全 文 ：书麦类作物学报　２０１４，３４（６）：７２７－７３４
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｔｒｉｔｉｃｅａｅ　Ｃｒｏｐｓ　 ｄｏｉ：１０．－７６０６／ｊ．－ｉｓｓｎ．－１００９－１０４１．－２０１４．－０６．－０１
网络出版时间：２０１４－６－６
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｏｉ／１０．７６０６／ｊ．ｉｓｓｎ．１００９－１０４１．２０１４．０６．０１．ｈｔｍｌ
节节麦ｐｂｆ基因的克隆、序列分析及原核表达
收稿日期：２０１４－０１－２７　　　修回日期：２０１４－０３－２４
基金项目：“十二五”农村领域国家科技计划课题（２０１１ＡＡ１００５０１）；国家现代农业产业技术体系研究项目（ＣＡＲＳ－３－２－４７）
第一作者Ｅ－ｍａｉｌ：ｊｉａｎｇｑｉｎｑｉｎ０６１６＠１６３．ｃｏｍ
通讯作者：高 翔（Ｅ－ｍａｉｌ：ｇｘ＠ｎｗｓｕａｆ．ｅｄｕ．ｃｎ）；陈其皎（Ｅ－ｍａｉｌ：ｑｊｃｈｅｎ＠ｎｗｓｕａｆ．ｅｄｕ．ｃｎ）
强琴琴，杨 帆，陈其皎，高 翔，杨 华，张龙龙
（西北农林科技大学农学院，陕西杨凌７１２１００）
摘　要：醇溶蛋白盒结合因子（ｐｒｏｌａｍｉｎ－ｂｏｘ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ，ＰＢＦ）通过调控籽粒蛋白的表达效率进而影
响面粉的加工品质。为给深入研究小麦籽粒ＰＢＦ对籽粒蛋白质表达调控的分子基础提供参考依据，进而为
小麦面粉加工品质的改良提供候选基因资源，利用特异引物组合ｐｂｆＦ１／ｐｂｆ　Ｒ１分别从两份节节麦（ＡＳ９０、
ＡＳ２３８６）中克隆出ｐｂｆ基因后进行序列分析，并进一步构建ｐｂｆ基因的原核表达体系。结果表明，从两份节
节麦中克隆得到了２个不同类型的ｐｂｆ基因（ＧｅｎＢａｎｋ登录号分别为 ＫＪ５４４７７１和 ＫＪ５４４７７２），其中来源于
ＡＳ２３８６的ＫＪ５４４７７２与来源于普通六倍体小麦的１个ｐｂｆ基因序列完全相同。推导的氨基酸序列分析表
明，ＫＪ５４４７７１和ＫＪ５４４７７２所编码的蛋白质均为弱碱性的亲水蛋白，具有典型的ＤＯＦ蛋白结构域。与其他远
缘物种来源的ＰＢＦ比对结果表明，该类蛋白在ＮＬＳ核心、ＤＯＦ结构域及Ｓｅｒ铰链区相对保守，而在Ｃ－端调控
区变异较大，说明ＰＢＦ蛋白具有种属特异性。同时，系统演化树显示，来源于节节麦 ＡＳ２３８６的ｐｂｆ基因与
迄今已知的全部普通小麦的ｐｂｆ基因具有高度的相似性，因此推测该种类型的节节麦很可能参与了最初的
普通六倍体小麦的形成。此外，本研究成功构建了ｐｂｆ基因的原核表达体系，可为后续功能验证的开展奠定
基础。
关键词：节节麦；ｐｂｆ；基因克隆；序列分析；原核表达
中图分类号：Ｓ５１２．９；Ｓ３３０　　　　文献标识码：Ａ　　　　文章编号：１００９－１０４１（２０１４）０６－０７２７－０８
Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　Ａｎａｌｙｓｉｓ　ａｎｄ　Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｏｆ　ｐｂｆｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍＡｅｇｉｌｏｐｓ　ｔａｕｓｃｈｉ
ＪＩＡＮＧ　Ｑｉｎｑｉｎ，ＹＡＮＧ　Ｆａｎ，ＣＨＥＮ　Ｑｉｊｉａｏ，ＧＡＯ　Ｘｉａｎｇ，ＹＡＮＧ　Ｈｕａ，ＺＨＡＮＧ　Ｌｏｎｇｌｏｎｇ
（Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ａｇｒｏｎｏｍｙ，Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｙａｎｇｌｉｎｇ，Ｓｈａａｎｘｉ　７１２１００，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：ＰＢＦ（ｐｒｏｌａｍｉｎ－ｂｏｘ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ），ａｓ　ａ　ｔｒａｎｓ－ａｃｔｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ，ｉｓ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｓｅｅｄ　ｓｔｏｒａｇｅ　ｐｒｏ－
ｔｅｉｎ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ａｎｄ　ｔｈｕｓ　ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄ　ｔｈｅ　ｐｒｏｃｅｓｓｉｎｇ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ　ｆｌｏｕｒ．Ｔｏ　ｐｒｏｖｉｄｅ　ａ　ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ　ｆｏｒ
ｓｔｕｄｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ　ｏｆ　ｗｈｅａｔ　ＰＢＦ　ａｎｄ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｅｎｈａｎｃｅｄ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅ　ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ　ｆｏｒ
ｗｈｅａｔ　ｑｕａｌｉｔｙ　ｉｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔ，ｔｗｏ　ｐｂｆｇｅｎｅｓ　ｗｅｒｅ　ｉｓｏｌａｔｅｄ　ｆｒｏｍＡｅ．ｔａｕｓｃｈｉｉ　ｌｉｎｅｓ　ｏｆ　ＡＳ９０ａｎｄ　ＡＳ２３８６
ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｐｒｉｍｅｒ　ｐｂｆ　Ｆ１／ｐｂｆ　Ｒ１ａｎｄ　ｔｈｅｎ　ａ　ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ．Ｎｕｃｌｅｉｃ
ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｗｏ　ｐｂｆ　ｇｅｎｅｓ （ＧｅｎＢａｎｋ　ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　ｎｕｍｂｅｒｓ：ＫＪ５４４７７１ａｎｄ
ＫＪ５４４７７２）ｂｅｌｏｎｇｅｄ　ｔｏ　ｔｗｏ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｋｉｎｄｓ　ａｎｄ　ＫＪ５４４７７２ｗａｓ　ｉｄｅｎｔｉｃａｌ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｐｂｆｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　Ｃｈｉｎｅｓｅ
Ｓｐｒｉｎｇ．Ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ＰＢＦｓ　ｅｎｃｏｄｅｄ　ｂｙ　ｐｂｆｇｅｎｅｓ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ
ｗｅｒｅ　ｓｌｉｇｈｔｌｙ　ａｌｋａｌｉｎｅ　ａｎｄ　ｈｙｄｒｏｐｈｉｌｉｃ．Ａｎｄ　ｔｈｅ　ＰＢＦｓ　ｈａｄ　ｔｙｐｉｃａｌ　ｄｏｍａｉｎｓ　ｏｆ　ＤＯＦ　ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｗｈｉｌｅ　ｒｅｇ－
ｕｌａｔｏｒｙ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ＰＢＦ　Ｃ－ｔｅｒｍｉｎａｌ　ｓｈｏｗｅｄ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｓ，ｗｉｔｈ　ＮＬＳ　ｃｏｒｅ，ＤＯＦ　ｄｏｍａｉｎ　ａｎｄ　Ｓｅｒ
ｈｉｎｇｅ　ｗｅｒｅ　ｒｅｌａｔｉｖｅｌｙ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ，ｔｈｒｏｕｇｈ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ａｍｏｎｇ　ＰＢＦｓ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｐｅｃｉｅｓ．Ｔｈｉｓ　ｒｅｓｕｌｔ
ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ＰＢＦｓ　ｈａｄ　ｔｈｅ　ｓｐｅｃｉｅｓ　ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ　ａｓ　ｗａｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｉｎ　ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ．Ｆｕｒｔｈｅｒ，ｐｈｙｌｏｇｅ－
ｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｐｂｆｇｅｎｅ　ｆｒｏｍ　ＡＳ２３８６ｈａｄ　ｈｉｇｈ　ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ　ｗｉｔｈ　ａｌ　ｋｎｏｗｎ　ｐｂｆｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｃｏｍ－
ｍｏｎ　ｈｅｘａｐｌｏｉｄ　ｗｈｅａｔ　ｓｏ　ｆａｒ，ｗｈｉｃｈ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　Ａｅ．ｔａｕｓｃｈｉｉ　ｌｉｋｅ　ＡＳ２３８６ｗａｓ　ｐｒｏｂａｂｌｙ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｏ－
ｒｉｇｉｎａｌ　ｆｏｒｍａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｃｏｍｍｏｎ　ｈｅｘａｐｌｏｉｄ　ｗｈｅａｔ．Ｉｎ　ａｄｄｉｔｉｏｎ，ｔｏ　ｌａｙ　ｆｏｕｎｄａｔｉｏｎ　ｏｎ　ｆｕｒｔｈｅｒ　ｓｔｕｄｉｅｓ　ｉｎｃｌｕ－
ｄｉｎｇ　ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ　ｖａｌｉｄａｔｉｏｎ，ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｓｙｓｔｅｍ　ｏｆ　ｐｂｆｇｅｎｅ　ｗａｓ　ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ　ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｙ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｔａｕｓｃｈｉｉ；ｐｂｆ；Ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｉｎｇ；Ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｎａｌｙｓｉｓ；Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｉｃ　ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
　　麦类作物籽粒蛋白主要在灌浆期间的种子胚
乳中形成，并受到时空上的精准转录调控。其中，
转录因子在转录调控过程中起了重要的作用［１－２］。
转录因子也叫反式作用因子，其本质是一种蛋白
质，能够特异地识别并结合真核基因启动子区域
中的顺式作用元件，从而激活或抑制基因转录［３］。
研究表明，大麦、小麦及水稻胚乳特异性启动子区
域存在三个保守的顺式作用元件，分别为ＧＣＮ４－
ｌｉｋｅ　ｍｏｔｉｆ（ＧＬＭ）、ｐｒｏｌａｍｉｎ　ｂｏｘ（ＰＢ）及５′－ＡＡ－
ＣＡ／ＴＡ－３′ｍｏｔｉｆ［４］。醇溶蛋白盒结合因子（ｐｒｏ－
ｌａｍｉｎ－ｂｏｘ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｆａｃｔｏｒ，ＰＢＦ）属于转录因子
ＤＯＦ家族成员之一，Ｎ－端具有典型的单锌指结构
域（ＤＮＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｗｉｔｈ　Ｏｎｅ　Ｆｉｎｇｅｒ，ＤＯＦ　Ｄｏ－
