全 文 ：中国油料作物学报
Chinese Journal of Oil Crop Sciences
2016，38(3) :281 － 286
doi:10． 7505 / j． issn． 1007 － 9084． 2016． 03． 002
甘蓝型油菜—菘蓝二体附加系的创制和细胞学分析
杨 汉，康 雷，李鹏飞，葛贤宏，李再云*
(作物遗传改良国家重点实验室，华中农业大学植物科学技术学院，湖北 武汉，430070)
摘要:为创制稳定遗传的甘蓝型油菜—菘蓝二体附加系，以花粉育性很低、在甘蓝型油菜品种华双 3 号(2n =
38，AACC)上附加一条菘蓝(2n = 14，II)特定染色体(g)的单体附加系(2n = 39，AACC + 1Ig)为父本，与正常的华双
3 号杂交，产生正常油菜胞质的单体附加系、经自交获得二体附加系(2n = 40，AACC + 1IIg)。该二体附加系的细胞
学及基因组原位杂交观察表明，花粉母细胞减数分裂中染色体配对与分离基本正常，在终变期形成 20 个二价体，
后期 I进行 20∶ 20 的均等分离;第二次分裂中形成正常的四分体及四个子细胞，花粉的育性较高，自交结实好，产
生的后代均携带菘蓝染色体。但也在少部分的花粉母细胞内出现菘蓝或油菜的落后染色体。该细胞学行为较稳
定、育性较高的甘蓝型油菜—菘蓝二体附加系为菘蓝遗传研究及油菜育种研究提供了新材料。
关键词:甘蓝型油菜;菘蓝;附加系;减数分裂;基因组原位杂交
中图分类号:S565． 4 文献标识码:A 文章编号:1007 － 9084(2016)03 － 0281 － 06
Development and cytology of disomic alien addition between Brassica napus and Isatis indigotiga
YANG Han，KANG Lei，LI Peng － fei，GE Xian － hong，LI Zai － yun*
(National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement，College of Plant Science and Technology，
Huazhong Agricultural University，Wuhan 430070，China)
Abstract:To develop cytologically stable disomic alien additions between Brassica napus (Huashuang 3) (2n
= 38，AACC)and Isatis indigotiga (2n = 14，II) ，the cultivar Huashuang 3 was pollinated by one such monoso-
mic addition carrying one specific chromosome of I． indigotiga but with very low pollen fertility caused by male ster-
ile cytoplasm． The disomic addition (2n = 40，AACC + 1IIg)with normal cytoplasm of B． napus was obtained by
crossing Huashuang 3 with this alien chromosome． The cytological and genomic in situ hybridization (GISH)analy-
ses for this addition showed the main normal chromosome pairing (20 bivalents)and segregation (20∶ 20)during
meiotic divisions of pollen mother cells，resulting in the high pollen fertility，seed － set and the progenies with alien
