全 文 ：·论　著·
欧芹素乙对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用
李铁军 ,徐添颖 ,芮耀诚* ,邱　彦 ,张　黎 ,杨鹏远
(第二军医大学药学院药理学教研室 ,上海 200433)
[摘要 ]　目的: 观察欧芹素乙 ( imper ato rin, IM P)对大鼠脑缺血再灌注损伤的作用和对缺氧 /复氧诱导人脐静脉内皮细胞
ECV 304凋亡的影响。 方法:栓线法阻断大脑中动脉建立大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤模型 ;以 Longa 5分制评分标准对实
验大鼠作行为评分 ,以图像分析仪测算实验鼠大脑梗死面积 ,细胞凋亡采用碘化丙啶染色方法 ,流式细胞术检测 ECV304细
胞的凋亡。 结果: IM P可显著减轻脑缺血再灌注损伤大鼠的神经损伤症状 (行为评分 ) ,缩小脑梗死面积 ; IMP可剂量依赖性
降低缺氧 /复氧引起的 ECV304细胞的凋亡。 结论: IMP对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤有明显的保护作用 ; IM P降低缺
氧 /复氧引起的内皮细胞凋亡是其保护机制之一。
[关键词 ]　欧芹素乙 ;脑缺血 ;再灌注损伤 ;内皮细胞 ;细胞凋亡
[中图分类号 ]　 R 282. 7　　　 [文献标识码 ]　 A　　　 [文章编号 ]　 0258-879X ( 2004) 04-0431-03
Protective effects of imperatorin on rat cerebral ischemia /reperfusion injury
LI Tie-Jun, XU Tian-Ying , RUI Yao-Cheng* , Q IU Yan, ZHANG Li, YANG Peng-Yuan ( Depar tment o f Pha rmaco log y ,
Sch oo l o f Pharmacy, Second M ilitary Medical Univ er sity , Shanghai 200433, China )
[ABSTRACT ]　 Objective: T o study the effects o f imperato rin ( IM P) on ra t cer ebral ischemia /r eper fusion injury and on apop-
to sis of human umbilical v ein endo thelial cell line ECV304 induced by hypoxia /r eoxygenation. Methods: Focal ce rebral is-
chemia /pe rfusion injur y in rats was made by middle cerebra l ar tery o cclusion( MCAO) achiev ed by passing a nylon th read into
the inte rna l car otid ar ter y. Apopto sis o f ECV 304 was measured by propidium iodide stain and flow cy tometry. Results: IMP
significantly reduced the behavio r sco re and infarction a rea of cerebral ischemia /reperfusion in rats, and decr eased apoptosis of
ECV 304 induced by hypoxia /reo xygenation in a do se-dependent manner. Conclusion: IM P possesses the pro tectiv e effects on
ra t focal cer ebral ischemia /r epe rfusion injur y, and reducing apopto sis of endo th elia l cells induced by hypox ia /r eo xygena tion is
one o f the mechanisms o f its pro tectiv e effects.