ｍａｉｎ）。目前研究发现，除少数ＰＢＦ参与调控水
解酶、赤霉素应答等基因表达外［５－７］，大多数ＰＢＦ
在胚乳中不仅可以识别并结合顺式作用元件ＰＢ，
还可以与识别顺式作用元件ＧＬＭ 的ｂＺＩＰ（ｂａｓｉｃ
ｌｅｕｃｉｎｅ　ｚｉｐｐｅｒ）家族转录因子或者与识别顺式作
用元件５′－ＡＡＣＡ／ＴＡ－３′ｍｏｔｉｆ的ＭＹＢ家族转录
因子相结合，形成蛋白复合体，共同参与调控种子
贮藏蛋白的表达［１，８－１３］，最终影响贮藏蛋白的积累
量。其中，ＰＢＦ通过 ＤＯＦ结合域与ｂＺＩＰ相结
合，而通过Ｃ－端结构域与 ＭＹＢ相结合，且前者较
多。在大麦中研究表明，来源于顺式作用元件ＰＢ
或者ＤＯＦ蛋白结合域的突变会导致ＰＢＦ结合
ＰＢ的特性改变及贮藏蛋白基因转录活性的丧
失［８］。在水稻中，同时敲除 ＲＰＢＦ和ＲＩＳＢＺ１可
使得水稻胚乳中贮藏蛋白的表达大幅度降低［１４］。
而小麦ＰＢＦ可通过调控籽粒蛋白的表达效率影
响贮藏蛋白各组分的含量及比例，从而决定小麦
的加工品质。因此，对籽粒ＰＢＦ的深入研究可为
揭示其籽粒蛋白质的表达调控特性提供理论依
据，为小麦品质改良候选基因资源的提供奠定
基础。
节节麦（Ａｅｇｉｌｏｐｓ　ｔａｕｓｃｈｉｉ　Ｃｏｓｓ．，２ｎ＝２ｘ
＝１４，ＤＤ）属于禾本科小麦族山羊草属。从形态
学与染色体组分析的结果表明，节节麦是六倍体
普通小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ａｅｓｔｉｖｕｍ　Ｌ．，２ｎ ＝ ６ｘ ＝
４２，ＡＡＢＢＤＤ）Ｄ染色体组的原始供体种［１５－１６］。
由于最初形成的途径及后来长期的驯化，使得小
麦的遗传多样性较其祖先种大为降低［１７］，相对于
普通小麦Ｄ基因组而言，节节麦具有更为丰富的
种子贮藏蛋白亚基类型［１８－２３］，常作为外源基因，用
于普通小麦加工品质的改良。
迄今，有关调控贮藏蛋白转录的ＰＢＦ在水
稻、大麦、玉米等禾本科作物中研究较多，但大多
集中在对 ＰＢＦ所结合的顺式元件的功能解析
上［８－１１］，而对编码ｐｂｆ基因序列信息及转录因子
自身的研究较少。另外，对有关调控贮藏蛋白转
录的ｐｂｆ基因在小麦中的研究，主要是以中国春
为研究对象［２４］，尚缺乏对小麦供体物种节节麦中
该基因序列的报道。鉴于此，本研究拟通过对两
份节节麦材料进行ｐｂｆ基因克隆、生物信息学分
析，并构建原核表达体系，为研究节节麦中ｐｂｆ
基因的相关特性，后续的标记开发、功能验证及小
麦品质的改良等奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材 料
１．１．１　试验材料
节节麦材料ＡＳ９０和 ＡＳ２３８６由四川农业大
学小麦研究所提供，经国家小麦改良中心杨凌分
中心品质实验室繁殖、保存。
１．１．２　主要试剂
２×Ｅａｓｙ　Ｔａｑ　ＰＣＲ　ＳｕｐｅｒＭｉｘ、分子量标准、
ｐＥＡＳＹ－Ｔ１克隆载体、ｐＥＡＳＹ－Ｅ１表达载体、大
肠杆菌Ｔｒａｎｓ１－Ｔ１及ＢＬ２１（ＤＥ３）等购于北京全
式金生物技术有限公司；Ｘ－ｇａｌ和ＩＰＴＧ购于Ｓｉｇ－
ｍａ公司；ＤＮＡ凝胶回收纯化试剂盒、质粒小提试
剂盒购于天根生化科技公司（北京）；其他实验用
试剂均为分析纯。
１．２　方 法
１．２．１　基因组ＤＮＡ的提取
以室温黑暗培养１周左右的节节麦幼嫩叶片
·８２７· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３４卷
为材 料，采 用 微 量 ＣＴＡＢ 法 提 取 基 因 组 总
ＤＮＡ［２５］。
１．２．２　目的基因克隆
选用郭丽娜等［２４］设计的覆盖ｐｂｆ基因完整
编码区的特异性引物ｐｂｆ　Ｆ１／ｐｂｆ　Ｒ１（ｐｂｆ　Ｆ１：
５′－ＡＴＧＧＡＧＧＡＡＧＴＧＴＡＴＣＣＧＴＣＡ－３′； ｐｂｆ
Ｒ１：５′－ＴＴＡＣＡＴＣＡＧＧＧＡＧＧＴＧＣＴＧ－３′）克 隆
ｐｂｆ基因（引物由南京金斯瑞生物科技有限公司
合成）。分别以节节麦 ＡＳ９０及 ＡＳ２３８６基因组
ＤＮＡ为模板，利用ｐｂｆＦ１／ｐｂｆ　Ｒ１进行ＰＣＲ扩
增。ＰＣＲ扩增体系：２×Ｅａｓｙ　Ｔａｑ　ＰＣＲ　ＳｕｐｅｒＭｉｘ
１２．５μＬ，上下游引物各１μＬ（１０μｍｏｌ·Ｌ
－１），基
因组ＤＮＡ　１μＬ，加ｄｄＨ２Ｏ补足总体积至２５μＬ。
扩增程序：９５℃预变性５ｍｉｎ；９４℃变性５０ｓ，５８℃
退火５０ｓ，７２℃延伸１ｍｉｎ　３０ｓ，２５个循环；７２℃
延伸８ｍｉｎ。
ＰＣＲ产物经１％琼脂糖凝胶电泳检测后，切
胶回收目的片段，与克隆载体ｐＥＡＳＹ－Ｔ１在２５℃
条件下连接１５ｍｉｎ。连接产物转化入Ｔｒａｎｓ１－Ｔ１
感受态细胞中，在涂有 Ａｍｐ、ＩＰＴＧ 及 Ｘ－ｇａｌ的
ＬＢ固体平板培养基上进行蓝白斑筛选，并利用通
用引物 Ｍ１３Ｆ／Ｍ１３Ｒ进行菌落ＰＣＲ，进一步辅助
筛选阳性克隆。扩增体系及扩增程序与扩增目的
基因条件相同。最后随机挑取３个阳性克隆送华
大基因（北京）测序，同时保存阳性克隆菌株以
备用。
１．２．３　序列分析
采用 ＮＣＢＩ网站的 ＢＬＡＳＴｎ工具（ｈｔｔｐ：／／
ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）在线比对测
序得到的序列并判断其属性，同时在线搜索与其
同源的核苷酸及氨基酸序列；利用 ＤＮＡＭＡＮ
（ｖｅｒ．７．０）拼接所测序列，以得到完整编码区序
列，并利用该软件进行蛋白质翻译及多序列比对
等处理；利用 ＰｒｏｔＰａｒａｍ （ｈｔｔｐ：／／ｗｅｂ．ｅｘｐａｓｙ．
ｏｒｇ／ｐｒｏｔｐａｒａｍ／）对蛋白理化性质进行预测；利用
ＳｉｇｎａｌＰ　４．１（ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｂｓ．ｄｔｕ．ｄｋ／ｓｅｒｖｉｃｅｓ／
ＳｉｇｎａｌＰ／）对蛋白信号肽进行预测；利用ＳｈｅｒＬｏｃ２
（ｈｔｔｐ：／／ａｂｉ．ｉｎｆ．ｕｎｉ－ｔｕｅｂｉｎｇｅｎ．ｄｅ／Ｓｅｒｖｉｃｅｓ／
ＳｈｅｒＬｏｃ２）对 ＰＢＦ蛋白进行亚细胞定位；利用
ＮＬＳｔｒａｄａｍｕｓ （ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｓｅｓｌａｂ．ｃｓｂ．
ｕｔｏｒｏｎｔｏ．ｃａ／ＮＬＳｔｒａｄａｍｕｓ／）对蛋白核定位信号
进行预测；利用 ＤｉＡＮＮＡ（ｈｔｔｐ：／／ｃｌａｖｉｕｓ．ｂｃ．
ｅｄｕ／～ｃｌｏｔｅｌａｂ／ＤｉＡＮＮＡ／）对蛋白二硫键进行预
