全 文 ：doi:10． 7522 / j． issn． 1000-0240． 2014． 0028
Yang Xiuli，Zhang Baogui，Zhang Wei，et al． Characteristics of cultivable bacterial community in rhizosphere soil of Achnatherum splendens Trin in
the upper reaches of the Shule Ｒiver，Qilian Mountains［J］． Journal of Glaciology and Geocryology，2014，36(1) :222 － 229． ［杨秀丽，张宝贵，
张威，等． 祁连山疏勒河上游芨芨草根际可培养细菌群落特征研究［J］． 冰川冻土，2014，36(1) :222 － 229．］
祁连山疏勒河上游芨芨草根际可培养细菌群落
特征研究
收稿日期:2013-09-07;修订日期:2013-12-29
基金项目:国家重点基础研究发展计划(973 计划)项目(2012CB026105) ;国家自然科学基金项目(30800154;31170465;31100365)资助
作者简介:杨秀丽(1987 －) ，女，甘肃金昌人，2011 年毕业于天水师范学院，现为兰州交通大学在读硕士研究生，主要从事环境微生物
研究
* 通讯作者:薛林贵，E-mail:Xuelg@ mail． lzjtu． cn
杨秀丽1， 张宝贵2， 张 威2， 刘光琇2， 陈 拓2， 薛林贵1*
(1．兰州交通大学 化学与生物工程学院，甘肃 兰州 730070; 2．中国科学院 寒区旱区环境与工程研究所
沙漠与沙漠化重点实验室，甘肃 兰州 730000)
摘 要:以疏勒河上游不同海拔芨芨草根际土壤样品为研究对象，研究了不同海拔土样中细菌分布特
征及其影响因素． 结果表明:研究区域芨芨草根际土壤可培养细菌种群密度变化范围为 1． 7 × 107 ～
10． 8 × 107 CFU·g －1，平均值为 6． 4 × 107 CFU·g －1，随海拔的升高呈先下降后上升的趋势;可培养细
菌数量与土壤全氮、脲酶、蔗糖酶含量呈极显著正相关关系，与有机碳、磷酸酶含量呈显著正相关关
系;同时，pH值也是影响细菌数量与多样性的一个重要因素． 通过 16S rDNA 基因测序及构建系统发
育树，研究区域可培养细菌归类为 15 个属，其中芽孢杆菌属和假单胞菌属为优势菌属．
关键词:疏勒河上游;芨芨草;根际细菌;土壤理化性质;系统发育树
中图分类号:Q938． 1 文献标识码:A 文章编号:1000-0240(2014)01-0222-08
0 引言
植物根际微生物多且活跃，聚居着的微生物包
括细菌、真菌、藻类、原生动物和病毒等，其中以
细菌为主［1］． 植物作为第一生产者同化大气 CO2，
将部分光合产物转运至地下，激发土壤微生物的生
长和新陈代谢;土壤微生物则将有机态养分转化成
无机形态，利于植物吸收利用［2］． 植物-微生物的这
种互作关系维系和主宰着陆地生态系统的功能，同
时也对全球气候产生影响［3 － 4］． 因此，根际微生物
研究是当今科学界关注的热点领域．
芨芨草(Achnatherum splendens Trin)群落广泛
分布于我国西北地区，是干旱与半干旱地区十分重
要的植被资源，具有耐盐碱、耐干旱、耐寒冷等特
点，并具有水土保持等生态功能，同时还可以作为
牛羊越冬饲草［5］． 关于植物根际微生物的研究已经
很多，而关于芨芨草根际微生物研究相对较少，仅
见王仲科等［6］针对新疆沙漠人工种植芨芨草根际
微生物数量做了初步研究;胡文革等［7］研究了盐碱
地环境下芨芨草根际微生物数量特征，而关于疏勒
河上游芨芨草根际微生物数量、多样性以及影响因
素还鲜有报道．
疏勒河流域近几十年来日益受到关注，特别是
在全球气候变暖背景下，该流域已经凸显出一系列
生态环境问题，如植被衰亡、草场退化、泉水衰减、
土地盐渍化及沙漠化［8］，已有相关研究报道了疏勒
河上游大型土壤动物［9］、植被类型［10］以及多年冻
土［11］的变化情况，而对于微生物研究鲜有报道． 本
文首次研究了疏勒河上游不同海拔芨芨草根际土壤
细菌群落结构变化，旨在探讨细菌群落结构对环境
因子的响应机制．
1 材料和方法
1． 1 研究区概况
疏勒河流域地处青藏高原东北部祁连山西段，
