全 文 ：2009 年总第 41 卷第 12 期
痛风是长期嘌呤代谢紊乱或尿酸排泄减少所引起的一种
常见疾病， 现代研究发现以黄嘌呤氧化酶为作用靶点的抑制
剂具有很好的抗痛风应用前景。 目前临床上常用的黄嘌呤氧
化酶抑制剂只有别嘌呤醇，但其副作用较大，尤其是别嘌呤醇
过敏综合征可能导致死亡的潜在发生，严重影响痛风的治疗。
因此， 在天然药物中寻找高效低毒的黄嘌呤氧化酶抑制剂有
着非常重要的意义。 买麻藤为买麻藤科植物买麻藤或小叶买
麻藤的干燥藤茎，主要分布于两广、云南、海南、福建等地，有
平喘、抗过敏、抗蛇毒等药理作用，主要含有茋类、生物碱、挥
发油、黄酮等类化合物，以茋类化合物如白藜芦醇、异丹叶大
黄素及其低聚体和苷类含量最高 [1-2]。近年来大量的研究表明，
以异丹叶大黄素、 白藜芦醇为代表的茋类化合物具有广泛的
生物活性，如扩张毛细血管、改善微循环、降血脂、降血糖、抗
肿瘤、抑制过敏反应、调控机体免疫防御系统、抗血栓以及抗
氧化等作用。我们在研究中发现，买麻藤对黄嘌呤氧化酶具有
较强的抑制作用，现报道如下。
1 仪器与试药
岛津 UV-2401 型紫外分光光度计 ，Sartorius BP-211D
型电子天平 ，R-201 旋转蒸发器 ，876A-2 型数显真空干燥
箱。 买麻藤购于安徽省亳州药材公司；买麻藤水提物：买麻藤
药材加适量水煎煮 2 次，减压浓缩干燥即得。 买麻藤总茋提
取物：买麻藤药材乙醇回流提取，减压回收溶剂，经大孔树脂
纯化后 ， 减压浓缩真空干燥即得 。 白藜芦醇苷 （111575-
200502）购于中国药品生物制品检定所。 黄嘌呤、黄嘌呤氧化
酶、二甲基亚枫购自 Sigma 公司；磷酸二氢钾、磷酸氢二钾均
为分析纯。
2 实验方法
2.1 溶液配制 缓冲液 ： 取 K2HPO4·3H2O 19.48g、KH2PO4
1.99g， 溶于 500mL 蒸馏水， 配成 0.2mol/L 磷酸盐缓冲溶液
（pH7.5）。 酶溶液 ： 取黄嘌呤氧化酶 5U， 用缓冲液稀释至
100mL，浓度为 50U/L，4℃保存。 底物溶液：取 25.1mg 黄嘌呤
溶于 250mL 水，得 0.66mmol/L 底物溶液。 样品和阳性对照溶
液：精密称取样品买麻藤水提物、买麻藤总茋提取物、白藜芦
醇苷（作为阳性对照），分别用二甲基亚砜（DMSO）溶解，得到
不同浓度的溶液， 使用时根据情况稀释 （DMSO 最终浓度<
1%）。
2.2 酶活测定原理 黄嘌呤在黄嘌呤氧化酶的催化作用下
生成尿酸， 产物尿酸在 290nm 处有特征吸收峰， 以每分钟
290nm 处吸光度的增加来计算酶活力。酶活性单位定义：在本
实验条件下黄嘌呤氧化酶与黄嘌呤作用后 ， 每分钟催化
1μmol 黄嘌呤转化为尿酸的酶量为 1 个活性单位（U/L）。
2.3 酶促反应米氏方程的绘制 实验体系中黄嘌呤采用
35.0，87.5，175.0，262.5，350.0μmol/L 5 个浓度， 黄嘌呤氧化
酶浓度为 50U/L。 在试管中加入 2mL 不同浓度的黄嘌呤溶
液，25℃预温 10min，再加入经 25℃预温的黄嘌呤氧化酶溶液
1mL，涡旋混匀，在紫外 290nm 处测定不同时间点反应体系
的吸光度值，每分钟测定 1 次，连续测定 15min，以时间与吸
光度进行线形回归，得各浓度黄嘌呤溶液的反应速度 V。 再
以 1/V 对 1/[S]作图，即反应速度和底物浓度的双倒数图，绘
制酶促反应米氏方程。
2.4 黄嘌呤氧化酶（XOD）抑制实验[3]
2.4.1 酶活力测定 在试管中加入 2.0mL 底物溶液，25℃预
温 10min，加入缓冲溶液 0.1mL，再加入经 25℃预温的酶溶液