测；利 用 ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ（ｈｔｔｐ：／／ｐｒｏｓｉｔｅ．ｅｘｐａｓｙ．
ｏｒｇ／ｓｃａｎｐｒｏｓｉｔｅ／）对蛋白结构进行预测；利用
ＭＥＧＡ　５．０构建系统演化树。
１．２．４　节节麦ｐｂｆ基因原核表达体系的建立
（１）表达重组子的构建　由于本研究中克隆
引物的扩增产物恰好为ＯＲＦ，所以所用表达引物
与克隆引物相同。根据以上测序结果分别选取
ＡＳ９０及ＡＳ２３８６在－２０℃保存的阳性克隆甘油
菌，以此为模板，利用克隆引物进行ＰＣＲ扩增并
回收目的片段。ＰＣＲ扩增体系及程序同１．２．２。
将目的片段与表达载体ｐＥＡＳＹ－Ｅ１在２５℃条件
下连接１５ｍｉｎ，转化克隆菌株Ｔｒａｎｓ１－Ｔ１，利用引
物组合 Ｔ７ｐｒｏｍｏｔｏｒ　ｐｒｉｍｅｒ／ｐｂｆ　Ｒ１进行菌落
ＰＣＲ，以筛选阳性克隆，并通过测序进一步鉴定阳
性克隆菌。
（２）重组质粒的诱导表达及重组蛋白的ＳＤＳ－
ＰＡＧＥ检测 　通过测序鉴定后将正确的阳性克
隆菌株过夜培养，并提取质粒，转化表达菌株
ＢＬ２１（ＤＥ３），挑取阳性菌落，３７℃过夜培养。将
过夜菌按１∶１００的比例接种在５ｍＬ新鲜ＬＢ液
体培养基中，在３７℃、２００ｒ·ｍｉｎ－１条件下扩大培
养至ＯＤ６００＝０．５～０．８时，取１ｍＬ菌液作为未
诱导的阴性对照；向剩余培养液中加入ＩＰＴＧ（终
浓度０．８ｍｍｏｌ·Ｌ－１），３７℃、２００ｒ·ｍｉｎ－１诱导
表达４ｈ。同时，设立含有ｐＥＡＳＹ－Ｅ１空载转化
表达菌株ＢＬ２１（ＤＥ３）的诱导及未诱导菌液作为
对照。然后，将诱导及未诱导的对照菌液及诱导
的重组质粒表达菌液各取１ｍＬ，４℃、１０　０００
ｒ·ｍｉｎ－１离心１０ｍｉｎ收集菌体，分别加入５０ｍＬ
１×ＳＤＳ蛋白上样缓冲液重悬，煮沸７ｍｉｎ，４℃、
１０　０００ｒ·ｍｉｎ－１离心 ２ ｍｉｎ 后用 １５％ ＳＤＳ－
ＰＡＧＥ检测重组蛋白的表达情况。
２　结果与分析
２．１　节节麦ｐｂｆ基因克隆结果
利用克隆引物ｐｂｆ　Ｆ１／ｐｂｆ　Ｒ１对节节麦
ＡＳ９０及ＡＳ２３８６进行ＰＣＲ扩增，经１％琼脂糖凝
胶电泳检测后，得到大小为１　０００ｂｐ左右的单一
条带（图１）。将目的片段回收、克隆并测序后，利
用ＤＮＡＭＡＮ进行序列比对及拼接得到长度为
９９３ｂｐ的序列。
２．２　节节麦ｐｂｆ基因的核酸序列分析
ＮＣＢＩ在线ＢＬＡＳＴｎ表明，所得到的两条序
列与ＮＣＢＩ数据库中已公布的４条普通六倍体小
麦中国春ｐｂｆ 基因序列（登录号：ＫＣ８４９７０１、
·９２７·第６期 强琴琴等：节节麦ｐｂｆ基因的克隆、序列分析及原核表达
ＫＣ８４９７０２、ＫＣ８４９７０３及 ＡＪ０１２２８４）相似性高达
９９％以上，因此初步推断此次克隆得到的序列为
节节麦来源的ｐｂｆ基因。将上述两条基因序列
提 交 至 ＧｅｎＢａｎｋ 数 据 库，登 录 号 分 别 为
ＫＪ５４４７７１（来源于 ＡＳ９０）和 ＫＪ５４４７７２（来源于
ＡＳ２３８６）。利用ＤＮＡＭＡＮ进行序列比对，发现
ＫＪ５４４７７１和ＫＪ５４４７７２的核苷酸及氨基酸序列
Ｍ：Ｍａｒｋｅｒ　ＤＬ２０００；１：ＡＳ９０；２：ＡＳ２３８６
图１　ｐｂｆ基因ＰＣＲ扩增产物电泳结果
Ｆｉｇ．１　Ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ｏｆ　ｐｂｆｇｅｎｅ
ｓｅｐａｒａｔｅｄ　ｏｎ　１％ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ
之间的相似性分别为９９．０９％和９８．４８％。
　　进一步对本研究克隆得到的两条序列与ＮＣ－
ＢＩ数据库中已公布的５条普通六倍体小麦ｐｂｆ
基因 序 列 （ＫＣ８４９７０１、ＫＣ８４９７０２、ＫＣ８４９７０３、
ＡＪ０１２２８４及ＡＹ４９６０５７）、１条节节麦基因组测序
得到的ｐｂｆ基因序列（ＫＤ５０５５１５）及１条乌拉尔
图小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｕｒａｒｔｕ　Ｔｈｕｍ．ｅｘ　Ｇａｎｄｉｌ，ＡＡ，
２ｎ＝２ｘ＝１４，四倍体小麦和普通小麦Ａ基因组的
供体）基 因 组 测 序 得 到 的 ｐｂｆ 基 因 序 列
（ＥＭＳ６１７６１）进行比对。结果（图２）表明：（１）
ＫＪ５４４７７１、ＫＪ５４４７７２与除 ＥＭＳ６１７６１外的其他
序列之间相对保守（序列相似度为９９．７４％），
ＥＭＳ６１７６１与其他序列存在多处变异（序列相似
度为９９．１１％）；（２）ＫＪ５４４７７２与 ＫＣ８４９７０１序列
完全相同；（３）ＫＪ５４４７７１与除ＥＭＳ６１７６１外的其
他序列之间存在７个ＳＮＰ位点；（４）ＫＪ５４４７７１、
ＫＤ５０５５１５与除ＥＭＳ６１７６１外的其他序列之间存
在２个ＳＮＰ位点。
　　“－”代表和大写字母相同的碱基；数字代表ＳＮＰ所处序列位置；“Δ”代表 ＫＪ５４４７７１与除ＥＭＳ６１７６１外的其他序列（ＫＣ８４９７０１、
ＫＣ８４９７０２、ＫＣ８４９７０３、ＡＪ０１２２８４、ＫＤ５０５５１５及ＫＪ５４４７７２）之间存在的ＳＮＰ；“Ｏ”代表ＫＪ５４４７７１、ＫＤ５０５５１５与除ＥＭＳ６１７６１外的其他序
列（ＫＣ８４９７０１、ＫＣ８４９７０２、ＫＣ８４９７０３、ＡＪ０１２２８４及ＫＪ５４４７７２）之间存在的ＳＮＰ
′－′ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｂａｓｅ　ｉｄｅｎｔｉｃａｌ　ｔｏ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｕｐｐｅｒ　ｃａｓｅ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ｅａｃｈ　ｃｏｌｕｍｎ；Ｎｕｍｂｅｒｓ　ｕｎｄｅｒ　ｂａｓｅｓ　ｏｆ　ｅａｃｈ　ｃｏｌｕｍｎ　ｉｎｄｉｃａｔｅ
ｔｈｅ　ｐｏｓｉｔｉｏｎ　ｏｆ　ＳＮＰｓ；′Δ′ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ＳＮＰｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＫＪ５４４７７１ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ＫＣ８４９７０１，ＫＣ８４９７０２，ＫＣ８４９７０３，ＡＪ０１２２８４，