是河西走廊三大内陆河流域之一，发源于祁连山境
第 36 卷第 1 期
2014 年 2 月
冰 川 冻 土
JOUＲNAL OF GLACIOLOGY AND GEOCＲYOLOGY
Vol． 36，No． 1
Feb．，2014
内的沙果林那穆吉木岭，主要水源依靠冰雪融水补
给． 其上游(96． 2° ～ 99． 0° E，38． 2° ～ 40． 0° N)位
于疏勒南山与托来南山之间，汇集了数 10 条冰川
支流，区域面积约 1． 1 × 104 km2，是典型的大陆性
气候，光热资源异常丰富，降雨稀少，多风沙，特
别是在春季． 多年平均日照时数 3 265． 4 h，气温最
低达 － 39 ℃，最高达 36． 7 ℃，年平均降水量
62． 1 mm，年均蒸发 2 808． 0 mm［12］．
1． 2 样品采集
2011 年 8 月，采集海拔 1 260 ～ 2 985 m 之间 8
个样点的芨芨草根际土样，每个样点设 3 个重复，
低温下(4 ℃)运回实验室，于 － 20 ℃保存备用． 同
时，采集用于土壤理化性质分析的样品．
1． 3 土壤理化性质分析
土壤含水量采用烘干法(105 ℃，24 h)测定;
pH值采用 pH 计(PB-10，sartorius)来测定(土:水
= 1:2． 5，w /v)［13］;有机碳、全氮采用 C /N 分析仪
(Elementar Vario-EL，Germany)测定［14］;土壤酶活
参照关松荫［15］的方法，测定了脲酶、蔗糖酶、过氧
化氢酶、磷酸酶的活性．
1． 4 细菌的分离培养
采用牛肉膏蛋白胨培养基进行培养实验． 在超
净台中称取 2 g 新鲜土样，加入装有 5 颗玻璃珠的
经灭菌处理的 50 mL 三角瓶中，再加入 18 mL 无菌
生理盐水(0． 85%) ，在 4 ℃恒温摇床上以 150 r·
min －1振荡 30 min;静置片刻，待大颗粒物质沉淀
后，吸取 100 μL 上清液加入900 μL无菌生理盐水
中，混匀后再从此溶液中吸取 100 μL 溶液加入
900 μL生理盐水中，依此类推梯度稀释直至 10 －6 ．
吸取 10 －6的土壤悬液 0． 2 mL 涂布到直径 90 mm 平
板上，同一样品分别设置 3 个平行实验． 置 25 ℃下
恒温培养一周后进行菌落计数．
1． 5 可培养细菌的 16S rDNA PCＲ扩增
根据菌落形态、大小、颜色等特点，对每个样
品长出的细菌进行划线纯化培养． 用扎菌落与液氮
快速冻融相结合的方法提取纯化菌落细菌 DNA 并
进行 16s rDNA 扩增，扩增引物为细菌通用引物 8F
(5 － AGAGTTTGATCCTGGCTCAG －3)和 1492Ｒ
(5 － GGTTACCTTGTTACGACTT －3)［16］．
扩增体系为 2U 的 Taq DNA 聚合酶(MBI，Fer-
mentas) ，1 × Taq buffer，2 mmol·L －1 MgCl2，0． 2
mmol·L －1 dNTP，引物各 10 pmol［17］． 同时，用无菌
去离子水代替单菌落模板用作 PCＲ反应的阴性对照．
PCＲ反应扩增条件:94 ℃预变性 5 min后进入
30 个扩增循环，每个循环包括 94 ℃变性 1 min、
58 ℃退火 1 min和72 ℃延伸 1． 5 min，最后在72 ℃
延伸 10 min． 3μL PCＲ产物用 1． 0%(质量浓度)琼
脂糖凝胶(含 EB)电泳检测．
1． 6 限制性内切酶分析(Amplified ribosomal
DNA restriction analysis，AＲDＲA)
将 10 μL 纯化后的 PCＲ扩增产物分别用 1． 5 U
限制性核酸内切酶 HaeⅢ 和 AluI (MBI，Fermenta)
于 37 ℃酶切 16 h，酶切产物以 2． 5%的琼脂糖凝胶
电泳分析酶切带型．
1． 7 16S rDNA序列测定
将所有具有不同带谱的 16S rDNA 进行序列测
定，测序引物共两条:27F(5’－ AgAgTTTgATC-
CTggCTCAg － 3’) ，1492Ｒ［18］． 共获得 31 条 16S
rＲNA 基因几乎全长的序列，序列提交至 Gene-
Bank，登录号为:KC789760 ～ KC789790．
1． 8 序列比对及系统发育树的构建
将序列在 GenBank数据库进行比对，下载高质
