全 文 ：第 30 卷 第 2 期
中 国 种 爹 c( 辑 )
S C I E N C E IN C H I N A ( S e r i
e s
C ) 2 0 0 0 年 4 月
亚洲棉 (+) 一6 一杜松烯合成酶基因 C连D l 一 的分离
及其在幼苗中的表达特征分析 ’
梁婉琪 谭晓萍 陈晓亚 *
(中国科学院上海植物生理研究所 , 植物分子遗传国家重点实验室 , 上海生命科学研究中心联系实验室 , 上海 20 0 0 3 2)
T
.
H a s h im o t o 丫 Y am ad a
(N
a r a In s t i t u t e o f Se i e n c e a n d eT
e h n o l o g y, N ar a 6 3 0
一
0 10 1
,
J a P a n )
.P H e i n s t e i n
(D e P a rt m e n t o f M e d i c i n a l C he 而 s tr y a n d M o l e e u l a r P hamr a e o l o g y, P u r d u e U n i v e r s i t y
,
W己s t L a fa y e t t e , IN 4 7 90 7 , U S A )
摘要 棉花倍半菇环化酶 , 即 (+) 一 6一杜松烯合成酶 (C A D ) , 由一个基 因家族编码 . 该
基因家族可分为两个亚族 : 以D l一 和 以D l 一C . 分离了亚洲棉以D l一 基 因 . 对亚洲棉
7 天龄幼苗的 m R N A 原位杂交表明, CA D I 一 和 CA D I 一 C 的转录子主要分布在侧根原
基 、 顶端分生组织和新生侧根的维管组织中, 在幼苗下胚轴的原形成层和部分表皮 、 下
表皮细胞中也有分布 . 以D l一 启动子在转基因烟草中表现 出相似的活性 . 组织化学实
验发现 , 倍半菇醛类分布于侧根根尖的外层细胞 以及地上部分的色素腺体中. 以D l 基
因在亚洲棉幼苗中的表达特征 , 以及倍半菇醛类的分布特征 , 组成 了棉花幼苗的化学
防御体系 .
关键词 棉花 倍半菇环化酶 棉酚 杜松烯 原位杂交
棉花含有大量的以棉酚为代表的酚性倍半菇衍生物 , 这些化合物对细菌 、 真菌 、 昆虫和哺
乳动物 (主要是单胃动物 )均具有毒性 , 是棉花防御机制的重要组成部分「’ 」. 研究表明 , 倍半菇
中间成分 6一杜松烯是所有棉酚类似物的生物合成前体 12 一 4〕 . 倍半菇环化酶催化法呢基二磷酸的
分子 内环化形成倍半菇中间体 15 一 7 ] , 棉花倍半菇环化酶的产物为 (+) 一 6一杜松烯 , 故该酶为 (+) 一 6 -
杜松烯合成酶 (C A )D , 其 c D N A 已经被克隆 2[,8 ,9] .
二倍体种亚洲棉的 C A D I 由多个基因成员 编码 . 已 克隆的 c D N A 可分为两个亚族 :
以 D l 一 A和 cA D I一 c . CA D I一 C 已有 3个成员被克隆 , 相互间的氨基酸序列 同源性达 95 % 以上 2[, ;l0
cA D I
一
A 的成员至今仅有 1个被分离 8[] , 其与 以D l 一 c 的氨基酸序列 同源性约为 80 % .
在植物倍半菇生物合成途径中 , 倍半菇环化酶是起主要调控作用的关键酶 5[ 一 , ] . 对亚洲棉
( G os syP iu
m ar bo er
“ m L . )悬浮培养细胞的分析发现 , 真菌激发子 (el ic t or )可显著诱导 以D l 基
19 9 9
一
0 3
一
2 9 收稿 , 19 9 9一0 5一 2 4 收修改稿
* 国家自然科学基金 (批准号 : 3 9 57 0 4 6 0) 和国家 “ 八六三 ” 高技术计划 (批准号 : z 一 17 一 0 2 一 0 4) 资助项 目 , 部分工作得到 日本
J S P S 资助
* * 联系人 (E 一m a i l : x y e h e n @ i r i s . s i p p , a e . e n )
中 国 科 学 (C辑 )第 30卷
因的转录 , 导致棉毒素的大量合成 12] . 此外 , 以病原细菌或真菌感染棉花植株 , 也可诱导受感
染组织的以D l 基因的表达 , 导致半棉酚等植保素的大量形成 13 ,4] . 然而 , 棉属植物具有色素腺
体 , 棉酚等化合物大量储存于腺体中 , 这并不需要环境因子的诱导 汇’ ” , ” ] . 为了深入研究 以D l
基因的表达特征及其与棉花倍半菇毒素生物合成的关系 , 我们分离了以D l 基因 , 利用转基因
烟草分析了 CA D I 基因启动子的活性 , ` 并用 m R N A 原位杂交分析了 以D l 基因在亚洲棉幼苗
中的表达特征 .