ＫＤ５０５５１５ａｎｄ　ＫＪ５４４７７２；′Ｏ′ｉｎｄｉｃａｔｅ　ＳＮＰｓ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＫＪ５４４７７１ａｎｄ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ　ＫＣ８４９７０１，ＫＣ８４９７０２，ＫＣ８４９７０３，ＡＪ０１２２８４
ａｎｄ　ＫＪ５４４７７２
图２　核苷酸序列间ＳＮＰ比对
Ｆｉｇ．２　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ＳＮＰｓ　ａｍｏｎｇ　ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
２．３　推导的蛋白质序列分析
２．３．１　蛋白质理化性质分析
利用ＰｒｏｔＰａｒａｍ对本研究克隆得到的２个核
苷酸序列推导的蛋白质进行理化性质预测，可得
蛋白分子量约为３４ｋＤ、且均属弱碱性的亲水
蛋白。
２．３．２　蛋白质亚细胞定位分析
ＳｉｇｎａｌＰ　４．１分析结果表明，这两种蛋白质没
有信号肽且没有跨膜区域（ｎｏＴＭ），所以二者均
属于非分泌蛋白。由ＳｈｅｒＬｏｃ２预测结果可知，由
·０３７· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３４卷
ＫＪ５４４７７１和 ＫＪ５４４７７２推导的蛋白质定位于细
胞核的分值分别为０．９８和０．９７，因此这两种
ＰＢＦ蛋白合成后转运至细胞核中起作用。利用
ＮＬＳｔｒａｄａｍｕｓ预测可得，ＫＪ５４４７７１推导的蛋白
质核定位信号位于 ２６ａａ～３０ａａ区域的短肽
ＫＫＰＲＰ，ＫＪ５４４７７２推导的蛋白质核定位信号位
于２６ａａ～３１ａａ区域的短肽 ＫＫＰＲＰＫ，二者均属
于单组份核定位信号；而单组份核定位信号保守
的序列特征为 Ｋ－Ｋ／Ｒ－Ｘ－Ｋ／Ｒ［２６］，所以本研究推
导的蛋白核定位信号保守序列（ＮＬＳ　Ｃｏｒｅ）为位
于２６ａａ～２９ａａ区域的短肽 ＫＫＰＲ。利用 Ｎｅｔ－
ＮＥＳ预测未发现含有保守亮氨酸区域，即所预测
蛋白没有核输出信号，因此这两种蛋白不具备在
细胞核与细胞质之间穿梭的特征。
２．３．３　蛋白质结构分析
ＤＯＦ蛋白通常含有两个重要的结构域，分别
为Ｎ－端保守的ＤＯＦ结合域（ＤＯＦ　Ｄｏｍａｉｎ）［２７－２８］
和Ｃ－端可变的调控域（Ｖａｒｉａｂｌｅ　Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ　Ｄｏ－
ｍａｉｎ）［１，２８－２９］。其中，Ｎ－末端 ＤＯＦ结合域是由４
个Ｃｙｓ残基与１个Ｚｎ２＋以共价键结合并在空间
上扭曲而形成；Ｃ－端调控域具有典型的富天冬酰
胺（Ａｓｐａｒａｇｉｎｅ－ｒｉｃｈ）序列特征［３０］；ＤＯＦ结构域下
游丝氨酸（Ｓｅｒ）残基链（Ｓｅｒ　Ｈｉｎｇｅ）是连接结合域
和调控域的铰链［２８］。利用ＳｃａｎＰｒｏｓｉｔｅ对推导的
氨基酸序列分析表明，推导的蛋白 Ｎ－端区３６ａａ－
９０ａａ为ＤＯＦ结合域；分析氨基酸序列特征可发
现，推导得到的氨基酸Ｃ－端区存在典型的富天冬
酰胺区且Ｎ－端和Ｃ－端之间也存在保守的Ｓｅｒ残
基链［２９］。由此可得推导得到的ＰＢＦ蛋白具有典
型的ＤＯＦ蛋白结构（图３）。利用ＤｉＡＮＮＡ对推
导的氨基酸序列二硫键进行预测，发现氨基酸序
列均存在４个二硫键且位置保守（３８－８５、４１－４９、
６３－１１６及６６－３０９）（图３）。
另外，利用ＤＮＡＭＡＮ对本研究推导得到的
２个ＰＢＦ蛋白（ＫＪ５４４７７１和 ＫＪ５４４７７２）与５个来
源于普通六倍体小麦的 ＰＢＦ蛋白（ＡＡＳ１９８５７、
ＡＧＲ３４０５５、ＡＧＲ３４０５６、ＡＧＲ３４０５７和ＣＡＡ０９９７６）、１
个由乌拉尔图小麦基因组测序得到的ＰＢＦ蛋白
（ＥＭＳ６１７６１）、１个由节节麦基因组测序得到的
ＰＢＦ蛋白（ＥＭＴ３０３９８）及１个来源于大麦的ＰＢＦ
蛋白（ＣＡＡ０４４４０）进行比对（图４），分析表明：（１）
ＰＢＦ蛋白ＮＬＳ核心均具有单组份核定位信号特
征序列Ｋ－Ｋ／Ｒ－Ｘ－Ｋ／Ｒ且位于２６ａａ－２９ａａ区域，其
中，大麦相对于小麦及其祖先种在第２８位氨基酸
发生变异（Ｐ→Ｓ）；（２）ＰＢＦ蛋白ＤＯＦ结构域极端
保守，仅有 ＡＧＲ３４０５６的第７２位氨基酸发生变
异（Ｈ→Ｒ），但其并不影响ＤＯＦ结构域功能［３１］；
（３）在Ｎ－端结合域与Ｃ－端调控域之间均存在富丝
氨酸区，其中ＡＧＲ３４０５７第１４９位发生变异（Ｓ→
Ｐ）；（４）ＰＢＦ蛋白Ｎ－端调控域均具有典型的富天
冬酰胺区，ＫＪ５４４７７２与来自普通小麦及Ｄ基因
组测序得到的ＰＢＦ蛋白序列在此区域非常保守，
而ＫＪ５４４７７１相对于ＫＪ５４４７７２在第２９５位存在１
个氨基酸变异（Ｄ→Ｇ）；另外，来源于大麦及乌拉
尔图小麦的ＰＢＦ蛋白相对于来源于普通六倍体
小麦和节节麦的ＰＢＦ蛋白而言，该区域乃至整个
Ｎ－端区变异较大；（５）来源于普通六倍体小麦的
ＰＢＦ蛋白与来源于节节麦的ＰＢＦ蛋白序列相似
度（９９．３９％）高于其与乌拉尔图（９８．２３％）及大麦
的ＰＢＦ蛋白（９６．１５％）。
２．４　系统演化树分析
将本研究推导得到的ＰＢＦ蛋白序列与ＮＣＢＩ
已公布的普通六倍体小麦ＰＢＦ蛋白序列、节节麦
基因组测序得到的ＰＢＦ蛋白序列、乌拉尔图小麦
基因组测序得到的ＰＢＦ蛋白序列、大麦ＰＢＦ蛋
白序列、水稻ＰＢＦ蛋白序列、小米类ＰＢＦ蛋白序
列、高粱ＰＢＦ蛋白序列及玉米ＰＢＦ蛋白序列利
用 ＭＥＧＡ　５．０构建系统进化树（图 ５）。发现
ＰＢＦ蛋白序列被聚类为２个相对独立的组，本研
究得到的ＰＢＦ蛋白序列与来源于小麦、水稻、节
节麦、乌拉尔图小麦和大麦的ＰＢＦ蛋白聚为一
类，而来源于小米、高粱及玉米的ＰＢＦ蛋白独立
“☆”代表半胱氨酸残基的位置　“☆′”ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｐｏｓｉｔｉｏｎｓ　ｏｆ　ｃｙｓｔｅｉｎｅ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ
图３　ＰＢＦ蛋白结构及二硫键模式图
Ｆｉｇ．３　Ｓｃｈｅｍａｔｉｃ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｏｆ　ＰＢＦ　ａｎｄ　ｉｎｔｒａ－ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｄｉｓｕｌｆｉｄｅ　ｂｏｎｄｓ
·１３７·第６期 强琴琴等：节节麦ｐｂｆ基因的克隆、序列分析及原核表达