量最相似的序列进行系统发育树的构建． 通过软件
Clustal X 进行多序列联配，使用 Jukes＆Cantor 法计
算进化距离，用临接法(neighbor-joining method)分
析后，通过软件 MEGA5 构建系统发育树，然后通
过 Bootstrap法对系统发育树进行评估分析［19］．
1． 9 相关性分析
运用 SPSS 17 和 CANOCO 4． 5 分析数据间的
相关性．
2 结果分析
2． 1 可培养细菌数量特征
在疏勒河上游区域，芨芨草根际土壤可培养细
图 1 可培养细菌数量随海拔的变化
Fig． 1 The number of cultivable bacteria changes with altitude
3221 期 杨秀丽等:祁连山疏勒河上游芨芨草根际可培养细菌群落特征研究
表 1 芨芨草根际土壤理化性质
Table 1 Biochemical properties of the rhizosphere soils changing with altitude
海拔
/m
全氮
/%
有机碳
/%
pH值
含水量
/%
脲酶
/(mg·g －1·(24h)－1)
蔗糖酶
/(mg·g －1·(24h)－1)
过氧化氢酶
/(mL·g －1·h －1)
磷酸酶
/(mg·g －1·(24h)－1)
1 260 0． 147 1． 749 8． 12 5． 29 0． 081 3． 635 5． 106 0． 062
1 353 0． 054 1． 612 8． 18 2． 73 0． 037 2． 603 4． 970 0． 040
1 640 0． 035 0． 978 8． 38 1． 69 0． 014 0． 322 4． 758 0． 012
2 035 0． 042 1． 173 8． 35 1． 83 0． 023 0． 485 4． 876 0． 029
2 232 0． 057 1． 247 8． 34 2． 03 0． 044 1． 347 5． 346 0． 043
2 540 0． 063 1． 498 8． 22 2． 57 0． 071 1． 715 5． 412 0． 094
2 784 0． 134 1． 526 7． 93 12． 68 0． 075 3． 429 5． 849 0． 248
2 985 0． 141 1． 713 7． 84 13． 58 0． 098 3． 563 5． 957 0． 359
表 2 芨芨草根际土壤细菌数量与理化因子相关性分析
Table 2 The correlation coefficients between bacteria number and biochemical factors in rhizosphere soil
TN TOC pH 含水量 脲酶 蔗糖酶 过氧化氢酶 磷酸酶
细菌数量 0． 966＊＊ 0． 843* － 0． 897* 0． 801 0． 922＊＊ 0． 974＊＊ 0． 818 0． 841*
TN 0． 738 － 0． 775 0． 659 0． 851* 0． 906* 0． 659 0． 764
TOC － 0． 949＊＊ 0． 946＊＊ 0． 915＊＊ 0． 853* 0． 942* 0． 99＊＊
pH值 － 0． 977＊＊ － 0． 933＊＊ － 0． 944＊＊ － 0． 981＊＊ － 0． 918＊＊
含水量 0． 886* 0． 87* 0． 994＊＊ 0． 906*
脲酶 0． 937＊＊ 0． 904* 0． 877*
蔗糖酶 0． 889* 0． 825
过氧化氢酶 0． 895*
注:＊＊ p － value ＜ 0． 01，极显著相关;* p － value ＜ 0． 05，显著相关．
菌数量为 1． 7 × 107 ～ 10． 8 × 107 CFU·g －1，平均为
10． 8 × 107 CFU·g －1 ． 细菌数量随海拔的升高呈先
下降后上升的趋势，不同海拔芨芨草根际土壤样品
细菌数量之间存在显著性差异(图 1)．
2． 2 可培养细菌数量与土壤理化因子关系分析
研究区域土壤为碱性土壤，全氮含量相对较低
(表 1) ，不同海拔芨芨草根际细菌数量与土壤全
氮、有机碳、pH值、脲酶、蔗糖酶、磷酸酶均显著
相关(表 2)． 其中，细菌数量与全氮(r = 0． 966，