chromosomes． But lagging chromosomes also occurred at low frequency during meiosis． This relatively stable di-
somic addition provided novel material for genetic study of this medicinal plant as well as for Brassica breeding．
Key words:Brassica napus;Isatis indigotiga;Alien addition;Meiosis;Genomic in situ hybridization (GISH)
收稿日期:2015-12-31
基金项目:国家自然科学基金(31571703)
作者简介:杨 汉(1991 －) ，女，硕士研究生，从事油菜细胞遗传学研究，E － mail:928775703@ qq． com
* 通讯作者:李再云(1962 －) ，男，教授，主要从事油菜远缘杂交及细胞遗传学研究，E － mail:lizaiyun@ mail． hazu． edu． cn
远缘杂交是作物遗传改良的重要途径，广泛地
用于将近缘种的有利性状和基因引入作物，或创建
供遗传分析的材料(如异源染色体附加系、代换系
和易位系)［1 ～ 4］。特别是通过培育异源染色体的单
体和二体附加系，可将一个物种染色体组中的每一
条染色体分割开来，用于研究其染色体组的结构和
进化、鉴别基因连锁群、定位特定性状到特定染色体
上、在近缘物种间比较基因同线性等［5］。附加系在
芸薹属染色体组的结构和性状转移方面取得较大进
展［6］，但培育出属间全套附加系的报道不多［7］。
菘蓝(Isatis indigotica Fort．，2n = 14，II)为十字
花科(现称芸薹科，Brassicaceae)菘蓝族(Isatideae)
菘蓝属植物，其根称板蓝根，其叶称大青叶，具有清
热解毒、凉血消肿的功效，且菘蓝含有杀虫、抗病的
功效，是油菜遗传改良的重要资源［8，9］。虽然板蓝
根是我国常用的大宗药材，但对其遗传研究的报道
较少。现未见有关菘蓝基因组大小的报道。同属的
欧洲菘蓝(Isatis tinctoria L．，2n = 28)为四倍体，其
1C DNA为 0． 58pg［10］，与栽培芸薹属二倍体种(约
600Mb)的相当;故我国菘蓝的基因组较小(估计约
300Mb) ，其染色体的体积比芸薹属的还小，这一特
征在油菜与菘蓝的体细胞杂种及附加系中得到明显
的体现［11，12］。本实验室通过原生质体融合获得甘
蓝型油菜(Brassica napus L．，2n = 38)与菘蓝的体细
胞杂种(2n = 52，AACCII)［11］，与甘蓝型油菜连续回
交，结合形态、细胞学和 SSＲ 标记鉴定出全套的、附
加 7 条不同菘蓝染色体的单体附加系(monosomic
alien addition lines，MAAL，编号为 Ma，Mb，Mc，
……，Mg)［12］。所用的 100 多个 SSＲ 标记为中国中
医科学院黄璐琦实验室根据菘蓝基因组 DNA 序列
开发。其中附加系 Me 表现菘蓝的褐色花药特性，
Mf和 Mg 附加的染色体分别携带 5S rDNA 和 45S
rDNA位点，其余 4 个 MAAL 利用 SSＲ 标记区分。
特别的是，附加菘蓝 d 染色体的二体附加系叶提取
物具有一定的抗流感病毒活性，表明这条菘蓝染色
体上携带有控制合成特定抗病毒活性成分的主要基
因;此材料已申请北京市非审定农作物品种鉴定，命
名为蓝菜 1 号(京品鉴菜 2014032)。但由于双亲的
线粒体重组而使附加系的花药发育异常，除附加系
Me的花药发育正常外，其余六个均因雄蕊心皮化发
育与异常而表现雄性不育，给它们的繁育及研究带
来困难。
为了消除不育胞质对附加系繁殖与保存的限制
与影响、创制遗传相对稳定的甘蓝型油菜—菘蓝二
体附加系，本研究以在低温条件下可产生少量花粉、
在甘蓝型油菜品种华双 3 号上附加一条菘蓝特定染
色体(g)的单体附加系(2n = 39，AACC + 1Ig)为父
本与正常的华双 3 号杂交，产生正常油菜胞质的单
体附加系后自交获得二体附加系(2n = 40，AACC +
1IIg)。对该二体附加系进行了普通细胞学及基因
组原位杂交研究，显示其花粉母细胞减数分裂中染
