全 文 ：收稿日期:2008-01-20
基金项目:广西自然科学基金资助项目(桂科自 0448045)
作者简介:曾艳华(1979-), 女 , 湖南蓝山人 , 硕士研究生 , 主要研究方向:植物分子细胞遗传学。 ＊为通讯作者 , E-mail:
hanyh329@163.com
薏苡不同种质的基因组原位杂交分析
曾艳华1 , 　谢　莉1 , 　陈志坚1 , 　熊　军1 , 　韩永华1 , 2＊
(1.广西师范大学生命科学学院 , 　桂林　541004;　2.中国农业大学国家玉米改良中心 , 北京　100094)
摘要:为了研究薏苡属不同种质之间的关系 ,采用基因组原位杂交(GISH)技术 , 以四倍体栽培薏苡(2n=20 ,
AABB)基因组总 DNA作为探针 , 分别对广西的栽培薏苡 、野生薏苡和水生薏苡体细胞中期染色体进行基因组原位
杂交 。杂交结果显示 ,栽培薏苡和野生薏苡染色体都被强烈而密集的杂交信号所标记 ,说明野生薏苡与栽培薏苡在
基因组染色体水平上的同源程度很高 ,保守重复序列占很大比重;水生薏苡的基因组中有 20 条染色体的 DNA成分
与栽培薏苡的基因组 DNA 高度同源 , 推断供试的水生薏苡种属于广西六倍体水生薏苡居群。
关键词:薏苡;基因组原位杂交;同源性
中图分类号:S519.024　 文献标识码:A　　　　　文章编号:1002-8161(2008)02-0119-04
Analysis of different Jobstears Coix species with genomic in situ hybridization
ZENG Yan-hua1 , XIE Li1 , CHEN Zhi-jian1 , XIONG Jun1 , HAN Yong-hua1 , 2＊
(1.College of Life Science , Guangxi Normal University , Guilin 541004 , China;
2.National Center of Maize Improvement , China Agricultural University , Beijing 100094 , China)
Abstract:Genomic in situ hybridization(GISH)method was used to study the relationship of different Jobstears Coi x
species , and the cell metaphase chromosomes of Coix Lacryma-jobi L , Coix Agrestis Lour and Coix Aquatica Roxb were
hybridized with labelled probes genome from Coix Lacryma-jobi L.(AABB genomes).The G ISH results indicated that the
chromosomes of Coix Lacryma-jobi L and Coix Agrestis Lour was labelled with strong and intensive hybridization signals ,
w hich showed that the homolo gy between Coix Lacryma-jobi L and Coix Agrestis Lour genomes w as very close at genomic
chromosomes level , and the conser vative repeated sequences accounted fo r a large proportion.Moreover , the DNA compo-
nents of 20 chromosomes from Coix Aquatica Roxb genome was highly homologic with the genome DNA of Coi x
Lacryma-jobi L.It is concluded that testing Coix aquatica Roxb belong s to hexaploid Coix aquatica Roxb population in
Guangxi.
Key words:Jobtears Coi x ;GISH;homology
　　 基因组原位杂交技术(Genomic in situ hy-
bridization , G ISH)是 20世纪 80年代末发展起来的
一种原位杂交技术 ,是荧光原位杂交技术的一个重
要分支 ,其基本原理是将一个物种的基因组总 DNA
标记为探针 ,对另一物种的染色体进行原位杂交 ,探
测两个物种间的亲缘关系[ 1] 。目前 ,这一技术已广