1 材料与方法
L l 植物材料
亚洲棉青阳小籽 ( G . a br o er u m L . c v . Q i n g y a n g x i a o z i )在含有 0 . 7%琼脂和 3%蔗糖的培养基
上 , 于 28 ℃萌发 、 培养 .
L Z 基因组文库筛选
从亚洲棉悬浮细胞中提取基因组 D N A[ 2] , cE 口 R l 部分酶切后与几 一 z A P 载体 ( s t ar t ag en e) 连
接 . 以 P e R 一 9 6 孔法 19 , ’ 2 ]筛库 . 将约 10 7 P F u 的文库稀释后分置于 9 6 孔 , 与 石 . e o l i x L 一B l u e 共
培养后 , 从每孔中取少量进行 P C R 检测 . 根据 以 D l 一A 的 c D N A 序列合成正向引物 93 1 60 和
9 6 T 一0 5 9 (表 一) , P e R 条件为 : 9 4 ℃ , 1 5 5 : 5 2 ℃ , 3 0 5 : 7 2℃ , 1 m i n : 3 0 个循环 . 选择阳性反应的孔
做下一轮筛选 . 经 4 轮筛选后 , 将噬菌体铺于 L B 平皿 , 再对单噬菌斑作 P C R 检测 , 获得阳性
克隆 , 释放质粒 . 以正向引物 9 3 5 1 10 0 和反向引物 % 1T 8 0 0( 表 l) 对基因组 D N A 作 P C R , 以获
得 CA D I一 的 3 ’ 端片段
.
D N A 序列以 D y e eT rm i n a t o r C y e一e S e q u e n e i n g F s R e a d y R e a c ti o n 试剂
盒 ( PE 一 A BI )测定 .
表 1 实验所用的 P C R 引物
引物名称
正向
9 3 16 0
9 3 5 1 10 0
反向
9 6 T 10 9 8
9 6 T 18 0 0
9 3 T 12 6
位置 /克隆 序列
7 7 6 /C月D l 一A
15 5 6 /C八D ] 一 A
C A C C A C T G C T C A A C T T A C A
G C T A C A A G G C A C T AT T A
15 2 4 /C AD I
一
A
2 4 7 6 /〔诗 D l 一A
1 39 /C 今D l 一 C ] ” )
A T T C G G G A G T T G G T T C
z、 T G
C C T T C A TT G T A C A A A C C T T
G G A C G C A I T T C A I…C C T T AT T
a
) 以D z一 c z 为文献 [2 ]的 e n N A 克隆
L 3 烟草的转化与分析
如图 1 所示 , 对 CA D I 诫 基因作酶切 , 获得一个 1 . 2 kb 的 iH nd l /H in d l 片段 , 该片段含有
CA D I一 基因编码区 5 ’ 末端 12 bP 及其上游序列 . 将此片段克隆到 p B s (K +) 的 iH nd l 位点中 ,
得到 p S K S P, 之后用 S a l l 酶切 , 补平 , 再以 x 占a l 酶切 , 所得片段插人 p B l l o l . 3 ( e lo n t e e h )的
Xb
a
l S/
a m l 位点 , 形成含 1 . 2 kb 启动子G/ us 嵌合基因的载体 PS PG U s . 为了构建长启动子载
体 , 将 p S K S P 以 Xh 口 I 酶切 , 补平 , 再以 E co R I 酶切 , 所得片段 克隆于 p B S K (+) 的
E co R V /cE
口 R l 位点 , 然后在其前端插人 CA D I 一A 基因的 3 . 3 kb 的 S al l B/ a m H I 上游片段 , 形
成 p S K L p 酶切 p S K L P, 收集 4 . 0 k b的 s a l l优占a l片段 , 最后将其接在 p B l l o l . 2 的 G vs 基因
前 , 即获得含长启动子 / G us 嵌合基因的载体 p L P G u (S 图 1) .
第 2期 梁婉琪等 :亚洲棉 (+)一 6一杜松烯合成酶基因 C AD了一 A的分离及其在幼苗中的表达特征分析 14 7
ū国。为叫一州 e闷工 lP卜七、工 lP芝 j、净名。 .闰工 lP三 1丈之翔场工 lP芯 H
己一兰月` ` 峪 (· )C咬 D l一 A A l… G lP乏一 1一口芝勺勺工 lP之一、
用 根癌农杆菌 L B A 4 4 4 o (Ag r ob a ct e r i um
t umefa
c is e ns t ra i nL B A 4 4 4 o
,
C l o n t e e h )介导 [ ’ 3 ] ,
将嵌 合基 因 转人 烟 草 革新 1 号 (iN c ot ian a
r a 吞a e u m L . c v . o e x i n 一 l ) . 以 4 一伞形酮基p一 D 一葡
糖昔酸为底物 , 荧光法检测 G u S 酶活性 ; 以
x
一
G fu c 为底物 , 做组织化学检测 [ ’ 4〕 . 定量分析
不少于 3 次重复 .
