DＲEB-
related gene in Triticum durum and its expression under water
stress conditions［J］． Ann Appl Biol，2007，150(2) :187－195．
［16］ Wang Z，Triezenberg S J，Thomashow M F，et al． Multiple hy-
drophobic motifs in Arabidopsis CBF1 COOH-terminus provide
functional redundancy in transactivation［J］． Plant Mol Biol，
2005，58(4) :543－559．
［17］ Tuskan G A，DiFazio S，Jansson S，et al． The genome of black
cottonwood，populus trichocarpa (Torr． ＆ Gray) ［J］． Science，
2006，313:1596－1604．
［18］ 王泽亮．河北杨干旱胁迫响应基因的分离与鉴定［D］．北京:
北京林业大学，2009．
［19］ Haake V，Cook D，Ｒiechmann J L，et al． Transcription factor
CBF4 is a regulator of drought adaptation in Arabidopsis［J］．
Plant Physiol，2002，130(2) :639－648．
［20］ Zhen Y，Ungerer M C． Ｒelaxed selection on the CBF /DＲEB1
regulatory genes and reduced freezing tolerance in the southern
range of Arabidopsis thaliana［J］． Mol Biol Evol，2008，25(12) :
2547－2555．
［21］ Lin Y H，Hwang S Y，Hsu P Y，et al． Molecular population ge-
netics and gene expression analysis of duplicated CBF genes of
Arabidopsis thaliana［J］． BMC Plant Biol，2008，8:111．
［22］ Novillo F，Alonso J M，Ecker J Ｒ，et al． CBF2 /DＲEB1C is a
negative regulator of CBF1 /DＲEB1B and CBF3 /DＲEB1A ex-
pression and plays a central role in stress tolerance in Arabidopsis
［J］． Proc Natl Acad Sci USA，2004，101(11) :3985－3990．
［23］ Novillo F，Medina J，Salinas J． Arabidopsis CBF1 and CBF3
have a different function than CBF2 in cold acclimation and de-
fine different gene classes in the CBF regulon［J］． Proc Natl
Acad Sci USA，2007，104(52) :21002－21007．
18第 10期 王泽亮等:河北杨 CBF类基因的克隆及其进化