泛应用于不同物种之间亲缘关系的比较 、检测外源
渗入染色体片段及对物种起源与进化的研究等[ 2 ～ 8]
领域。常规的用于鉴别异源多倍体或杂种植物的
GISH 分析是基于某一祖先种或亲本物种特有的重
复序列与目标基因组的特异杂交[ 9～ 10] 。这种 GISH
是把不同的亲本物种之间保守的重复序列用没有标
记的亲本物种的基因组 DNA进行封阻 。在不进行
封阻的情况下 ,用一个物种的基因组 DNA与近缘种
的染色体进行杂交 ,可以获得它们基因组间 DNA相
似性的信息 ,并且可同时提示保守序列在染色体上
的物理位置[ 11] 。就其程序来说 ,这种 GISH 分析是
在染色体上检测两个物种间共享的重复 DNA序列 ,
适合分析物种间重复 DNA 的同源性以及同源和重
复序列在染色体上的分布特征[ 12] 。这种分析方法
已被应用于比较不同植物基因组间的关系 ,探讨基
因组的进化[ 13 ～ 17] 。薏苡属植物主要分布于东南亚
地区 。由于薏苡属内各物种之间在形态上非常相
似 ,给种的划分造成一定的困难 ,因而薏苡属植物被
不同的人划分为 4 ～ 7 个种不等[ 18] 。薏苡种
C.lacryma-jobi L (2n=20)也称薏米 、药玉米 ,是薏
·119·广西农业科学　2008年第 39卷第 2期
苡属中唯一的栽培种 ,在我国各地均有栽培;其营养
价值极高 ,具有多种保健功效 ,是世界范围内倍受青
睐的保健作物之一 ,也是一种古老的粮饲兼用的作
物资源。广泛分布于我国广西西南部地区的水生薏
苡种是近年才被发现和识别的[ 19] 。虽有报道表明
水生薏苡有 2n=10的二倍体 、2n=20 的四倍体和
2n=40的八倍体 3种类型 ,而且都是可育的[ 20 ～ 22] ,
但我国研究人员发现的水生薏苡种是雄性不育的多
年生类型 ,不能正常结实 ,只能进行无性繁殖 。
因此 ,我们通过利用四倍体栽培薏苡(2n=20)
的总基因组 DNA为探针 ,利用 GISH 技术研究栽培
薏苡与栽培水生 、野生薏苡种质基因组 DNA之间的
同源程度 ,探讨不同薏苡种质的基因组中保守序列
在染色体上的分布特点 ,由此比较它们之间亲缘关
系的远近 ,以期为研究薏苡的起源 、进化和分类提供
分子细胞遗传学依据 。
1　材料与方法
1.1　供试材料
栽培薏苡(Coix Lacryma-jobi L .)和野生薏苡
(Coix agrest is Lour)由广西畜牧研究所李冬郁提供
种子 , 播种于花盆培养;两个水生薏苡(Coix
aquatica Roxb)种质植株由广西农科院水稻研究所
陈成斌提供。
1.2　染色体制片
有丝分裂中期染色体制片参照韩永华等[ 18] 的
方法并略作修改 。取生长旺盛的根尖 ,在水饱和的
α-溴萘溶液中于 25℃处理 2.5 h ,切取 1mm 左右根
尖于 0.075mol/ L溶液中前低渗处理 30min后 ,用甲
醇∶冰醋酸(3∶1)混合液固定;用双蒸水充分清洗根
尖 ,于 2%的果胶酶及纤维素酶 1∶1混合液 28℃下
酶解 3 ～ 4 h ,双蒸水洗净后低渗 30 min火焰干燥制
片 , -20℃贮存备用 。
1.3　基因组总 DNA探针的制备及标记
采用 CTAB法[ 18] 提取栽培薏苡幼苗的基因组
DNA ,根据华美生物工程公司缺刻平移反应试剂盒
产品说明 ,依次加入下列试剂于 0.2 mL Eppendorf
管中:5 μl dNTP (dA TP 、dG TP 和 dCTP 等量混
合),10×Buf fer 5 μl , 所需标记探针 DNA 5 μl(约
1μg), 4 μl Biotin-11-dUTP (0.45 μg/μl)或 0.6 μl
地高辛(Digoxigenin-11-dUTP),适当增加了 DNaseI
的比例并延长标记时间至 4h , 0.5 mol/L EDTA 终
止液终止 。点印迹检测标记效果。
1.4　原位杂交及信号检测
原位杂交参照韩永华[ 18]方法并略作修改 ,杂交
时间为 17 ～ 20 h。荧光信号检测参照 Jut ta 等
(2001)的程序并略作修改:杂交后的片子依次在
42℃下于 50%甲酰胺 、2×SSC 溶液中各漂洗 15
min , 0.1% TritonX-100 室温下处理 5 min , PBS 室
温下处理 5 min;之后加入链亲和素-Cy3 或抗地高
辛-FITC (anti-dig oxigenin-FITC), 37℃于保湿皿中
温育 30 min后 ,室温下用 PBS 溶液洗 3×5 min;每
张制片加 40 μl(10 μg/mL)含 20%抗瘁灭剂 Vec-
tashield 的 DAPI (4 6-diamidino-2-pheny lindole)复
染 。制片在 Olympus BX50 荧光显微镜下观察 、拍
照 ,采用 photoshop 7.0处理图片。
2　结果与分析