L 4 m R N A 原位杂交
以n 了一A 和以D 了一 c 的 e n N A 在 5 ’ 端 2 0 0 b p
区域 内相似性较低 ( 65 % , 全部核昔酸序列相似
性为 7 % ) , 故选择该区域作探针 . 以 以D l 一 c l
的 c D N A [2 ]为模板 , 以引物 T 3 和 9 3 T 12 6 (表 1)
作 P e R , 扩增得到 5 ` 端 13 9 b p片段 , 包含 6 8 b p
的编码 区 . 将此片段 克隆于 p B s (K +) 中 . 以
E c o R V 和 Xh o l 酶切 CA D I一 的 c o N A 克隆 [8 ] ,
补平 , 回收含质粒的大片段 , 然后 自连 , 所得
质粒含 以D l 一A 的 5 ’ 端 Z n bP 片段 , 包括 1 26
PL PG U S A l
,
G G US
三P之谓呜工之翔é勺口曰P冬之
PS P GU S AT G G US
图 1 亚洲棉 cA D I 一A 基因和启动子G/ US 嵌合
构建示意图
a() 以D l一 基因 . 该克隆于图示左边的 cE o R I 位点处断开 ,
其余的 3 ’ 端片段通过 P C R 获得 . ( b) 以D I一 基因上游约 4
kb 片段与 G US 报道基因依翻译顺序相连 , 形成 p L P G u S , c()
1
.
2 kb 的上游片段与 G us 报道基因相连 , 形成 sP P G u S
b p 编码 区 . 这两个质粒 分别用 E co R I 和 A sP 71 8 1 酶切 , 以 id g 一R N A 标记试剂 盒
(B o e h r i n g e r
一
M a n n h e i m )制作地高辛标记的反义和正义 R N A 探针 .
原位杂交根据已发表的方法进行 I` 5 , ’ “〕 . 取 7 d 的幼苗 , 切成片段后在 FA A 中固定 , 石蜡包
埋后做切片 , 厚度 1 0 林m o l zL , 切片脱蜡后用 0 . 0 5 m o l zL 盐酸处理 10 m i n , 蛋白酶 K (2 m g zm L )
37 ℃处理 30 m in , 45 ℃下与探针杂交 16 一 20 h . 经 R N as e A 处理 、 清洗后 , 切片加上碱性磷酸
酶偶联的抗体溶液 ( 1 : 3 0 0 0 ) . 最后加人含 n i t r o b l u e t e t r a z o l i u m (0 . 3 4 m g /m L )和 5 一b r o m o 一 4 -
e h l o r o
一
3
一
i n d o y l p h o s p h a t e t o l u i d i n s a l t (o一 7 5 m g /m L )的碱性缓冲液显色 1 一 2 d .
L S 倍半菇醛的定位
石蜡切片经二甲苯和乙醇脱蜡清洗后 , 浸人间苯三酚 /盐酸试剂 (2 m ol L/ 盐酸 , 1% 间苯三
酚 , 溶于 95 %乙醇 ) , 室温放置 5 m in , 弃去试剂后置于 5 ℃下 30 m in , 用乙醇淋洗 2 或 3 次后
封片 .
2 结果
.2 1 C A D I一 基因的克隆
从亚洲棉 .G ar bo er u m 基因组文库中分离到 1个克隆 , 限制酶分析表明插人片段长约 6 kb .
