全 文 ：园艺园林科学
ChineseAgriculturalScienceBuletinVol.24No.22008February
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试验通过对贵州野生匍匐剪股颖POD等位酶位
点遗传变异进行分析，以期解决以下问题：①POD等
位酶在匍匐剪股颖中亚细胞室中的分布及亚基数目。
②匍匐剪股颖所含的POD等位酶位点，每个位点所包
基金项目：贵州省科技厅项目“贵州省草业工程技术中心”（“黔科合农字[2005]4002号”）。
第一作者简介：钟理，男，1983年出生，硕士，研究方向：草业科学。通信地址：625014 四川省雅安市四川农业大学草业科学系。E-mail：zhongliy-
cy@sohu.com。
通讯作者：尚以顺，男，1969年出生，副研究员。E-mail：gzsyishun@vip.sina.com。
收稿日期:2007-11-13，修回日期：2007-11-31。
贵州野生匍匐剪股颖POD等位酶位点遗传变异分析
钟 理 1,2,杨春燕 1,3,尚以顺 1,王小利 1,刘正书 1,陈 伟 1
（1贵州省草业研究所，独山 558200；2四川农业大学草业科学系，雅安 625014；
3四川农业大学林学园艺学院，雅安 625014)
摘 要:试验旨在揭示材料间的亲缘关系,从而为促进中国野生草坪草种质资源的收集、保存、以及核心
种质资源的构建等具有重要意义,同时也为品种选育过程中亲本选配、后代遗传变异程度及杂种优势
水平的预测提供预见性的指导。试验以国外匍匐剪股颖品种KROMI为对照,对贵州三大地区的18份
野生匍匐剪股颖材料 POD等位酶位点遗传变异进行分析,共检测到两个 POD等位酶位点 Pod-1、
Pod-2。其中Pod-1有八条酶带,迁移率(RF)分别为0.031、0.046、0.065、0.088、0.111、0.131、0.163、0.183;
Pod-2有四条酶带,迁移率(RF)分别为 0.644、0.667、0.699、0.752;根据 POD等位酶基因型分析结果,
Pod-1位点等位酶四级结构为二聚体,Pod-2酶位点为单聚体。Pod-1位点含 Pod-1a、Pod-1b、Pod-1c、
Pod-1d四个等位基因,其中 Pod-1a、Pod-1b、Pod-1c在材料中出现频率最高,为主导基因;Pod-2位点含
Pod-2a、Pod-2b、Pod-2c、Pod-2d四个等位基因,其中Pod-2c出现频率最高,为Pod-2位点主导基因。根据
试验结果,可将供试材料分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四大类。
关键词:匍匐剪股颖;POD等位酶;遗传变异
中图分类号:Q943 文献标识码:A
ThePeroxidaseIsoenzymeGeneticVarianceOfWild
AgrostisstoloniferaL.GermplasmResources
ZhongLi1,2,YangChunyan1,3,ShangYiShun1,WangXiaoli1,LiuZhengshu1,ChenWei1
(1GuizhouInstituteofprataculture,Dushan558200;
2DepartmentofGrassland,SichuanAgriculturalUniversity,Yaan625014;
3Colege0fForestryandHorticulture,SichuanAgricultureUniversity,Yaan625014)
Abstract:ThestudyaimedtodetectgeneticrelationsamongaccessionsofAgrostisstoloniferaL.,itwas
usefulforcolectingandappraisingwildgermplasmresources,anditgaveadirectionforbreeding.Ina
comparisonofKROMI,westudiedtheperoxidaseisoenzymevarianceofWildofGuizhou，wedetectedtwo
peroxidaseisoenzymepoints:Pod-1、Pod-2。ThePod-1included8bands,RFwere:0.031、0.046、0.065、
0.088、0.111、0.131、0.163、0.183,itindicatedtherewerefouraleles:Pod-1a、Pod-1b、Pod-1c、Pod-1d,and
Pod-1a、Pod-1b、Pod-1cwerethemainaleles:ThePod-2included8bands,RFwere:0.644、0.667、0.699、
0.752,italsoincludedfouraleles:Pod-2a、Pod-2b、Pod-2c、Pod-2d,andPod-2cwasthemainalele.
BasedontheDICEgeneticsimilarity,accessionscouldbedividedinto4groups.
Keywords:AgrostisstoloniferaL.,peroxidaseIsoenzyme,geneticvariance.