p = 0． 001)、脲酶(r = 0． 922，p = 0． 007)、蔗糖酶
(r = 0． 974，p ＜ 0． 001)呈现极显著正相关关系，与
有机碳(r = 0． 843，p = 0． 048)、磷酸酶(r = 0． 841，
p = 0． 05)呈 现 显 著 正 相 关 关 系，与 pH 值
(r = 0． 897，p = 0． 016)呈显著负相关关系． 与土壤
含水量(r = 0． 801，p = 0． 087)、过氧化氢酶(r =
0． 818，p = 0． 07)相关性不显著．
2． 3 可培养细菌多样性
根据菌落形态，共挑选出 115 株菌落进行纯
化，PCＲ扩增后产物进行酶切分析． 根据结果对 31
株菌株进行 16S rDNA 测序，序列已经提交至 Gen-
bank数据库．
序列通过和 Genbank数据库中序列比对，构建
系统发育树(图 2) ，31 株具有代表性的菌株归类为
15 个属，分属于 6 个系统发育组:α －变形菌(α －
Proteobacteria) ，β －变形菌(β － Proteobacteria) ，γ
－变形菌(γ － Proteobacteria) ，高 G + C革兰氏阳性
类群(high G + C gram positive bacteria) ，低 G + C革
兰氏阳性类群(low G + C gram positive bacteria)和嗜
纤维菌-黄杆菌-拟杆菌类群(CFB group bacteria)．
变形菌门细菌为革兰氏阴性菌． 研究区域可培
养细菌多样性分布以 α －变形菌和低 G + C 类群为
主，分别有 7 株分离到的菌株归类于以上两大类
群，归属于3个属:菌株BGＲ2、BGＲ6、BGＲ10、
422 冰 川 冻 土 36 卷
图 2 芨芨草根际土壤细菌系统发育树
Fig． 2 Phylogenetic tree of bacteria in rhizosphere soil
BGＲ29、BGＲ30 归属于短波单胞菌属(Brevundi-
monas) ;菌株 BGＲ9 经序列比对鉴定为 Kaistia 属;
菌株 BGＲ12 归属于土壤杆菌属(Agrobacterium)．
研究区域分离得到 5 株菌归属于 β －变形菌，
仅发现一个属，归属于罗尔斯通菌属(Ｒalstonia)．
菌株 分 别 为 BGＲ3、 BGＲ16、 BGＲ24、 BGＲ26、
BGＲ27．
研究区域分离得到5株菌归属于γ － 变形菌，
5221 期 杨秀丽等:祁连山疏勒河上游芨芨草根际可培养细菌群落特征研究
表 3 芨芨草根际土壤细菌多样性指数随海拔的变化
Table 3 The index of bacterial diversity in rhizosphere soil changing with altitude
海拔 /m 1 260 1 353 1 640 2 035 2 232 2 540 2 784 2 985
多样性指数 1． 24 1． 41 0． 57 1． 37 1． 83 1． 37 1． 01 1． 33
分属于 4 个属． 菌株 BGＲ1 归属于黄色单胞菌属
(Luteimonas) ;菌株 BGＲ5、BGＲ7 归属于假单胞菌
属(Pseudomonas) ;菌株 BGＲ19 归属于溶杆菌属
(Lysobacter) ;菌株 BGＲ25 归属于盐单胞菌属
(Halomonas)．
低 G + C类群与高 G + C类群为革兰氏阳性菌．
有 7 株分离到的菌株属于低 G + C 类群，为研究区
域优势类群，分属于 3 个属． 其中，菌株 BGＲ4、
BGＲ11、BGＲ17、BGＲ21、BGＲ28 归属于芽孢杆菌
属(Bacillus) ;菌株 BGＲ23 通过序列比对，鉴定归
属于类芽孢杆菌属(Paenibacillus) ;菌株 BGＲ20 归
于动性球菌属(Planococcus)．
研究区域分离到的 6 株可培养细菌归类于高 G
+ C 类群，分属于 3 个属:菌株 BGＲ31、BGＲ13、
BGＲ15、BGＲ18 4 株菌归属于节细菌属(Arthrobact-
er) ，菌株 BGＲ14 归属于 Labedella，菌株 BGＲ22 归
属于刘志恒菌属(Zhihengliuella)．
研究区域只发现 1 株细菌归类为 CFB类群，分