该基因组文库是用 E co R I 部分酶切的 D N A 构建的 , 其 5 ` 端未发现应有的酶切位点 . 顺序分
析表明 , 翻译起始密码子上游片段长约 4 kb , 包含编码区的内含子片段长 2 026 kb , 止于第 6
内元的 E co R I 位点 (图 1 , 2) . 将该基因片段与相应的 c D N A (CA D I 一 )A 比较 , 翻译起始密码子上
游的 94 bP 片段完全一致 , 外元序列仅 7 58 位 (刀 )G 和 1 573 位 (jT )C 两个核昔酸不同 , 后一变化
导致编码的天冬酞胺变成了天冬氨酸 , 其余完全相 同 , 故核昔酸序列相似性接近 9 . 9% . 为了
获得完整 的 以D l 一A 基因 , 我们根据 。 D N A 序列合成了 1个内部的正向引物和 1个 3 ’ 末端反
14 8 中 国 科 学 ( C 辑 ) 第 30 卷
第 2 期 梁婉琪等 : 亚洲棉 (+ ) 一 5 一杜松烯合成酶基因 cA D 了一A 的分离及其在幼苗中的表达特征分析 19 4
C A C G A C T G T T G C T G A C A T T T T A T G A T G C T T T T T T T A G G T G G T G G A A A G A T T T A G A C T T T A 十 1 1 2 4
W W K D L D F
C A A G A几A A C T A C C A T T T G C A A G A G A T A GA G T G G T T G A A GG C T A T T T T T G G A T 乃A T G G G A G + 1 1 8 4
T R K L P F A R D R V V E G Y F W 1 M G
T T T A C T T T G A A C C C C A A T A C T C T C T T G G T A G A A A G A T G T T G A C A A A几G T C A T A G C A A T G G + 1 2 4 4
V Y F E P Q Y 5 L G R K M L T K V 1 A M
C T T C C A T T G T T G A T G A T A C T T A T G A T T C A T A T G C A A C C T A T G A T G A A C T C A T T C C C T A T A + 1 3 0 4
A 5 1 V D D T Y D 5 Y A T Y D E L 1 P Y
C A A A T G C A A T T G A A GG T GA G A T T T T T T T T C C T T T C C T C C A A几几 A A A A A A A 几A G T T T T T G A 十 1 3 6 4
T N A I E
G A T C C C C C A A G A A TA G G G G A几乃A T A T A T G T T T T T A乃A C G T T A G G A T A T T C A C T C CA A C T T 十 1 42 4
G CA G T T G C T C A T A T T T T A A T GG T G A T A G T A T G八A C T A A C C A G G C T A A G T T T T A G A T T C A A + 1 8 4 4
A T T A A C C C T GA A A T T G T G T T T T A G G T G G GA T A T T A A A T G C A T G A A C C八A C T C C C G A A T T A + 1 5 4 4
R W D 1 K C M N Q L P N Y
C A T G A A A A T A A G C T A C A A G G C A C T A .T T A G A T G T T T A T G A A G A A A T G G A A C A G C T G T T G G C 十几6 0 4
M K 1 5 Y K A L L D V Y E E M E Q L L A
A A A T C A A G G G A G A C A G T A C C G A G T T GA G T A T G C G A几几几A G G C G G T A T G T 几A T G A T A C A A T + 1 6 6 4
N Q G R Q Y R V E Y A K K A
A G T A T G A T A T G C T T T A A T C A T A几A C G T A T A A月A T T T G I、A A A T T A C A T T A GC A A T T T G C T T 十 1 7 2 4
A C T T T T T T A T G C C T T T A A T C C T C A G A T G A T A C G T C T T G T T C A A G C T T A C C T T T T G G A G G C + 1 7 8 4
M 1 R L V Q A Y L L E A
C A八A T G G A C T C A T CA A A A T T A T A A A C C A A C C T T T G A G G A A T T T A G A GA T A A T G C A T T G C C 十 1 8 4 4
K W T H Q N Y K P T F E E F R D N A L P
八A C C T C T G G C T A T G C C A T G C T T G C T A T A A C GG C G T T T G T C G G C A T G G G C G A A G T T A T 乃A C + 1 9 0 4
T 5 G Y A M L A 1 T A F V G M G E V I T
C C C T G A GA C C T T C A A A T G G G C C GC C A G T G A C C C C A A G A T C A T T A A G G C T T C C A C C A T T A T + 1 9 6 4