色体配对与分离基本正常，花粉育性较高、自交结实
好，为菘蓝的基因组结构研究及油菜育种提供新
材料。
1 材料与方法
1． 1 材料
以甘蓝型油菜(Brassica napus，2n = 38，AACC)
品种华双 3 号与菘蓝(Isatis indigotica Fort．，2n =
14，II)的 g单体附加系［13］为父本，华双 3 号为母本，
在杂交产生的后代中鉴定出附加菘蓝染色体 g 的单
体附加系，将其自交后在后代中鉴定出 g 二体附加
系，并观察形态及结实率。
1． 2 分子标记
用 CTAB法提取材料基因组 DNA。
用菘蓝着丝粒引物 CEN1Ｒ(5 － 3:AGAG-
CACTTTAATGTGTACCT)、CEN1F(5 － 3:CATGCT-
TCGCGTTCTATCTTT)进行扩增，扩增程序为:94℃
5min，35 个循环(94℃ 30s，54℃ 30s，72℃ 45s) ，
72℃延伸 10min。
用菘蓝 g染色体特异引物进行 SSＲ 检测，扩增
程序为:94℃ 5min;94℃ 30s，60℃ 30s，72℃ 45s，10
个循环(每个循环退火温度降 0． 7℃) ;94℃ 30s，
55℃ 30s，72℃ 45s，30 个循环;最后 72℃ 延伸
10min。
1． 3 细胞学及花粉育性观察
开花初期，取花蕾用卡诺固定液(乙醇∶ 冰醋酸
= 3∶ 1)固定，并更换新鲜固定液几次，直至花蕾颜
色泛白，然后 4℃保存。镜检时取合适大小的花蕾，
剥取其中一个花药，在 1mol /L 的 HCl 中 60℃解离
2min，用蒸溜水洗去盐酸后制片，再用改良的卡宝品
红染色压片，显微镜检查花粉母细胞减数分裂时期;
对确定为终变期和后期 I 的花蕾保存，用于原位杂
交分析。
在晴天取当天开放的花，将花药置于玻片上，于
l%醋酸洋红液中挤出花粉使其染色，去掉花药后盖
片，普通光学显微镜下观察计数(统计 300 ～ 500 个
花粉粒) ，大而圆的为可育花粉，小而瘪的为不育花
粉，并计算花粉的可染率(%) ，即可育花粉数占观
察总花粉个数的百分比。
1． 4 原位杂交
基因组原位杂交程序按已有的方法进行［14，15］。
用切口平移法标记菘蓝的基因组 DNA探针，反
应体系为:10 × buffer 5μL、dNTP 5μL、DNaseⅠ
(0． 005U)2μL、DNA polyI 1． 2μL、Bio － 11 － dUTP
1． 2μL、DNA(100ng /μL)5μL、ddH2O 30． 6μL。
制备好的染色体制片在烘箱中过夜，5ng·
μL －1的胃蛋白酶处理(37℃，20min) ，100ng·μL －1
的 ＲNase 酶解(37℃，1h) ，4%多聚甲醛处理 10min，
各个制片在 2 × SSC中摇洗 3 次，每次 5min，然后进
行梯度脱水(75%乙醇 3min、100%乙醇 3min) ，干燥
1h以上。配好的杂交液(每片 50μL:50%去离子甲
酰胺 25μL、20 × SSC 5μL、鲑鱼精 DNA 0． 5μL、10 ×
SDS 2． 5μL、50% 硫酸葡聚糖 10μL、菘蓝基因组
DNA探针 3μL、油菜封阻 DNA 4μL) ，85℃变性 10
min，冰上冷却 5min。盖膜，原位 PCＲ 仪 74℃共变
282 中国油料作物学报 2016，38(3)
性 7min，37℃湿盒温育过夜。20% 甲酰胺(42℃，
10min)，2 × SSC(42℃，2 × 5min) ，2 × SSC(室温，
5min)，每片加 5% BSA 100μL /片，盖膜室温放置
5min。避光:5% BSA稀释 Cy3 100 倍，50μL /片，盖
膜，37℃温育 1h，1 × PBS 中摇 5min，每片滴加 4μg
·mL －1DAPI 100μL，盖膜，室温 30min，1 × PBS中揭
膜，每片加抗荧光猝灭剂一滴，用干净的盖片盖好，
4℃避光保存，荧光显微镜下观察。
2 结果与分析
2． 1 甘蓝型油菜 －菘蓝二体附加系的培育
以前的研究表明，甘蓝型油菜—菘蓝单体附加
系(除 Me外)的花药发育异常，四强雄蕊发生心皮
化，两个短雄蕊只有花丝没有花药，其原因为在体细
胞融合中发生了双亲的线粒体重组;但部分附加系
在开花早期有微粉，可产生少量可育花粉［6］。故可