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含的等位基因数。③通过等位酶相似性分析材料间的
遗传相似性。从而为等位酶技术在野生植物种质资源
评价上的应用提供参考，也为促进我国野生草坪草种
质资源的收集、保存、以及核心种质资源的构建等具有
重要意义。
从 1966年 HubbyLewontinJohnson和 Haris[1,2]
分别报道了利用凝胶电泳技术结合酶的特异性染色对
果蝇和人类居群遗传变异的定量研究之后，等位酶电
泳技术在遗传变异中得到了广泛的应用。随后，等位酶
技术也被引进到牧草及草坪草种质资源研究中，迄今
已积累了丰富的资料，并在采样原则、试验方法、数据
处理、结果分析方面形成了统一的标准[4~6]。在种质资
源研究、亲缘关系分析、抗性研究、种子纯度检测等方
面得到了广泛的运用[7~22]。但大多数研究人员对得到的
酶谱，只做表性的比较，并没有对酶谱做遗传学解释和
分析，直接把酶带的数目或迁移率的大小当作数量性
状来计算材料间的遗传相似性，往往得出与实际情况
不符合甚至完全相反的结论。试验针对这一情况，参考
王中仁先生[3]的等位酶分析技术，对贵州野生匍匐剪股
颖POD等位酶位点遗传变异进行分析。
1材料和方法
1.1试验时间、地点
研究室内试验于2006年8月在贵州省草业科学
研究所生物技术实验室进行。
1.2试验材料
试验材料来源如表1所示。
表1野生匍匐剪股颖材料来源
备注
优势种
伴生种
伴生种
伴生种
优势种
伴生种
伴生种
伴生种
伴生种
伴生种
优势种
伴生种
伴生种
伴生种
伴生种
伴生种
伴生种
伴生种
-
生境情况
路边地坎
山坡草地
山坡草地
路边地坎
山坡草地
山坡草地
山坡草地
路边地坎
山坡草地
路边地坎
稻田
山坡草地
山坡草地
路边地坎
山坡草地
山坡草地
路边地坎
路边地坎
-
海拔（m）
970
1390
1260
1340
1500
1580
1600
1590
1500
1570
2370
2080
1840
1460
1750
2100
1780
2200
-
采集地点
清镇市城郊
黔西县灵泉镇
黔西县城郊
纳雍县城郊
纳雍县王家寨
织金县城郊
大方县城郊
大方县黄泥塘镇
毕节市朱镇
毕节市城郊
威宁县城郊
赫章县野马川镇
赫章县城郊
普定县城郊
水城县城郊
六枝特区郎岱镇
六盘水市钟山区
六盘水市梅花山
引进品种
材料BSE1
材料BSE2
材料BSE3
材料BSE4
材料BSE5
材料BSE6
材料BNW1
材料BNW2
材料BNW3
材料BNW4
材料BNW5
材料BNW6
材料BNW7
材料LPS1
材料LPS2
材料LPS3
材料LPS4
材料LPS5
KROMI
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
区域
毕节东南区
（BSE）
毕节西北区
（BNW）
六盘水市
（LPS）
对照(CK)
1.3试验方法
1.3.1POD等位酶的提取 取植株同一部位同一生长
时期的成熟叶片0.3g，加Tris-Hcl缓冲液于研钵中，再
加10%甘油10ml，研磨成匀浆。溶液放入离心管中，在
10000r/min的离心机中离心15min。将上清液放入小
瓶中，保存在0~4℃冰箱中备用。
1.3.2POD等位酶的检测 30mA电流预电泳半小时后
开始加样，酶液上样量为5μl，在4℃冰箱中电泳，初
始电流为10mA，样品进入分离胶时，电流调至25mA。
电泳结束后采用醋酸联苯胺染色30min左右。
1.3.3不连续电泳系统的优化 试验采用聚丙烯酰胺凝
胶垂直板电泳法（PAGE），为获得较好的试验效果，针
对过氧化物酶相对分子量的大小，试验选取了6种不
同浓度的分离胶及2种不同浓度的浓缩胶进行优化，
其浓缩胶和分离胶的具体配制如表2：
1.4数据处理
1.4.1相对迁移率的计算
各酶带相对迁移率：Rf=X2/X1
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X2—染色后凝胶中POD等位酶迁移距离
X1—染色后溴酚兰指示剂迁移距离
根据各酶带相对迁移率（Rf值），绘制不同剪股颖
材料POD等位酶酶谱模式图。
1.4.2酶谱的遗传学解释 酶带的命名参照王中仁介绍
的国际通用酶谱命名方法[3]。根据POD等位酶四级结
构及在亚细胞分室中的分布（单体或二聚体，分布于细
胞液和细胞壁中），以及酶谱表型与基因型的对应关
系，结合匍匐剪股颖倍性，在POD等位酶酶谱模式图
的基础上，将带型转化为基因型数据。
1.4.3聚类分析 将参试材料的基因型表示方法进行转
换，转换方式参考蔡礼鸿[23]，即将不同等位基因，“有”
表示为“0”，无表示为“1”，然后采用NTSYS2.1软件计
算全部参试材料之间的遗传距离，并根据遗传距离进
行UPGMA聚类分析。
2结果与分析
2.1不连续电泳系统优化结果
试验结果表明，凝胶的浓度对电泳的速度及酶谱