P E T F K W A A 5 D P K 1 1 K A 5 T 1 1
T T G C A G G T T C A T G G A C G A T A T T GC T G八A C A T A A G G T A T A C T A T A T A T T C A T A T T C A A G A A + 2 0 2 4
C R F M D D 1 A E H K E 〔 o R I
T T C T A A A A A T C G A T T A T G G T A T A T A T A T G C A C T T 乃几A T C T A T A T C A T A GA A T T G T 八A G G C 十2 0 8 4
T T C T A G G G T T T G C A T T T G C T A A G T T 几A T T A A T A T A C A T G G T T C A T A T G GG T G C A G T T C A A + 2 1 4 4
F N
C C A T A G G A G A G A A G A C G A T T G C T C A G C G A T C G A A T G T T A C A T G A A A C A A T A T G G G G T G A C + 2 2 0 4
H R R E D D C 5 A 1 E C Y M K Q Y G V T
A G C G C A G G A A G C A T A C A A T G A A T T C A A C A A A C A C A T T G A G A G T T C A T G G A A A G A T G T A A A + 2 2 6 4
A Q E A Y N E F N K H 1 E 5 5 W K D V N
T G A A G A G T T C T T GA A A C C GA C A G A A A T G C C G A CA C C C G T T C T T T G T C G T A GC C T C A A C C T + 2 3 2 4
E E F L K P T E M P T P V L C R 5 L N L
T G C T A G G G T T A T G G A T G T A C T T T A CA G A G A A G G T G A C G G T T A T A C A C A T G T T G G G A A A G C + 2 3 8 4
A R V 何 D V L Y R E G D G Y T H V G K A
T G C T A A A G G T G G G A T C A C T T C A T T A T T G A T T G A T C C A A T A C A A A T T T G A 几A T T C A A C A T T 十2 4 4 4
A K G G 1 T 5 L L 1 D P 1 Q l *
G G C T T A A G A T T T A C T A T G A G A T A A A A T T A A T A A G G T T T G T A .C 共A T G A A G G + 2 49 4
图 2 亚洲棉 以 D 了一A 基因的核昔酸序列和推测 的氨基酸序列 (E M B L 登记号 : Y 18 48 ) 4
推测 的 T AT A 一盒 、 w 一盒 (T T G A C C) 和基因克隆断开处的 E co R I 位点 , 以及富含多聚 A 和多聚 T 的第 4 内元的
前半段以下划线表示 . 黑体表示用于从基因组 D N A 扩增基因片段的引物
向引物 , 用 P c R 从亚洲棉基因组 D N A 扩增了 9 83 bP 片段 . 测序结果表明其 3 ’ 端 6l bP 与
c D N A 的 3 ’ 端未翻译区完全一致 . 虽然位于最后一个外元的第 2 17 2( A/ )G 和 2 36 1( T/ )C 核昔酸
不同 ,但都不引起氨基酸的改变 (图 2) . 这些差异可能是因为基因组文库与 PC R 扩增作用的
D N A 来 自不同的细胞系 , 也可能是 P C R 产生的误差 .
在 cA D I 一A 基因翻译起始密码子上游一 142 bP 处有一推测的 T A T A 盒 (图 2) . 在一 4 6 饰 处
则有一个 w 一盒 (T T G A c )C , 这个六聚体顺序在欧芹 尸1R 基因启动子 中是与真菌激发子诱导活
性有关的 D N A 结合位点 I’ 7 , ’ “〕. 所有已报道 的植物菇类环化酶基因都具有相似的总体结构 , 6 个
内元位置保守 5[,6 ], 棉花 cA D I 一A 基因也不例外 . cA D I 一A 基因第 4 个内元比较特殊 , 具有一多
中 国 科 学 ( C辑 ) 第 30 卷
聚A (A 1 3) 序列 , 其前端有一 T 丰富区 , 内元的前半部分富含 AT ( 73 . 7% )并有单核昔酸重复片段
(图 2 ) .
.2 2 转基因烟草中 C注D l 一 启动子的活性
如图 1所示 , 将 cA D I 一A 基因 1 . 2 kb 上游片段和整个 4 kb 上游片段分别与 G us 报道基因
相连 . 在转基因烟草中 , 4 kb 启动子仅有较弱的活性 ; 而 1 . 2 kb 启动子活性强得多 , 在根 、 茎 、
叶中均检测到了较高的 G U S 比活性 . 然而 , 两启动子表达特征相似 , 在根部的活性均为最高
(表 1) . 转基因烟草 的组织化学染色表明 , G u S 活性主要集中在根部 , 尤其是新出现的侧根的
维管束中(图版 I 一 1 , 2 , 附本刊后 , 下 同 ) , 在茎和叶的维管束中也有分布 (图片未显示 ) .
表 2 转基因烟草中 G U S 比活性
构建 启动子长度 o tj s 比活性
“ ) zn m o x
·
h
一 , · m g一 ,
根 苹 叶
P S P G U S
P L P G U S
1
.
2 k b
一 4 k b
2 4 10
.
1 士 9 15
.
8
16 6
.
1 土 4 2
.
8
7 7 3
.
5 士 1 15
.
0
5 4 .6 士 7 0
.
3
5 24
.
4 土 10 8
.
4
]
`
0 士 ]名
a) 平均值士标准误差
2
.