用附加系的花粉给正常甘蓝型油菜授粉，将附加的
菘蓝染色体转移到具有正常细胞质的甘蓝型油菜
上，创制育性提高的二体附加系。用 g 附加系的花
粉给华双 3 号授粉后，在后代中经 GISH 分析证实
鉴定出 2n = 38、39 的后代，其中，2n = 39 的植株为
单体附加系，包含有一条菘蓝染色体(图 1)。它们
在植株形态上与华双 3 号非常相似，因 g 单体附加
系也与华双 3 号没有明显的形态差异，这两类后代
植株的花发育正常、花粉育性高，2n = 38 的为
94． 46%，2n = 39 的为 65． 25%。这也证明单体附加
系的异常花药由细胞质基因引起。将 2n = 39 的植
株进行自交，在后代中鉴定出 2n = 40 的二体附加
系，其结实率表现较好。
注:DAPI染色。绿色为杂交探针信号。A:终变期染色体;B:终变期杂交信号图。箭头所指为菘蓝染色体。标尺 10μm
Note:DAPI staining images at diakinesis stage． A:Chromosome;B:Hybridization
(green color shows probe signal)． Arrows indicate I． indigotiga chromosome． Bar:10μm
图 1 甘蓝型油菜 －菘蓝单体附加系花粉母细胞减数分裂的 GISH分析
Fig． 1 GISH of meiotic pairing and segregation in PMCs of monosomic addition
2． 2 甘蓝型油菜 －菘蓝二体附加系的细胞学观察
为鉴定出二体附加系，以菘蓝的基因组 DNA为
探针，经生物素标记后并以甘蓝型油菜华双 3 号的
基因组 DNA为封阻，对从上面自交后代植株中挑选
出的终变期、中期Ⅰ和后期Ⅰ花粉母细胞(PMCs)进
行基因组荧光原位杂交(GISH)分析。在目标植株
三个时期的 PMC细胞中均有两个明显的杂交信号，
标记的两条菘蓝染色体在终变期及中期Ⅰ形成一个
二价体(图 2A，B)，在后期Ⅰ被分配至细胞两极，染
色体表现均等的 20∶ 20 分离(图 2C，D);与油菜的
染色体相比，菘蓝的染色体具有较小的体积。表明
附加的两条菘蓝染色体与其他油菜染色体一样进行
正常的配对与分离，为其较稳定的传递提供了细胞
学基础。
对二体附加系植株的花粉母细胞减数分裂过程
进行了观察(图 3)。在终变期，染色体主要配对成
20 个二价体(图 3A)，也出现少量的三价体或四价
体。在中期Ⅰ时，多数细胞(76%)中二价体整齐排
列于赤道板上(图 3B)，少数细胞(24%)有 1 ～ 2 条
染色体游离在赤道板外，也有可能是附加的二价体
提前分离(图 3C)。后期Ⅰ以 20∶ 20 的均等分离为
主(图 3D)，少量 19∶ 21 的分离。后期Ⅰ及末期 I时
少数细胞(4%)中出现一条落后染色体(图 3E，F)。
第二次减数分裂时(图 3G)，多数细胞正常分裂，产
生 4 个子细胞及四分体。少数中期 II 细胞(5%)有
1 条染色体游离在赤道板外(图 3H)，未发现有 2 条
游离的情况，后期 II及末期 II没有落后染色体出现
(图 3I)。故二体附加系的减数分裂过程基本正常。
382杨 汉等:甘蓝型油菜—菘蓝二体附加系的创制和细胞学分析
注:DAPI染色。红色为杂交探针信号。A:终变期染色体;B:终变期杂交信号图;
C:后期Ⅰ染色体。D:后期Ⅰ杂交信号图。箭头所指为菘蓝染色体。标尺 10μm
Note:The blue color is from DAPI staining，and the red is from hybridization signal． A:Chromosomes at diakinesis stage;
B:Hybridization (red color shows probe signal)signal at diakinesis stage;C:Chromosomes at anaphase I stage;
D:Hybridization (red color shows probe signal)signal at anaphase I stage． Arrows indicate I． indigotiga chromosome． Bar:10μm