　　“↓”表示参与形成锌指结构保守的半胱氨酸；“－”代表和大写字母相同的碱基；“…”代表缺失３个碱基
“↓”ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｃｙｓｔｅｉｎｅｓ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｉｎ　ｚｉｎｃ　ｆｉｎｇｅｒ；“－”ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｔｈｅ　ｂａｓｅ　ｉｄｅｎｔｉｃａｌ　ｔｏ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｕｐｐｅｒ　ｃａｓｅ　ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ　ｗｉｔｈｉｎ　ｅａｃｈ　ｃｏｌ－
ｕｍｎ；“…”ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　３ｂａｓｅｓ　ｏｆ　ａｂｓｅｎｃｅ
图４　不同来源的ｐｂｆ基因推导的蛋白序列比对
Ｆｉｇ．４　Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｏｆ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｂｆｇｅｎｅｓ　ｆｒｏｍ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｍａｔｅｒｉａｌｓ
“Δ”代表本研究推导得到的蛋白质　“Δ”ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｔｈｅ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｔｈｉｓ　ｓｔｕｄｙ
图５　ＰＢＦ蛋白序列系统演化树分析
Ｆｉｇ．５　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＰＢＦｓ
·２３７· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３４卷
的聚为另一类。本研究得到的ＰＢＦ蛋白序列所
在的大类又可以分为２个小类，来源于水稻的
ＰＢＦ蛋白独立的聚为一小类，而其他ＰＢＦ蛋白聚
为另一小类。本研究得到的ＰＢＦ蛋白序列所在
的小类又可以分为３类，其中 ＫＪ５４４７７２与普通
小麦及节节麦基因组测序来源的ＰＢＦ蛋白序列
聚为一类，来源于高粱及乌拉尔图小麦的ＰＢＦ蛋
白聚为一类，而ＫＪ５４４７７１独立的聚为一类。
２．５　原核表达结果
将含有重组表达质粒的表达菌株在３７℃经
过０．８ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ＩＰＴＧ诱导６ｈ后，用１５％
ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳检测表达情况（图６）。与对照相
比，本研究所诱导的蛋白约在３６ｋＤ处出现目的
条带，除去约２ｋＤ组氨酸标签外，与２．３．１中
ＰｒｏｔＰａｒａｍ在线预测的蛋白分子量大小相符，表
明ｐｂｆ基因在原核表达体系中表达成功。
　　Ｍ：Ｂｌｕｅ　ＰｌｕｓＴＭ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍａｒｋｅｒ；１：未诱导空载体；２：诱导
空载体；３：未诱导的重组质粒（ＫＪ５４４７７１）；４：诱导后的重组质
粒（ＫＪ５４４７７１）；５：未诱导的重组质粒（ＫＪ５４４７７２）；６：诱导后的重
组质粒（ＫＪ５４４７７２）；箭头所指为目的蛋白
Ｍ：Ｂｌｕｅ　ＰｌｕｓＴＭ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍａｒｋｅｒ；１：Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｎｏｎ－ｒｅｃｏｍｂｉ－
ｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；２：Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｎｏｎ－ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ
ｐｌａｓｍｉｄ　ａｆｔｅｒ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ；３：Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ｗｉｔｈ－
ｏｕｔ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ（ＫＪ５４４７７１）；４：Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ　ａｆ－
ｔｅｒ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ （ＫＪ５４４７７１）；５：Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ
ｗｉｔｈｏｕｔ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ（ＫＪ５４４７７２）；６：Ｐｒｏｔｅｉｎ　ｏｆ　ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ　ｐｌａｓｍｉｄ
ａｆｔｅｒ　ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ（ＫＪ５４４７７２）；Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｐｒｏｄｕｃｔｓ　ａｒｅ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｂｙ
ａｒｒｏｗｓ
图６　表达蛋白的ＳＤＳ－ＰＡＧＥ分析
Ｆｉｇ．６　Ｐｒｏｔｅｉｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｂｙ　ＳＤＳ－ＰＡＧＥ
３　讨 论
本研究对两份节节麦材料进行ｐｂｆ基因克