[KEY WORDS]　 imperato rin; cerebr al ischemia; r epe rfusion injury; endo thelia l cell; apoptosis
[ Acad J Sec M il M ed Univ , 2004, 25( 4): 431-433 ]

　 欧芹素乙 ( impera to rin, IM P)属于香豆素类化
合物 ,为中药前胡、白芷、羌活根部的有效成分 ,具有
镇静、抗炎、抗菌、抗诱变等作用 ,还能抑制由二磷酸
腺苷 ( ADP)、花生四烯酸 ( AA)、血小板活化因子
( PAF)诱导的兔血小板聚集 ,拮抗肿瘤坏死因子
( TN F)、白细胞介素 1( IL-1)对培养脑血管平滑肌
细胞的促增殖作用 ,拮抗 TNF促进牛脑微血管内
皮细胞与单核细胞黏附作用 [1 ] ,提示 IM P可能具有
防治心脑血管疾病的作用。近年研究 [ 2 ]发现细胞凋
亡参与多种心脑血管疾病的病理过程 ,在多种脑缺
血模型中均有细胞凋亡现象存在。本实验研究 IM P
对在体脑缺血损伤的保护作用 ,并在细胞模型上模
拟缺血再灌注损伤 ,观察缺氧 /复氧对内皮细胞凋亡
的影响及 IM P的作用 ,初步探讨其脑缺血保护的作
用机制。
1　材料和方法
1. 1　实验动物　 Sprague-Daw ley大鼠 ,雄性 , 8周
龄 ,体质量 230～ 250 g ,由中国科学院上海分院动物
中心提供。
1. 2　药品及试剂　 IM P由本院天然药物化学教研
室陈海生教授提供 ,纯度> 95%。 尼莫地平 (上海信
谊药厂 ,批号 E990501,规格: 20 mg /片 )。 Eag le
MEM培养基 ( Gibco公司 ) ,新生小牛血清 (上海华
美生物工程公司 ) ,胰蛋白酶 ( Gibco公司 ) ,碘化丙
啶、 RNase A (上海生物技术有限公司 ) ,肝素稀释
液 (长海医院 ,生产批号 020816,规格 2 ml∶ 2 500
U ) ,水合氯醛 (分析纯 ,中国医药上海化学试剂公
司 )。
1. 3　细胞培养　人脐静脉内皮细胞株 ECV 304购
自中国科学院上海分院细胞研究所。细胞用含 10%
新生小牛血清的 MEM培养液培养 ,当细胞长成致
·431·第 二 军 医 大 学 学 报Acad J Sec Mil Med Univ　 2004 Apr; 25( 4)
[基金项目 ]　上海市联合利华基金 ( 2003) .
[作者简介 ]　李铁军 ( 1971-) ,男 (汉族 ) ,博士生 ,讲师 .
* Corresponding auth or. E-mai l: ycrui@ smm u. edu. cn
密单层后 ,传代培养。培养的内皮细胞长成均匀致密
单层后换无血清培养基 ,静息 24 h后备用。
1. 4　内皮细胞缺氧 /复氧 [3 ]　正常 MEM培养基用
95% N2和 5% CO2混合气体平衡 30 min后 ,获得缺
氧培养基。培养板 (或培养瓶 )加缺氧培养基后 ,置于
缺氧仓内 (持续通入 95% N2和 5% CO2混合气体维
持缺氧环境 ) , 37℃孵育一定时间 (缺氧时间 ) ,立即
更换正常 MEM培养基再孵育一定时间 (复氧时
间 )。 将培养的 ECV304细胞随机分为 3组:
ECV304正常对照组 ( A组 ) ,缺氧 /复氧培养组 ( B
组 ) ,缺氧 /复氧与药物共孵育培养组 ( C组 , IM P的
质量浓度分别为 10- 8、 10- 7、 10- 6 g /L)。
1. 5　凋亡细胞检测 [4 ]　处理后 ECV304倾去上清
后 ,用 D-hank液洗 2次 ,将细胞分别用 0. 125%的
胰酶消化 ,收集细胞悬液 , 1 000× g离心 15 min,
4℃ PBS洗 2次 ,细胞用 70%的预冷乙醇固定过夜。
测定前再用 4℃ PBS洗 2次 ,加入质量浓度为 50
mg /L RNase A+ 50 mg /L碘化丙啶共同染色 , 4℃
避光放置 60 min。 将细胞悬液混匀 ,流式细胞仪检
测 (激发光波长 420 nm )。应用 Cell Quest软件获取
细胞 10 000个 ,进行凋亡细胞记数并绘制 DN A分
布图。
1. 6　大鼠局灶性脑缺血再灌注模型 [5 ]　将大鼠用
水合氯醛腹腔注射麻醉。分离右侧颈内动脉和翼颚
动脉 ,根部结扎该分枝。颈总动脉分叉处切口 ,插入
栓线 (直径为 0. 22 mm)进入颈内动脉 ,入颅至大脑
前动脉 ,阻断大脑中动脉血流来源。 缺血时灌胃
IM P(剂量为 10、 30 mg /kg )和尼莫地平片 ( 25. 0
mg /kg ) ;模型组和假手术组给生理盐水 ;假手术组
除不插线外 ,其余步骤同上。 缺血 2 h后再灌注 ,不
需再次麻醉和切开皮肤 ,轻轻提拉所留线头至颈总
动脉切口处 ,血流再通。存活鼠再灌注 24 h后 ,观察
大鼠行为变化并进行行为评分。参考 Longa等 [6 ]的