质量都造成很大的影响。凝胶浓度过低，粘度也就降
低，电泳速度加快，蛋白质分子的分辨能力也降低；凝
胶浓度过大，凝胶硬度变大，电泳速度减慢，同时影响
其分子筛的功能。根据优化结果，当浓缩胶PPA终浓
度为7%，分离胶PPA终浓度为 2.5%时，可得到较为
清晰的酶带（如图1）。
试剂名称用量/ml
20mlPAA终浓度 20mlPAA终浓度
分
离
胶
浓
缩
胶
分离胶缓冲液PH8.9Tris-Hcl(TEMED)
28%Acr-0.735%Bis
30%Acr-0.8%Bis
重蒸馏水
0.14%AP
浓缩胶缓冲液
PH6.7Tris-Hcl(TEMED)
10%Acr-2.5%Bis
40%蔗糖
0.004%核黄素
5.50%
2.5
3.93
-
3.57
10
7.00%
2.5
5
-
2.5
10
2.5%PAA
1
2
4
1
10.00%
2.5
7.14
-
0.36
10
5.00%
2.5
-
3.33
4.17
10
7.50%
2.5
-
5
2.5
10
3.75%PAA
1
3
3
1
10.00%
2.5
-
7.14
0.83
10
表2不同浓度分离胶及浓缩胶的配制
图1匍匐剪股颖POD同功酶谱电泳图
2.2POD等位酶位点变异分析
2.2.1酶谱分析
根据电泳检测结果，共检测到所有参试材料POD
等位酶的两个酶位点Pod-1、Pod-2，Pod-1有八条酶带，
迁移率（RF）分别为 0.031、0.046、0.065、0.088、0.111、
0.131、0.163、0.183；Pod-2有四条酶带，迁移率（RF）分
别为0.644、0.667、0.699、0.752；根据酶位点及迁移率
绘制成模式图（图2），然后再将模式图转化为基因型
（表3）。
2.2.2POD等位酶遗传多样性分析 根据POD等位酶
基因型统计结果（表3），检测到Pod-1、Pod-2两个酶位
点中，Pod-1位点等位酶四级结构为二聚体，Pod-2酶
位点为单聚体。Pod-1位点含Pod-1a、Pod-1b、Pod-1c、
Pod-1d四个等位基因，其中Pod-1a、Pod-1b、Pod-1c在
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表3匍匐剪股颖材料的基因型
材料编号
材料BSE1
材料BSE2
材料BSE3
材料BSE4
材料BSE5
材料BSE6
材料BNW1
材料BNW2
材料BNW3
材料BNW4
材料BNW5
材料BNW6
材料BNW7
材料LPS1
材料LPS2
材料LPS3
材料LPS4
材料LPS5
KROMI
Pod-1基因型
aaaabb
bbbbbb
abccdd
aaaabc
abcccc
abbbcc
aaabbb
aabbcc
aaabbc
aabbcc
abbccc
aabccc
aabbcc
abcccc
aaaabc
aaabcc
aabbbb
aaabbb
aaaabb
数据转换
111000110000000000000000
000000111111000000000000
100000100000110000110000
111100100000100000000000
100000100000111100000000
100000111000110000000000
111000111000000000000000
110000110000110000000000
111000110000100000000000
110000110000110000000000
100000110000111000000000
110000100000111000000000
110000110000110000000000
100000100000111100000000
111100100000100000000000
111000100000110000000000
110000111100000000000000
111000111000000000000000
111100110000000000000000
Pod-2基因型
abbccc
bbcccc
bbcccc
abcccd
ccccdd
abbccc
bccccd
bbcccd
abbccd
abccdd
abccdd
bcccdd
bcccdd
bcccdd
abcccd
abccdd
bbcccc
cccccc
abcccd
数据转换
100000110000111000000000
000000110000111100000000
000000110000111100000000
100000100000111000100000
000000000000111100110000
100000110000111000000000
000000100000111100100000
000000110000111000100000
100000110000110000100000