隆，得到 ２ 个不同的 ｐｂｆ 基因 （ＫＪ５４４７７１ 和
ＫＪ５４４７７２）序列。根据ＫＪ５４４７７１、ＫＪ５４４７７２与小
麦及祖先种ｐｂｆ序列之间的ＳＮＰ分布特点，推测
本研究所克隆的２个ｐｂｆ 基因属于不同类型。
此外，来源于ＡＳ２３８６的ｐｂｆ基因与来源于普通
六倍体小麦中国春的一个ｐｂｆ 基因完全相同，推
测该类型的基因在普通小麦形成过程中表现为极
端保守，且中国春ｐｂｆ基因（ＫＣ８４９７０１）理论上
来自于Ｄ基因组。
就保守性上看，ＰＢＦ具有较强的物种特异
性。本研究推导的ＰＢＦ蛋白与来源于普通六倍
体小麦、大麦、节节麦及乌拉尔图小麦ＰＢＦ蛋白
序列比对，发现所有的ＰＢＦ蛋白均具有ＤＯＦ蛋
白典型结构，且ＤＯＦ结构域极端保守。ＮＬＳ均
具有单组份核定位信号保守的序列特征 Ｋ－Ｋ／Ｒ－
Ｘ－Ｋ／Ｒ，而大麦相对于小麦及其祖先种在第２８位
氨基酸发生变异（Ｐ→Ｓ），推测变异的 ＮＬＳ核心
（ＫＫＳＲ）可能是大麦 ＰＢＦ 蛋白所特有的一种
ＮＬＳ核心。连接ＰＢＦ蛋白Ｎ－端与Ｃ－端的Ｓｅｒ铰
链区保持相对保守，普通六倍体小麦ＰＢＦ蛋白
ＡＧＲ３４０５７第１４９位发生变异（Ｓ→Ｐ），该Ｓｅｒ变
异对ＰＢＦ功能是否有影响还有待于进一步研究。
Ｎ－端调控域均具有富天冬酰胺区，其中，来源于
节节麦及普通六倍体小麦ＰＢＦ蛋白在此区域乃
至整个Ｎ－端调控区保持相对保守，而来源于乌拉
尔图小麦及大麦的ＰＢＦ蛋白相对于普通小麦和
节节麦而言，变异较大，推测不同基因组及不同物
种之间来源的ＰＢＦ蛋白可能在激活蛋白表达方
式及表达活性方面存在差异。从ＰＢＦ蛋白序列
整体来看，来源于普通六倍体小麦与节节麦的
ＰＢＦ蛋白相似度（９９．３９％）高于其与乌拉尔图小
麦（９８．２３％）及大麦的ＰＢＦ蛋白（９６．１５％），表明
ＰＢＦ蛋白在物种之间存在差异且亲缘关系越远
其差异越大，即ＰＢＦ蛋白表现为种属特异性。
系统演化树分析表明，麦类作物ＰＢＦ蛋白首
先从其他禾本科植物中分离出来，其次大麦、乌拉
尔图小麦ＰＢＦ蛋白从其他麦类作物ＰＢＦ蛋白中
分离出来，同样表明ＰＢＦ具有种属特异性。此
外，ＫＪ５４４７７２与普通小麦及Ｄ基因组测序来源
的ＰＢＦ蛋白序列聚为一类，来源于大麦及乌拉尔
图小麦的ＰＢＦ蛋白聚为一类，而 ＫＪ５４４７７１独立
的聚为一类，推测有可能ｐｂｆ基因在小麦中是多
拷贝，数据库中已公布的普通六倍体小麦ＰＢＦ蛋
白全都来源于Ｄ基因组，或者乌拉尔图小麦在普
通六倍体小麦形成之后发生了大量变异，而这种
推测需要对普通六倍体小麦 Ａ基因组供体ＰＢＦ
等进 行 研 究 得 到 进 一 步 证 实；同 时，推 测
ＫＪ５４４７７２类型的节节麦很可能参与了最初的普
通六倍体小麦的形成。
·３３７·第６期 强琴琴等：节节麦ｐｂｆ基因的克隆、序列分析及原核表达
参考文献：
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ｓｐｅｒｍ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ＤＯＦ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆｒｏｍ　ｂａｒｌｅｙ，ｈｉｇｈｌｙ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｉｎ
ｗｈｅａｔ，ｂｉｎｄｓ　ｔｏ　ａｎｄ　ａｃｔｉｖａｔｅｓ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｆｒｏｍ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌａｍｉｎ－
ｂｏｘ　ｏｆ　ａ　ｎａｔｉｖｅ　Ｂ－ｈｏｒｄｅｉｎ　ｐｒｏｍｏｔｅｒ　ｉｎ　ｂａｒｌｅｙ　ｅｎｄｏｓｐｅｒｍ［Ｊ］．
Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，１９９８，１６：５３－６２．
［９］Ｖｉｃｅｎｔｅ－Ｃａｒｂａｊｏｓａ　Ｊ，Ｍｏｏｓｅ　Ｓ　Ｐ，Ｐａｒｓｏｎｓ　Ｒ　Ｌ，ｅｔ　ａｌ．Ａ　ｍａｉｚｅ
ｚｉｎｃ－ｆｉｎｇｅｒ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｂｉｎｄｓ　ｔｈｅ　ｐｒｏｌａｍｉｎ　ｂｏｘ　ｉｎ　ｚｅｉｎ　ｇｅｎｅ　ｐｒｏ－
ｍｏｔｅｒｓ　ａｎｄ　ｉｎｔｅｒａｃｔｓ　ｗｉｔｈ　ｔｈｅ　ｂａｓｉｃ　ｌｅｕｃｉｎｅ　ｚｉｐｐｅｒ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐ－
ｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　Ｏｐａｑｕｅ２［Ｊ］．Ｐｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｎａｔｉｏｎａｌ　Ａ－
ｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ　ｏｆ　Ｕｎｉｔｅｄ　Ｓｔａｔｅｓ　ｏｆ　Ａｍｅｒｉｃａ，１９９７，９４：
７６８５－７６９０．
［１０］Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｍ　Ｐ，Ｏｎｏｄｅｒａ　Ｙ，Ｔｏｕｎｏ　Ｓ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｓｙｎｅｒｇｉｓｍ　ｂｅ－
ｔｗｅｅｎ　ＲＰＢＦ　Ｄｏｆ　ａｎｄ　ＲＩＳＢＺ１ｂＺＩＰ　ａｃｔｉｖａｔｏｒｓ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｒｅｇｕｌａ－
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ＰＢＦ　ａｃｔｉｖａｔｅｓ　ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ　ｏｆγ－ｚｅｉｎ　ｄｕｒｉｎｇ　ｍａｉｚｅ　ｓｅｅｄ　ｄｅｖｅｌ－
ｏｐｍｅｎｔ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｂｉｏｌｏｇｙ，２００８，６７：４４１－４５４．
［１２］Ｓｕｚｕｋｉ　Ａ，Ｗｕ　Ｃ　Ｙ，Ｗａｓｈｉｄａ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｒｉｃｅ　ＭＹＢ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ＯＳ－