1.0mL，涡旋混匀，用分光光度计测 290nm 处不同时间点反应
体系的吸光度值，每分钟测定 1 次，连续测定 15min，以时间
与吸光度进行线形回归，计算斜率 Rate 酶（dA/min）。 每个样
品平行操作 3 次，取斜率平均值。
2.4.2 样品测定 在试管中加入 2.0mL 底物溶液，25℃预温
10min，加入不同浓度样品溶液 0.1mL，再加入经 25℃预温的
酶溶液 1.0mL，涡旋混匀，同法测定吸光度值，以时间与吸光
度进行线形回归，计算斜率 Rate 样（dA/min）。
2.4.3 空白对照 重复 2.4.2 步骤 ，不加样品和 XOD，但加
0.1mL 的 DMSO 和 1.0mL 缓冲液 ， 记录吸光度的变化 ，得
Rate 空白 （dA/min），作为空白对照 ，计算抑制率时将它扣
除。
2.4.4 半数抑制浓度 IC50 的计算 酶促反应中的药物浓度
C=C0×0.1/3.1，C0是样品溶液浓度；抑制率 I=（Rate 酶－Rate 样
品）/（Rate 酶－Rate 空白）×100%。 将药物浓度与抑制率进行回
买麻藤提取物抑制黄嘌呤氧化酶活性实验研究
杨琴芳 1 袁红宇 2 钱雅璐 2
（1.南京中医药大学，江苏南京 210029； 2.南京医科大学第一附属医院，江苏南京 210029）
摘 要 目的：寻找买麻藤抑制黄嘌呤氧化酶的活性部位。 方法：采用黄嘌呤氧化酶体外抑制实验测定买麻藤水提物
和总茋提取物的半数抑制浓度 IC50。 结果：买麻藤水提物和总茋提取物对黄嘌呤氧化酶都有明显的抑制作用，其半数抑制
浓度 IC50分别为 254.4、26.8μg/mL。 结论：买麻藤总茋提取物半数抑制浓度较买麻藤水提物低 10 倍左右，推测买麻藤对黄
嘌呤氧化酶抑制作用主要源于其中的茋类化合物。
关键词 买麻藤 总茋提取物 黄嘌呤氧化酶
中图分类号 R282.710.5 文献标识码 A 文章编号 1672-397X（2009）12-0077-02
实 验 研 究
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归，得回归方程。 根据方程计算抑制率 I=50%时 C 的值，即半
数抑制浓度 IC50。
3 实验结果
3.1 酶促反应米氏方程 将测得的 5 种不同浓度黄嘌呤在
15min 内各时间点反应体系的吸光度，与时间进行线形回归，
得各浓度黄嘌呤溶液反应的线形方程， 其斜率减去空白对照
斜率则为该浓度黄嘌呤的反应速度 V， 将反应速度和黄嘌呤
浓度进行双倒数变换，并以 1/V 对 1/[S]进行线形回归，得米氏
方程为 1/V=20.176/[S]+313.91。根据米氏方程 1/V=（Km/Vm）/[S]
+1/Vm， 由图得到 ：Km/Vm=20.176，1/Vm=213.91×10-3。 即 Vm=
4.675 Km=94.3μmol/L。 见表 1，图 1。
表 1 黄嘌呤浓度与反应速度关系
350.0 2.86 0.0045 222.2
87.5 11.43 0.0020 500.0
35.0 28.57 0.0013 769.2
黄嘌呤浓度（μmol/L） 1/[S]（×10-3） V 1/V
262.5 3.81 0.0036 277.8
175.0 5.71 0.0028 357.1
图 1 1/V 与1/[S]关系图
3.2 样品对黄嘌呤氧化酶的抑制作用 各浓度买麻藤水提
物（A）、买麻藤总茋提取物（B）及阳性对照白藜芦醇苷（C）对
黄嘌呤氧化酶的抑制率分别见表 2。 将各样品终浓度与平均