100000100000110000110000
100000100000110000110000
000000100000111000110000
000000100000111000110000
000000100000111000110000
100000100000111000100000
100000100000110000110000
000000110000111100000000
000000000000111111000000
100000100000111000100000
图2POD等位酶酶谱模式
注:1表示G01,2表示G02，其它依次类推。18表示开拓，19表示克罗米
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图3基于材料间POD等位酶DICE遗传相似系数的UPGMA聚类图
材料中出现频率最高，为主导基因，等位基因Pod-1d
只在材料3中出现一次。材料2的基因型也较为特殊，
其Pod-1位点只有Pod-1b一个等位基因，为纯合基因
型；Pod-2位点含 Pod-2a、Pod-2b、Pod-2c、Pod-2d四个
等位基因，其中Pod-2c出现频率最高，为Pod-2位点
主导基因，Pod-2a、Pod-2d在各参试材料中出现频率不
统一，表现出一定的多态性。
2.2.3聚类分析 将 POD等位酶基因型转化为“0”、
“1”矩阵（表 3），采用 UPGMA法进行聚类分析,获取
材料间的DICE遗传相似系数矩阵，然后根据 DICE
遗传相似系数，将供试材料分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ四大类
(图3)。第Ⅰ类包括毕节东南地区的两份材料：BSE1
和 BSE4，以及材料 BNW3、LPS2、对照 KROMI；第Ⅱ
类包含了来自毕节西北地区的大部分材料：BNW2、
BNW4、BNW5、BNW6、BNW7，六盘水地区的两份材
料LPS1、LPS3，以及材料BSE5；第Ⅲ类包含了毕节东
南地区的BSE3、BSE6两份材料；第Ⅳ类包含六盘水
地区的两份材料 LPS4、LPS5，以及材料 BSE2、
BNW1。
总的来说，除毕节西北地区的大部分材料聚为一
类外，其余材料并没有按地理位置聚为一类，在地理
位置上没有可寻的POD等位酶位点遗传变异分布规
律。
3讨论
3.1酶谱表型计算引起的差异
等位酶技术也被引进到牧草及草坪草种质资源研
究中，因其存在范围广、共显性表达、方法简单、结果迅
速等优点一度引起研究人员的兴趣，但这一研究手段
最终却没得到很好的推广、运用，一个很重要的原因就
是大多数研究人员对得到的酶谱，只做表性的比较，并
没有对酶谱做遗传学解释和分析，直接把酶带的数目
或迁移率的大小当作数量性状来计算材料间的遗传相
似性，往往得出与实际情况不符合甚至完全相反的结
论。
如图4，只有在单体酶时，酶谱相似性才与基因型
相似性一致，在其余情况下，均存在较大的差异。
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3.2带型与倍性之间的关系
各种酶的亚基数目不同，电泳之后，它们在酶谱上
的表现—带型也不同；即使是同一种酶，由于各种植物
的倍性不同，它们在酶谱上的表现也会不同，且呈现出
一定的分布规律。如图5，单体酶在不同倍性的不同基
因型的个体带型分布规律。
因此，在我们不确定植物倍性时，同时也可以根据
带型来确定植物的倍性。以本试验为例，据文献资料记
载，匍匐剪股颖有四种倍性:二倍体、三倍体、四倍体、
六倍体，我们可以根据带型确定匍匐剪股颖的倍性。根
据酶谱显示，Pod-1位点多为六条酶带，因此可以推断
剪股颖为四倍体或六倍体，因为试验采用的POD等位
酶，为单聚体或二聚体，在二倍体或三倍体的情况下最
多只能显示三条酶带。Pod-2位点多为四条酶带，可以
推断等位酶在该酶位点为单聚体，因为不管剪股颖为
四倍体还是六倍体在等位酶四级结构为二聚体情况
下，当等位基因数为2时，显示三条酶带；当等位基因
数为3时显示六条酶带。只有在等位基因数为4，且为
单聚体时显示四条酶带。对Pod-2位点的四条酶带进
行浓度比较发现，四条酶带浓度明显不一致，因此可以
确定匍匐剪股颖材料为六倍体，如果在四倍体的情况
下，四条酶带浓度应该是一致的。
4结论
试验共检测到贵州野生匍匐剪股颖两个POD等
位酶位点Pod-1、Pod-2。其中Pod-1位点等位酶为二聚
体，Pod-2酶位点为单聚体,两个酶位点均存在丰富的
遗传变异。根据酶位点变异结果,可将供试材料分为四
大类群，这表明通过等位酶分析物种间的亲缘关系是
可行的。但除毕节西北地区的大部分材料聚为一类外，
其余材料在地理位置上没有可寻的POD等位酶位点
遗传变异分布规律，这还有待于进一步研究。
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