ＭＹＢ５ｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｙ　ｂｉｎｄｓ　ｔｏ　ｔｈｅ　ＡＡＣＡ　ｍｏｔｉｆ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ａ－
ｍｏｎｇ　ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ　ｏｆ　ｇｅｎｅｓ　ｆｏｒ　ｓｔｏｒａｇｅ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｇｌｕｔｅｌｉｎ［Ｊ］．
Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，１９９８，３９：５５５－５５９．
［１３］Ａｌｂａｎｉ　Ｄ，Ｈａｍｍｏｎｄ－Ｋｏｓａｃｋ　Ｍ　Ｃ，Ｓｍｉｔｈ　Ｃ，ｅｔ　ａｌ．Ｔｈｅ　ｗｈｅａｔ
ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌ　ａｃｔｉｖａｔｏｒ　ＳＰＡ：ａ　ｓｅｅｄ－ｓｐｅｃｉｆｉｃ　ｂＺＩＰ　ｐｒｏｔｅｉｎ
ｔｈａｔ　ｒｅｃｏｇｎｉｚｅｓ　ｔｈｅ　ＧＣＮ４－ｌｉｋｅ　ｍｏｔｉｆ　ｉｎ　ｔｈｅ　ｂｉｆａｃｔｏｒｉａｌ　ｅｎｄｏ－
ｓｐｅｒｍ　ｂｏｘ　ｏｆ　ｐｒｏｌａｍｉｎ　ｇｅｎｅｓ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｃｅｌｌ，１９９７，９：
１７１－１８４．
［１４］Ｋａｗａｋａｔｓｕ１Ｔ，Ｙａｍａｍｏｔｏ　Ｍ　Ｐ，Ｔｏｕｎｏ　Ｓ　Ｍ，ｅｔ　ａｌ．Ｃｏｍｐｅｎ－
ｓａｔｉｏｎ　ａｎｄ　ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎ　ｂｅｔｗｅｅｎ　ＲＩＳＢＺ１ａｎｄ　ＲＰＢＦ　ｄｕｒｉｎｇ
ｇｒａｉｎ　ｆｉｌｉｎｇ　ｉｎ　ｒｉｃｅ［Ｊ］．Ｔｈｅ　Ｐｌａｎｔ　Ｊｏｕｒｎａｌ，２００９，６：９０８－９２０．
［１５］Ｋｉｈａｒａ　Ｈ．Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＤＤ－ａｎａｌｙｓｅｒ，ｏｎｅ　ｏｆ　ｔｈｅ　ａｎｃｅｓｔｏｒｓ
ｏｆ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｖｕｌｇａｒｅ（Ｊａｐａｎｅｓｅ）［Ｊ］．Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ　ａｎｄ　Ｈｏｒｔｉ－
ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｔｏｋｙｏ），１９４４，１９：１３－１４．
［１６］Ｍｃｆａｄｄｅｎ　Ｅ　Ｓ，Ｓｅａｒｓ　Ｅ　Ｒ．Ｔｈｅ　ｏｒｉｇｉｎ　ｏｆ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｓｐｅｌｔａ　ａｎｄ
ｉｔｓ　ｆｒｅｅ－ｔｈｒｅｓｈｉｎｇ　ｈｅｘａｐｌｏｉｄ　ｒｅｌａｔｉｖｅｓ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｈｅｒｅｄｉ－
ｔｙ，１９４６，３７：１０７－１１６．
［１７］Ｃｏｘ　Ｔ　Ｓ．Ｄｅｅｐｅｎｉｎｇ　ｔｈｅ　ｗｈｅａｔ　ｇｅｎｅ　ｐｏｏｌ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ
Ｃｒｏｐ　Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，１９９８，１：１－２５．
［１８］Ｗｉｌｉａｍ　Ｍ，Ｐｅｎａ　Ｒ　Ｊ，Ｍｕｊｅｅｎ－Ｋａｚｉ　Ａ．Ｓｅｅｄ　ｐｏｒｔｅｉｎ　ａｎｄ
ｉｓｏｚｙｍｅ　ｖａｉｒａｔｉｏｎ　ｉｎ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｔａｕｓｃｈｉｉ （Ａ．ｓｑｕａｒｒｏｓａ）［Ｊ］．
Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃ　ａｎｄ　Ａｐｐｌｉｅｄ　Ｇｅｎｅｔｉｃｓ，１９９３，８７：２５７－２６３．
［１９］Ｇｉａｎｉｂｅｌｉ　Ｍ　Ｃ，Ｗｒｉｇｌｅｙ　Ｃ　Ｗ，Ｍａｃｒｉｔｃｈｉｅ　Ｆ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ　ｏｆ
ｌｏｗ　Ｍｒｇｌｕｔｅｎｉｎ　ｓｕｂｕｎｉｔｓ　ｉｎ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｔａｕｓｃｈｉｉ［Ｊ］．Ｊｏｕｒｎａｌ
ｏｆ　Ｃｅｒｅａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，２００２，３５：２７７－２８６．
［２０］Ｇｉａｎｉｂｅｌｉ　Ｍ　Ｃ，Ｇｕｐｔａ　Ｒ　Ｂ，Ｌａｆｉａｎｄｒａ　Ｄ，ｅｔ　ａｌ．Ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ
ｏｆ　ｈｉｇｈ　Ｍｒｇｌｕｔｅｎｉｎ　ｓｕｂｕｎｉｔｓ　ｉｎ　Ｔｒｉｔｉｃｕｍ　ｔａｕｓｃｈｉｉ：ｃｈａｒａｃｔｅｒｉ－
ｓａｔｉｏｎ　ｂｙ　ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ　ａｎｄ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｉｃ　ｍｅｔｈｏｄｓ［Ｊ］．
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ｔｉｏｎ　ｆａｃｔｏｒｓ　ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ　ｗｉｔｈ　ｄｉｖｅｒｓｅ　ｐｈｅｎｏｍｅｎａ　ｕｎｉｑｕｅ　ｔｏ
ｐｌａｎｔｓ［Ｊ］．Ｐｌａｎｔ　ａｎｄ　Ｃｅｌｌ　Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ，２００４，４５：３８６－３９１．
·４３７· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第３４卷