2.1　栽培薏苡 DNA 与自身染色体的GISH 分析
用地高辛标记的栽培薏苡基因组 DNA 对自身
有丝分裂中期染色体杂交时 ,所有染色体几乎通体
都被强烈而密集的绿色杂交信号所涂染 ,仅有少数
染色体有未被杂交的区域(图 1中 A:细箭头所示)。
染色体着丝粒区 、近着丝粒区和端粒区的杂交信号
明显地强些 ,根据随体和次缢痕等染色体形态特征
判断 ,NOR区则显示了减弱的杂交信号或几乎无杂
交信号(图 1中A:粗箭头所示),显示出染色体杂交
的不均匀标记。该结果表明 ,栽培薏苡种中重复序
列占很大比重 。
2.2　栽培薏苡与野生薏苡的GISH 分析
用地高辛标记的栽培薏苡基因组 DNA 对野生
薏苡有丝分裂中期的染色体杂交时 ,结果与栽培薏
苡基因组 DNA 对自身染色体进行杂交的结果相似
(图 1 中 B)。所有染色体几乎都被强的绿色信号所
标记 ,同样在近着丝粒区等异染色质区域杂交信号一
般较强 。较弱的部位一般是一些近末端常染色质区
域(图 1中 B:细箭头所示)以及 NOR区(图 1中 B:粗
箭头所示),表明供试的野生薏苡种基因组 DNA与 2n
=20的四倍体栽培薏苡基因组DNA有比较高的同源
性。
2.3　栽培薏苡与水生薏苡的GISH 分析
用生物素标记的栽培薏苡基因组 DNA 对水生
薏苡染色体杂交结果见图 1的 C 、D。从图中可发现
两个水生薏苡种质的 30条中期染色体中分别有 20
条被较强的红色信号所涂布 ,并且较强信号主要集
中在中央着丝粒部位及近着丝粒区 ,说明这 20条染
色体的 DNA成分与四倍体栽培薏苡的基因组 DNA
是高度同源的;其余 10条虽也有少量散在信号点分
布 ,但信号强度要相对弱得多(图 1 的 C 、D中箭头
所示),说明这 10条染色体的 DNA成分与栽培薏苡
的基因组 DNA的同源程度很低 。
·120· 广西农业科学　2008年第 39卷第 2期
3　结论与讨论
一般认为 ,通常的 GISH 实验是基于物种间有
差异的分散重复序列与靶染色体的杂交[ 9] 。在本研
究中 ,标记的栽培薏苡基因组 DNA与供试薏苡种质
的基因组 DNA是在不封阻的条件下直接进行杂交 ,
这种杂交是基于栽培薏苡与供试的薏苡种质基因组
之间 DNA 序列的保守性 ,GISH 信号主要来源于保
守的重复序列 ,信号区域是重复序列高度集中的区
域。信号较弱的染色体可能是在进化过程中较为活
跃 、易发生插入 、缺失 、重复等遗传事件 ,在长期进化
过程中 ,这些染色体的遗传成分在种之间产生了较
大的差异 。而同源信号强的主要集中于染色体中部
和端部 ,这可能是最原始 、最基础的染色体组的成
分 ,也是较保守的重复序列部分 ,其存在可能对维持
染色体正常形态具有重要功能[ 7] 。
本试验采用 2n=20的四倍体栽培薏苡标记的
总DNA对栽培薏苡 、野生薏苡及水生薏苡体细胞中
期染色体进行原位杂交 ,从栽培薏苡对自身的 GISH
结果来看 ,其所有染色体几乎都被强烈地标记 ,这与
薏苡基因组含有高比例的高度和中度重复 DNA 序
列的事实相符[ 18] ;同时也显示出染色体杂交信号的
不均匀分布 , 如异染色质区的优势杂交 , 与佘朝
文[ 12]的论点相一致 ,即基因组 DNA 对自身染色体
的不均匀杂交在植物中是普遍存在的。NOR区显
示减弱的信号标记 ,与玉米的自身基因组荧光原位
杂交结果类似[ 12] 。众所周知 , rDNA 重复单位编码
区在所有植物中都是非常保守的 ,这种反常情况的
出现 ,缘于大基因组植物的自身 GISH 中重复序列
的自我封阻 ,这种自我封阻阻止了某些小部分的重
复 DNA 在给定实验条件下与它对应的染色区段的
杂交[ 23] 。
本研究中 ,栽培薏苡与野生薏苡的 GISH 结果
与栽培薏苡自身的 GISH 结果没有很明显的差异 ,
说明野生薏苡与栽培薏苡在基因组染色体水平上的
同源程度很高;染色体中着丝粒部位和近着丝粒区
及端粒区都集中有特别强的杂交信号 ,说明薏苡不
同种质的基因组之间共享的保守重复序列主要分布
·121·曾艳华等:薏苡不同种质的基因组原位杂交分析
在这几个区域。此外 ,水生薏苡的基因组中有 20 条
染色体的 DNA 成分与栽培薏苡的基因组 DNA高度
同源 ,因此供试的两个水生薏苡种质可能与韩永华
等研究的六倍体水生薏苡同属广西水生薏苡种的一
个居群 ,但这两个水生薏苡种质是否属于同一个种
则有待于今后进一步研究 。
栽培薏苡与水生薏苡的 GISH 结果与韩永
华[ 24]等的报道相一致 ,即水生薏苡的基因组中有 20
条染色体的DNA成分与栽培薏苡的基因组 DNA 高
度同源 ,可以推断 ,供试的两个水生薏苡种质与韩永
华等研究的六倍体水生薏苡同属广西水生薏苡种的
一个居群 。
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(责任编辑　韦莉萍)
·122· 广西农业科学　2008年第 39卷第 2期