属于 Olivibacter，菌株为 BGＲ8． 研究区域土壤可培
养细菌中数量以芽孢杆菌属和假单胞菌属为主． 其
中，芽孢杆菌属随海拔升高有下降趋势，所占比例
最高达 50． 61%，最低为 5． 38% ． 假单胞菌属变化
趋势与芽孢杆菌属相反，随海拔升高有上升趋势
图 3 芨芨草根际土壤假单胞菌属和芽孢杆菌属的相对丰度
Fig． 3 The relative abundances of Pseudomonas，Bacillus
and others in the soils
(图 3) ，所占比例最高达 68． 51%，最低为 12． 2% ．
此外，通过香浓多样性指数计算不同海拔土样
细菌多样性指数发现，除 1 640 m 细菌多样性指数
低于 1 以外，其他均大于 1(表 3)． 应用 CANOCO
ＲDA分析得到土壤 pH值是影响多样性指数的一个
重要指标(图 4) ，多样性指数与土壤 pH 值呈显著
负相关关系(p ＜ 0． 05)．
图 4 基于 ＲDA分析的多样性指数与土壤理化性质之间的关系
Fig． 4 The correlation between diversity index and soil physicochemical properties derived from ＲDA analysis
622 冰 川 冻 土 36 卷
3 讨论
根际微生物的数量及分布可以作为土壤环境
质量［20］与植物营养利用情况［21］的一个重要指标，
研究区域芨芨草根际土壤可培养细菌数量变化范围
为 1． 7 × 107 ～ 10． 8 × 107 CFU· g －1，平均值为
6． 4 × 107 CFU·g －1，而在新疆石河子沙漠地区，人
工种植 5 a生芨芨草根际细菌平均数量为 2． 9 × 106
个·g －1［6］． 而当种植年限达到 7 a和 10 a时，芨芨
草根际细菌数量分别达到 4． 2 × 107和 7． 3 × 107
个·g －1［7］，说明短期内人工种植的芨芨草还无法
与自然状态下芨芨草根际细菌数量相比．
研究区域可培养细菌归类为 15 个属，分属于 6
个系统发育组:即 α －变形菌，β －变形菌，γ －变
形菌，低 G + C 革兰氏阳性类群，高 G + C 革兰氏
阳性类群和 CFB类群，其中变形菌门与低 G + C 类
群为优势菌门，而 CFB 类群含量较少，这与在茶
树［22］、印度橡树［23］、法国桃树［24］以及南美洲安第
斯山高海拔地区植物［25］根际微生物研究结果一致，
说明植物根际环境孕育着相似的微生物群落． 在属
水平上，本研究中芽孢杆菌属和假单胞菌属为优势
菌属，Benizri等［24］发现法国健康桃树根际微生物
超过 60%为假单胞菌属，Marcela 等［25］也得到类似
研究结果． 本研究中芽孢杆菌属随海拔升高有下降
趋势，芽孢杆菌属为植物根际促生菌，能促进植物
生长，提高植物抗性，同时可以加速土壤营养元素
循环［26］，这可能也是低海拔地区芨芨草密度和生
长状况相对较好的原因之一． 而假单胞菌属含量随
海拔升高有上升趋势，相关机理有待进一步研究．
细菌数量受海拔影响显著，其数量随海拔升高
呈先下降后上升趋势，这是由于温度、降水量、植
被等均随海拔梯度的变化而造成的［27］． 本研究中
细菌多样性没有表现出明显的海拔变化规律，这与
前人的报道结果不一致． Staddon 等［28］发现随着海
拔的升高，细菌多样性会下降，这可能是由于微生
物的地理分布格局差异所造成． 本研究中，细菌多
样性指数介于 0． 57 ～ 1． 83 之间，平均值为 1． 27，
总体上与贫瘠土壤不同种植年限茶树根际细菌多样
性指数相近［22］，而远低于森林土壤［27］、盐碱地沼
泽［29］、沙漠土壤结皮［30］等． 碳、氮是自然以及农
业生态系统中非常重要的营养元素，作为生态系统
的重要组成部分，土壤微生物参与土壤碳、氮元素
的循环过程和土壤矿物质的矿化过程［31］． 本研究
中土壤细菌数量与土壤碳氮含量呈显著正相关关
系，这也正是土壤细菌数量与土壤碳、氮显著相关
的原因． 土壤酶是一类比较稳定的蛋白质，是土壤
中最活跃的部分，土壤酶和土壤微生物一起共同推
动土壤的代谢过程［16］． 土壤中过氧化氢酶活性比
较稳定，并且与土壤有机碳含量显著正相关，土壤
脲酶活性与土壤全氮含量显著正相关，蔗糖酶活反
映土壤的肥力状况［32］，这也是本研究中可培养细