图 2 甘蓝型油菜 －菘蓝二体附加系花粉母细胞减数分裂的 GISH分析
Fig． 2 GISH of meiotic pairing and segregation in PMCs of disomic addition
2． 3 甘蓝型油菜 －菘蓝二体附加系中菘蓝染色体
的传递率
提取 34 株二体自交后代的叶片 DNA，进行菘
蓝着丝粒特异引物的扩增，检测结果表明所有植株
均有菘蓝着丝粒片段。为了进一步验证该菘蓝染色
体的存在，进行 g染色体特异 SSＲ引物 164 的扩增，
也显示均有菘蓝特异片段(图 4)。可见所有该二体
附加系的自交后代均有菘蓝染色体。
3 讨论
由于甘蓝型油菜与菘蓝在分类上属于芸薹科的
两个族(tribe)，有性杂交未能获得预期杂种［16］，后
来通过体细胞融合产生了预期的异源六倍体(AAC-
CII)［11］，经过多年的回交与选择才建立了全套的附
加系［12，13］，是研究菘蓝的基因组结构及解析药用成
分、向油菜转移目标性状及基因的重要材料。在回
交过程中以正常的甘蓝型油菜为父本，故所有回交
后代(附加系及甘蓝型油菜类型后代)均保留了体
细胞融合产生的异源六倍体的细胞质。叶绿体
DNA分析显示，异源六倍体及附加系的叶绿体组成
与甘蓝型油菜的相同［11，12］;而双亲的线粒体 DNA
发生了多次重组，且以菘蓝的成分为主(康雷等，未
发表)。也许正是由于线粒体重组，导致六个(除附
加系 Me外)及甘蓝型油菜类型后代的雄蕊心皮化
发育，造成附加系繁殖与保存的困难。本研究结果
表明，将附加系的细胞质转换成正常甘蓝型油菜后，
花器官发育正常，花粉育性得到很大提高，自交结实
率也较高，为其遗传研究及育种应用提供了很大的
便利。
482 中国油料作物学报 2016，38(3)
注:A:终变期;B，C:中期 I;D:后期 I;E，F:末期 I;G，H:中期 II;I:后期 II。标尺:10μm
Note:A:diakinesis;B，C:Meiosis metaphase I;D:Anaphase I;E，F:Telophase I;G，H:Meiosis metaphase Ⅱ;I:Anaphase Ⅱ;Bar:10μm
图 3 甘蓝型油菜 －菘蓝二体附加系的减数分裂观察
Fig． 3 Meiotic divisions of PMCs of disomic addition
注:H3:甘蓝型油菜华双 3 号;II:菘蓝;1 ～ 34:二体自交后代
Note:H3:II:I． indigotica;1 － 34:Selfing progeny of disomic alien addition line
图 4 二体附加系后代的菘蓝染色体特异 SSＲ分析
Fig． 4 SSＲ amplification specific for one chromosome of I． indigotica
单体附加系 g中附加的这条菘蓝染色体多以单
价体的形式存在，但也可与甘蓝型油菜染色体发生
部分同源配对，并且甘蓝型油菜染色体的配对受到
影响，多价体频率增加［13］;在后期 I 菘蓝染色体进
入一个子细胞，而油菜染色体多以均等的 19∶ 19 分
离、少数以非均等的 18 ∶ 20 分离;故这条外源染色
体在一定程度上干扰了油菜染色体的正常减数分
裂。而本研究中获得的具有甘蓝型油菜正常细胞质
的二体附加系中，附加的两条菘蓝染色体与油菜染
色体一起，在花粉母细胞减数分裂过程中主要表现
正常的配对与分离(图 2，3)，为其较高的花粉育性
及结实率提供了细胞学基础;但同时也发生较低频
率的落后染色体，特别是油菜与菘蓝的染色体均有
异常;今后可增加自交代数以进一步稳定附加系的
细胞学行为及提高育性。开发的菘蓝着丝粒特异引
物，可用于快速的检测附加系后代中菘蓝染色体的
存在，但菘蓝染色体的拷贝数有赖于直观的 FISH
技术。
582杨 汉等:甘蓝型油菜—菘蓝二体附加系的创制和细胞学分析
参考文献:
［1］ 戴华军，朱正斌，沈雪林，等． 作物远缘杂交育种的途
径及其实质［J］． 基因组学与应用生物学，2010，29
(1) :144 － 149．
［2］ 刘 炜，申书兴，王彦华，等． 大白菜 －甘蓝异附加系
的获得与鉴定［J］．园艺学报，2008，35(2) :207 － 212．
［3］ 吕文欣，王彦华，赵建军，等． 大白菜 －结球甘蓝 1 号