抑制率进行线形回归，得回归方程，并根据方程计算抑制率 I=
50%时 C 的值，即半数抑制浓度 IC50，结果见表 3。
表 2 各样品对黄嘌呤氧化酶抑制作用实验结果（n=3）
280.96 48.6±6.5 73.5±18.6
140.48 44.1±13.4 58.1±4.3
25.7±16.2
A终浓度
（μg/mL）
抑制率
（x±s，%）
抑制率
（x±s，%）
44.84 65.9±6.1 7.26
22.42 49.7±12.9 3.63
0.23
B 终浓度
（μg/mL）
抑制率
（x±s，%）
C 终浓度
（μg/mL）
70.24 29.0±3.4 50.2±4.011.21 41.4±19.8 1.81
35.12 23.3±12.1 5.60 24.2±18.0 0.91 44.6±4.6
17.56 10.3±6.8 2.80 18.3±8.8 0.45 30.4±17.4
表 3 样品终浓度与平均抑制率的回归方程及半数抑制浓度结果
A Y=0.1301X+16.906 254.4
B Y=1.0728X+21.296 26.8
C Y=6.1447X+32.436 2.9
样品 回归方程 IC50（μg/mL）
4 讨论
实验结果可以看出，样品买麻藤水提物（A）、买麻藤总茋
提取物（B）对黄嘌呤氧化酶都有明显的抑制作用，其半数抑制
浓度 IC50分别为 254.4、26.8μg/mL，买麻藤总茋提取物半数抑
制浓度较买麻藤水提物低 10 倍左右，表明买麻藤提取液通过
大孔树脂纯化后药效可以显著增强， 也从药效角度证明了纯
化工艺的合理性。 另外我们选用了茋类化合物的单体白藜芦
醇苷作为阳性对照， 结果发现白藜芦醇苷对黄嘌呤氧化酶抑
制活性更强，IC50达到 2.9μg/mL。 这也在一定程度上证实了我
们的猜测， 买麻藤对黄嘌呤氧化酶抑制作用主要源于其中的
茋类化合物成分。
在酶促反应体系中， 底物黄嘌呤的浓度主要取决于米氏
常数，根据经验，底物黄嘌呤浓度应在 Km的 10 倍左右，主要
目的是为保证底物在反应过程中足量。 但我们在配制底物溶
液时发现当黄嘌呤浓度大于 0.7mmol/L 时， 黄嘌呤不能完全
溶解，因此我们选用底物浓度为 0.66mmol/L，已基本达到饱和
状态。 在实验过程中我们发现，15min 内酶促反应过程呈较好
的线形关系，也表明该时间段底物黄嘌呤量是充足的。
一般酶促反应对温度比较敏感， 大多选择在 37℃酶活性
最强时进行。 但我们在预实验过程中发现，37℃时酶促反应速
度很快，吸光度的变化与时间线形关系较差，且因为测定时温
度容易产生变化，导致数据波动明显，误差较大。因此，在本实
验中我们选择了比较接近室温的 25℃作为反应温度体系，虽
然酶活性减弱，但反应温和，吸光度的变化与时间线性关系良
好，且不会因为温度急剧变化而导致测定误差。
5 参考文献
[1] 国家中医药管理局《中华本草》编委会.中华本草（第二卷）.上海：
科学技术出版社，1999：358
[2] 丁永胜，何丽一.薄层荧光扫描法测定小叶买麻藤等植物中茋类
化合物含量.药学学报，2000，35（6）：454
[3] 朱田密，陈科力，黎莉，等.垫状卷柏中双黄酮抑制黄嘌呤氧化酶
的活性研究.中药药理与临床，2007，23（4）：33
第一作者：杨琴芳（1971-），本科学历，主管中药师，中药
制药学专业。
通讯作者：袁红宇，hyyuan2002@sohu.com
收稿日期：2009-08-10
编辑：吴 宁
实 验 研 究
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