菌数量与土壤酶活含量呈显著正相关的原因． 土壤
pH值已经被证实与整个土壤细菌群落数量与多样
性密切相关［25］，本研究中，土壤 pH 值与土壤可培
养细菌数量与多样性均呈显著负相关关系，与他人
报道相一致［24 － 25，31 － 32］．
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822 冰 川 冻 土 36 卷
Characteristics of cultivable bacterial community in rhizosphere soil of
Achnatherum splendens Trin in the upper reaches
of the Shule Ｒiver，Qilian Mountains
YANG Xiuli1， ZHANG Baogui2， ZHANG Wei2， LIU Guangxiu2， CHEN Tuo2， XUE Lingui1
(1． School of Chemical and Biological Engineering，Lanzhou Jiaotong University，Lanzhou 730070，China; 2． Key Laboratory
of Desert and Desertification，Cold and Arid Ｒegions Environmental and Engineering Ｒesearch Institute，
Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China)
Abstract:In this study，the bacterial distribution and diversity in rhizosphere soil of Achnatherum splendens Trin
changing with altitude in the upper reaches of Shule Ｒiver were studied． The study results show that the number
of cultivable bacteria varied between 1． 7 × 107 － 10． 8 × 107 CFU·g －1，with an average of 6． 4 × 107 CFU·
g －1;there was a tendency that the number of cultivable bacteria decreased first and then increased;there was a
significantly positive correlation between the number of cultivable bacteria and soil total nitrogen，urease and su-
crose;the relationship between the number of cultivable bacteria and organic carbon and phosphatase was positive
too;pH was a negative factor，which influences the number of cultivable bacteria and the diversity of bacteria．
Based on 16S rDNA gene sequences and the phylogenetic tree，the cultivable bacteria in the study area include 15
genera，of which Pseudomonas and Bacillus genus are the dominate bacteria．
Key words:upper reaches of the Shule Ｒiver;Achnatherum splendens Trin;rhizosphere bacteria;soil physic-
chemical properties;phylogenetic tree
9221 期 杨秀丽等:祁连山疏勒河上游芨芨草根际可培养细菌群落特征研究