3 m R N A 定位
m R N A 原位杂交显示 , 在亚洲棉 7天龄幼苗中 , 以D l 的 m R N A 存在于侧根基本分生组织 、
根维管组织 (尤其是韧皮部 )中 (图版 I 一 3 一 5) . 横切和纵切都显示 , 在侧根原基和侧根维管组织
中以D l 基因高水平表达 , 但在根冠 、 根成熟区的皮层和木质部未发现 以 D l 基因 m RN A 的
信号 . 在下胚轴中 , 木质部和韧皮部之间的原形成层细胞 , 以及一些表皮 、 下表皮细胞具有微
弱的信号 (图版 I 一 6 , 7) . 子叶中的信号太弱而检测不到 . 以 D l 一A 和 以D l 一 c 的转录子在亚洲棉
幼苗中的分布类型相似 . 这些结果表明 , 在侧根起始和发育早期 , 以D l 基因在分生组织和维
管束中高度表达 , 随着根组织的成熟 , CA D I 基因的表达主要集中在韧皮部 . 7 天龄幼苗的地上
部分 , 以D l 基因仅有微弱表达 .
.2 4 倍半菇醛类的分布
大多数棉花品种的地上部分有 肉眼可见的褐色腺体 , 化学分析表明腺体中存有大量的棉
酚 、 半棉酚等倍半菇醛类 , 这些化合物可与间苯三酚 /盐酸试剂反应产生红色的化合物 [ ’ “ ] . 用
该试剂处理切片 , 下胚轴和子叶的腺体显 出特征的红色 (图版 I 一9) , 这与预期的结果是一致的 .
侧根根尖除了根冠以外的外层细胞也明显染色 (图版 I 一 10) , 说明这些细胞可能含有大量倍半
菇醛类 . 这与侧根根尖细胞含有高水平 以D l 转录子是相当吻合的 . 应当指出 , 在石蜡切片制
作过程中 , 一些疏水化合物可能被洗脱 .
当加人碱性磷酸酶底物后 , 一些细胞变成褐色 、 深褐色 . 这些细胞的部位均靠近 以 D l 基
因表达的细胞 , 如根的内表皮 . 在侧根根尖 , 同样的细胞可与间苯三酚 /盐酸试剂显色 . 这些褐
色细胞同样出现在以正向 m R N A 作探针的样品中 , 因而与 以D 了转录子的信号无关 . 对这些
细胞中的化合物需做进一步分析 .
3 讨论
本研究发现亚洲棉根中倍半菇成分的生物合成相当活跃 , 倍半菇醛类大量存在于侧根根
尖的外层细胞中 . 早期曾有人用 S b 1C 3等试剂处理陆地棉 (.G hi sr ut “ m) 幼苗 , 指出倍半菇醛类分
布于主根根尖 3 。m 以上的部分 , 且侧根具有相似的分布「’ 9 ] . 这个报道与我们对亚洲棉的研究
第 2 期 梁婉琪等 : 亚洲棉 (+ ) 一6 一杜松烯合成酶基因 A cD ]一A 的分离及其在幼苗中的表达特征分析 1 51
结果不一致 . 原位杂交表 明 , 亚 洲棉侧根原基和顶端分生组织具有高水平的 CA D I 基因
m R N A
. 用间苯三酚 /盐酸试剂处理导致侧根根尖外层细胞染成明显 的红色 , 与原位杂交的结
果一致 (图版 I .)
通常参与植物次生代谢的酶有组织特异性分布 . 苯丙氨酸解氨酶 (PA )L 和查尔酮合成酶
(C H )S 是苯丙烷类代谢途径中两个起调节作用的酶 . 在 Me id ca go t ur o ca ut la 的根中 , PA L 和
C H S 的转录子在根尖和新生的侧根中大量分布 l20] , 这与棉花 cA D I 基因的表达很相似 . 在激
发子处理的烟草悬浮培养细胞中 , 编码 5 一 eP i一马莞铃烯合成酶 (E A s , 一种倍半菇环化酶 )的基
因被诱导表达 12 `〕 . 尽管尚无 EA s 基因的表达受发育调控的报道 , 但 EA s4 基因的启动子在根和
茎的下表皮以及维管束周围的细胞中表现出很强 的诱导表达 , 这显然是植物抵抗微生物的一
种反应 2[] . 棉花幼苗 cA D I 基因的表达方式和倍半菇醛的分布特征显然与棉花防御体系有关 .
地上部分的富含化学成分的溶腔性腺体 , 使棉花抵御害虫的能力大大提高 ; 在根部 , 倍半菇醛
类在外层细胞 、 尤其是侧根根尖和根迹区域的大量存在 , 显然与 CA D I 基因在侧根原基和顶端
分生组织的表达密切关联 , 这形成了抵御微生物浸染的化学屏障 .
尽管棉花和烟草的倍半菇合成调控机制存在差异 , 两者亲缘关系也不很接近 , 但 以D l 一A
启动子在转基因烟草中表现出与在棉花 中相似的表达特性 . 因此 , CA D I 一A 启动子在植物抗病
基因工程中有潜在的应用价值 . 例如 , 该启动子在侧根发生时高水平表达 的特性 , 对于利用基
因工程改善植物根际的抗病抗逆能力具有重要意义 ,
参 考 文 献
2
3
4
5
6
7
8
9
10
l l
B e l l A A
,
S t i Pa n o v i e R D
.