5分制评分标准: 0分 ,正常 ,无神经损伤症状 ; 1分 ,
不能完全伸展对侧前爪 ; 2分 ,向外侧转圈 ; 3分 ,向
对侧倾倒 ; 4分 ,不能自发行走 ,意识丧失。然后快速
断头取鼠大脑 ,在前连合平面切下厚约 2 mm冠状
脑片 ,立刻置于 2%硝基四唑盐溶液中 , 37℃孵育 30
min。梗死区呈现白色 ,非梗死区呈现红色。用求积
仪 ( C63图像分析系统 )测出各区面积 ,并计算梗死
区占整个冠面的百分比 (% )。
1. 7　统计学处理　实验数据用 x-± s表示 ,进行方
差分析。
2　结　果
2. 1　 IM P对缺氧 /复氧诱导 ECV 304细胞凋亡的
影响　缺氧 /复氧时间延长 , ECV 304细胞凋亡百分
率逐渐增加 ,缺氧 8 h /复氧 8 h和缺氧 14 h /复氧 24
h引起 ECV304凋亡率分别为 ( 15. 89± 3. 64)%和
( 28. 96± 1. 73)% ,两者有非常显著差异 (n= 3, P <
0. 01)。IM P( 10- 8、 10- 7、 10- 6 g /L )可非常显著地降
低缺氧 14 h /复氧 24 h引起的 ECV 304凋亡率
(n= 3, P < 0. 01) ,由 ( 28. 96± 1. 73)%分别降低到
( 11. 37± 0. 56)%、 ( 9. 85± 0. 32)% 、 ( 6. 16±
4. 88)%。缺氧 14 h /复氧 24 h使 S期细胞所占的比
例显著降低 ( P < 0. 01) ,由 ( 34. 70± 10. 28)%降低
到 ( 3. 29± 4. 06)% ; 10- 8 g /L IM P可升高缺氧 /复
氧降低的 S期细胞所占比例 [ ( 10. 03± 2. 23)% ],
IM P ( 10- 7、 10- 6g /L)可显著升高缺氧 /复氧降低的
S期 细胞 比 例 [ ( 34. 83± 1. 86 )% , ( 40. 35±
4. 25)% ,n= 3, P < 0. 01 ]。
2. 2　 IM P对大鼠局灶性脑缺血再灌注损伤的影
响　假手术组大鼠全部存活 ,缺血对照组大鼠存活
率为 71. 4% , IM P 2个剂量 ( 10、 30 mg /kg )组大鼠
存活率分别为 76. 9%和 90. 9% ,阳性对照尼莫地平
组大鼠存活率为 83. 3% 。假手术组大鼠均无异常症
状。 缺血对照组的部分大鼠出现不能完全伸展对侧
前爪或向外侧转圈或向对侧倾倒的神经损伤症状 ,
行为评分为 ( 2. 5± 0. 7)。 IM P 2个剂量 ( 10、 30 mg /
kg )组行为评分均显著降低 ,分别为 ( 0. 5± 0. 5)及
( 0. 3± 0. 5) ,同溶剂对照组比较有显著性差异 (n=
10,P < 0. 01) ,且降低程度有剂量依赖关系。阳性对
照尼莫地平组行为评分为 ( 0. 7± 0. 7) ,低于溶剂对
照组 (n= 10,P < 0. 05)。假手术组脑组织无梗死 ,缺
血对照组缺血侧脑组织有梗死现象 ,前连合冠状脑
片梗死区占整个冠面的 ( 36. 68± 9. 83)% , IM P的 2
个剂量 ( 10、 30 mg /kg)组和阳性对照尼莫地平组均
可显著缩小缺血侧脑组织梗死面积 [ ( 11. 62±
6. 35)% , ( 6. 05± 2. 37)% , ( 13. 58± 4. 77)% ],与缺
血对照组相比有显著性差异 (n= 10, P < 0. 01)。
3　讨　论
缺氧引起内皮细胞死亡中 , 35%～ 50%是源于
细胞凋亡 ,说明内皮细胞凋亡是引起内皮功能障碍
的一个重要因素。缺氧通过加速内皮细胞凋亡 ,破坏
内皮结构 ,使内皮功能出现异常 ,导致血管痉挛、血
小板聚集、血栓形成甚至血管阻塞 ,尤其在临床心脑
血管疾病的发生发展中具有重要作用。
晋军等 [3 ]报道缺氧可诱导内皮细胞的凋亡 ,并
且随着缺氧时间延长凋亡细胞百分率逐渐增加。 本
实验应用离体培养内皮细胞缺氧模型 ,观察缺氧 /复
·432· 第二军医大学学报　 2004年 4月 ,第 25卷
氧对内皮细胞的影响以及 IM P的保护作用 ,结果发
现不同缺氧 /复氧时间对内皮细胞凋亡具有不同影
响 ,且随着缺氧时间的延长其凋亡率逐渐升高 ,说明
缺氧对内皮细胞凋亡的促发作用随着缺氧时间的延
长而加重 ;在 IM P与内皮细胞共孵育的情况下 ,内
皮细胞在缺氧 /复氧状态下的细胞凋亡率明显低于
单纯缺氧 /复氧时的细胞凋亡率 ,表明 IM P对缺氧 /
复氧诱导的内皮细胞凋亡具有明显的抑制作用。
IM P还能提高 G2 -M期和 S期的细胞百分率 ,促进
细胞增殖 ,提示 IM P通过抑制内皮细胞在缺氧状态
下的凋亡 ,通过调节细胞增殖与更新间的平衡维持
组织器官正常的生理功能及细胞数量的稳定 ,因而
使其具有对受损内皮细胞的保护作用 [ 7, 8]。 IM P具
有拮抗 TN F促进牛脑微血管内皮细胞与单核细胞
黏附作用 [1 ] ,实验结果表明 IM P对大鼠脑缺血再灌