染色体二体异附加系的获得与鉴定［J］． 园艺学报，
2011，38(7) :1 275 － 1 282．
［4］ 葛荣朝，张敬原，赵宝存，等． 一个耐盐小麦 －多枝赖
草二体异附加系外源染色体的鉴定［J］． 中国农业科
学，2006，39(1) :193 － 198．
［5］ Chang S B，de Jong H． Production of alien chromosome
additions and their utility in plant genetics［J］． Cytogenet
Genome Ｒes，2005，109:335 － 343．
［6］ Prakash S，Bhat S Ｒ，Quiros C F，et al． Brassica and its
close allies:cytogenetics and evolution［J］． Plant Breed
Ｒev，2009，31:21 － 187．
［7］ Budahn H，Schrader O，Peterka H． Development of a
complete set of disomic rape － radish chromosome － addi-
tion lines［J］． Euphytica，2008，162:117 － 128．
［8］ 李楚源，曾令杰．板蓝根研究进展［J］．现代中药研究
与实践，2005，19(3) :51 － 55．
［9］ 李勇超，任永信，陈宏恩．栽培菘蓝居群的遗传多样性
分析［J］．湖北农业科学，2013，52(8) :1 842 － 1 847．
［10］ Al － Shehbaz I A，Beilstein M A，Kellogg E A． System-
atics and phylogeny of the Brassicaceae (Cruciferae) :an
overview［J］． Plant Systematics Evoutionl，2006，259:89
－ 120．
［11］ Du X Z，Ge X H，Yao X C，et al． Production and cyto-
genetic characterization of intertribal somatic hybrids be-
tween Brassica napus and Isatis indigotica［J］． Plant Cell
Ｒep，2009，28:1 105 － 1 103．
［12］ Kang L，Du X Z，Zhou Y Y，et al． Development of a
complete set of monosomic alien addition lines between
Brassica napus and Isatis indigotica (Chinese woad)
［J］． Plant Cell Ｒep，2014，33:1 355 － 1 364．
［13］ 康 雷．全套甘蓝型油菜 －菘蓝单体附加系及新型
CMS的创建［D］．武汉:华中农业大学，2014．
［14］ 葛贤宏．人工合成芸薹属异源六倍体与诸葛菜属间
杂种的细胞学及分子生物学研究［D］． 武汉:华中农
业大学，2007．
［15］ Wang Y P，Zhao X X，Sonntag K，et al． Behaviour of
Sinapis alba chromosomes in a Brassica napus back-
ground revealed by genomic in － situ hybridization［J］．
Chromosome Ｒes，2005，13:819 － 826．
［16］ Tu Y Q，Sun J，Ge X H，et al． Production and genetic
analysis of partial hybrids from intertribal sexual crosses
between Brassica napus and Isatis indigotica and proge-
nies［J］． Genome，2010，53:146 － 156．
(责任编辑:郭学兰)
682 中国油料作物学报 2016，38(3)