T he c h e m i e a l e o m P o s i t i o n
,
b i o lo g ie a l a e t i v i t y, a n d g e n e t i e s o f Pi g me
n t g la n d s i n e o t ot n
.
In :
P r o e e e d i n g s o f th e B e l tw i d e C o t t o n P r o d u e t i o n R e s e a r e h C o n fe r e n e e
.
A t l a n t a
,
19 7 7
.
24 4 、 2 5 8
C h e n X .Y C h e n Y, H e i n s t e i n 只 e t a l . C l o n in g , e x P re s s i o n , a n d e h a r ac t e ir z a t i o n o f ( + )一 6一 e a d i n e n e s y n t h a s e : a e a t a ly s t fo r
c o t t o n p h y t o a l e x i n b i o s y n th e s i s
.
A r e h B i o e he m B i o Ph y s
,
19 9 5
,
32 4 : 25 5 一 2 6 6
A l e h a n n a t i l
,
p a t e l J A A
,
L i u J
,
e t a l
.
T h e e n z y m a t i e e y e l i z a t i o n o f n e r o l id y l d iP h o sP h a t e by 6
一
e a d in e n e s y n th a s e fr o m e o r t o n
s t e l e t i s s u e in fe e t e d w i th Ve r t i c i l l i u m dh
a l i a e
.
p h y t o e he m i s t r y
,
19 9 8
,
4 7 : 9 6 1 一 9 6 7
D a v i l a
一
H u e r t a G
,
H a m a d a H
,
D a v i s G D
,
e t a l
.
C a d i n a n e
一
t y P e s e s q u i t e rp
e n e s i n d u c e d in G o s 占〕了, i u m e o t y le d o n s b y b a e t e r i a l
i n o e u l a t i o n
.
P h y t o e h e m i s tr y
,
19 9 5
,
3 9 : 5 3 1 一 5 3 6
B o h lm a n n J
,
M e y e r
一
G a u e n G
,
C r o t e a u R
.
P l a n t t e r P e n o id s y n t h a s e s : m o l e e u lar b i o l o g y a n d Ph y l o g e n e ti e a n a l y s i s
.
P r o e N a t l
A e a d S e i U S A
,
19 9 8
,
9 5 : 4 12 6 一 4 13 3
C h a P P e l l J
.
B i o e h e m i s t r y a n d m o l e e u l a r b i o lo g y o f t h e i s o P r e n o id b i o s y n th e t i e P a th w a y in P l a n t s A n n u R e v P l a n t Ph y g i o l
P l a n t M
o l B i o l
,
19 9 5
,
4 6 : 5 2 1 一 5 4 7
S t a rk s C M
,
B a e k K
,
C h ap P e l l J
,
e t a l
.
S t r u e t u r a l b a s i s fo r c y e l ie t e rp
e n e b io s y n th e s i s b y r o b a e e o s
一
eP i
一
ar i s t o l o e h e n e s y n t h a s e
.
S e i e n e e
,
19 9 7
,
2 7 7 : 1 8 1 5 一 1 8 2 0
Ch e n X Y, W a n g M S
,
C h e n Y,
e t a l
.
C l o n i n g a n d h e t e r o l o g o u s e x p r e s s i o n o f a s e c o n d e o t t o n (
+
)
一
6
一
e a d i n e n e s y n ht a s e
.
J N a t
P r o d
,
19 9 6
,
5 9 : 9 4 4 一 9 5 1
M e n g Y L
,
J i a J W, L i
u e J
,
e t a l
.
e o o r d i n a t e d a e e u m u l a t i o n o f (
+
)
一
5
一
e a di n e n e s y n th a s e m R N A s a n d g o s s y p o l i n de v e l o p in g
s e e d s o f G o s s 〕 , , i u爪 h isr u r z` ” 诬 a n d a n e w m e m be r o f t he c a d l fa m i z y for m G双动 o er u m . J N a t P r o d , 19 9 9 , 6 2 : 2 4 5 一 2 52
B e l l A A
,
S t iP a n o v i e R D
,
O
’
B r i e n D H
,
e t a l
.
S e sq u i t e印 e n a ld e h y d e q u in o n e s a n d d e r i v a t i v e s i n P ig m e n t g lan d s o f
G o s j J坚, i u m . P h y t o e h e m i s t r丫 19 7 8 , 17 : 1 2 9 7 一 1 30 5
S t a n fo
r d E E
,
V i e h o e v e r A
.