注损伤有保护作用 , IM P可抑制缺氧 /复氧诱导的
内皮细胞凋亡是其保护机制之一。
[参 考 文 献 ]
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[收稿日期 ]　 2003-09-17　　 [修回日期 ]　 2004-02-11
[本文编辑 ]　尹　茶
Eff ects of glucose-insulin-potassium on baroreflex sensitivity, left ventricular f unction and ventricular ar-
rhythmia in the subacute phase of myocardial infarction in rats
LIU Jian-Guo , SHU He, SHEN Fu-Ming , M IAO Chao-Yu, SU Ding-Feng ( Depar tment o f Pharmaco lo g y, Co lleg e of Ba sic Med-
ical Sciences, Second M ilitary Medical Univ er sity , Shanghai 200433, China )
[ ABSTRACT ]　 Objective: Glucose-insulin-po ta ssium ( G IK) is clinically used fo r reducing mo r tality in acute myocardia l in-
farction( M I) . It is known that v entricular a rrhythmia , left v entricula r dysfunction and impaired ba ro reflex sensitiv ity( BRS)
ar e the three ma jo r determinants fo r pr edicting the mo rta lity after a cute M I. The present wo rk w as designed to study the ef-
fects o f GIK on BRS, v entricula r a rrhythmia , and lef t v entricula r function in rats with co rona ry a rter y liga ture. Sprague-
Daw ley ra ts w ere used and the myoca rdial infa rction w as pr oduced by lig atur e o f the left anterio r descending a r tery. Fiv e
w eeks after co rona ry ar ter y lig ation, BRS w as mea sur ed in conscious state with a compute ri zed blood pressure monito ring
system and lef t v entricular function and electro cardio g ram w ere de termined in the anaesthetized sta te in the subacute phase of
myocardial infar ction. It w as found tha t G IK did not a ffec t the blo od pressure and hea rt period in bo th conscious and anaes-
thetized ra ts. G IK did no t enhance BRS, but reduced ventricula r ar rhy th mia and improved left vent ricula r func tion by r educ-
ing lef t v entricula r end diastolic pr essur e in anaesthetized rats w ith M I. It is pr oposed that reducing ventricular ar rhy th mia
and improv ing left v entricular function contribute to the effect o f G IK on reducing the mor tality after M I.
[Fundam Clin Pharmacol , 2003, 17( 4): 443-448 ]
·433·第 4期 . 李铁军 ,等 .欧芹素乙对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用