C h e m i s t r y a n d h i s t o l o g y o f t h e g l a n d s o f th e e o t t o n Pl a n t
,
w iht n o t e s o n ht e o e e u r r e n c e o f s im i la r
g l a n d s j n er ] a t e d P ! a n t s
.
J A g r R e s
,
] 9 ] 8
,
] 3 : 4 ] 9 一 4 3 5
1 5 2 中 国 科 学 (C 辑 )第 0 3卷
l 7
l 8
l 9
2 0
2 1
2 2
A l fa n d a r i D
,
D a r r i b e r e T
.
A s im P l e p C R m e th o d fo
r s e r e e n i n g e D N A l i b r a r i e s
.
p C R M e th o d A P Pl i
,
19 9 4
,
4 : 4 6 一 4 9
H o r s e h R B
,
F r y J E
,
H o f f l l l a n N L
,
e t a l
.
A s i m P l e a n d g e n e r a l m e th o d fo
r t r a n s fe r i n g g e n e s in t o P la n t s
.
S e i e n e e
,
19 8 5
,
2 2 7 :
1 2 29 一 1 2 3 1
J e fe
r s o n R A
.
A s s a y i n g e h im e r i e g e n e s i n P l a n t s : t h e G U S g e n e fu s i o n s y s t e m
.
p l a n t M
o l B i o l R e P
,
19 8 7
,
5 : 3 8 7 一 4 0 5
M e y e r o w i z E M
.
nI s i r u h y bir d i z a t i o n i n p l a n t t i s s u e
.
p l a n t M o l B i o l R e p
,
19 57
,
5 : 24 2 一 2 5 0
R i k h e l N 丫 B e d n a r e k 5 Y, L e r n e r D R . nI s i r u h y b r id i z a t i o n i n Pl a n t t i s s u e s, P l a n t M o l e e u l a r B i o lo g y M a n u a l , 19 8 9 , B g :
l ~ 32
M
e i e r l
,
H a h lb r o e k K
,
S o m s s i e h 1 M
.
E li e i t o r
一
in d u c ib l e a n d e o n s t i t u t i v e i n v i v o D N A fo o tP r in t s i n d i e a t e n o v e l e i s
一
a e t i n g
e le m e n t s i n t h e p r o m o t e r o f a p a r s e ly g e n e e n e o d in g p a t h o g e n e s i s r e l a t e d p ro t
e i n 1
.
P la n t e e l l
,
19 9 1
,
3: 30 9 一 3 15
R u s h t o n P J
,
OT r
e s J V, P a nr i
sk e M
,
e t a l
.
In t e r a e t io n o f e l i e i t o r
一
i n du e e d D N A
一
b in d i n g P r o t e in s w i th e l i e i t o r r e sP o n s e
e l e m e n t s i n th e P r o m o t e r s o f P a r s l e y P R I g e n e s
.
E M B O J
,
] 9 9 6
,
15 : 5 6 9 0 一 5 7 0 0
M a c e M E
,
B e l l A A
,
S t iP a n o v i e R D
.
H i s t o e h e m i s t r y a n d i s o l a t io n o f g o s s y P o l a n d re l a t e d t e rp
e n o id s in r o o t s o f c o t t o n
s e e d l i n g s
.
P h y t o P a th o l
,
19 7 4
,
64 : 1 2 9 7 一 1 30 2
H ar r i s o n M J
,
D i x o n R A
.
S P a t i a l P a t t e r n s o f e x P r e s s i o n o f if a v o n i d / i s o if a v o n o i d P a t h w a y g e n e s d u r i n g i n t e r a e t i o n s b e tw e e n
r o o t s o f M e d i e a g o t r u n e a t u l a a n d t h e m y e o hr i
z a l fu n g u s G l o m u s v e rs lfo rm
e
.
p l a n t J
,
19 94
,
6 : 9 一 2 0
F a e e h i n i P J
,
C h a P P e l l J
.
G e n e fa m i l y fo
r a n e l i e i t o r
一
i n d u e e d s e s qu i t e rp
e n e e y e l a s e i n t o b a e e o
.
P r o e N a t l A e a d S e i U S A
,
19 9 2
8 9 : 1 1 0 8 8 一 l ] 0 9 2
Y in S
,
M e i L
,
N e w m a n J
,
e t a l
.
R e g u l a t i o n o f s e s q u i t e rp
e n e e y e l a s e g e n e e x P r e s s i o n : e h ar a e t e r i z a t i o n o f a n e l i e i t o r
一
a n d
P at h o g e n
一
i n d u e ib l e P r o m o t e 肚 P l a n t P h y s i o l
,
19 9 7
,
1 15 : 4 3 7 一 4 5 1
2
八」口卫且, .
4
工fù
6
1胜, .且J I