全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2012, 38(6): 9961002 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家自然科学基金项目(30971774), 国家高技术研究发展计划(863 计划)项目(2006AA10Z1F6)和江苏省科技支撑计划项目
(BE2009343)资助。
* 通讯作者(Corresponding author): 刘大钧, E-mail: djliu@njau.edu.cn
第一作者联系方式: E-mail: lisuoping@henu.edu.cn, Tel: 0378-3887799, 13849123449
Received(收稿日期): 2011-09-08; Accepted(接受日期): 2012-02-22; Published online(网络出版日期): 2012-03-29.
URL: http://www.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20120329.1120.011.html
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2012.00996
节节麦和黑麦杂种 F1及双二倍体中基因组变异分析
李锁平 1,2 张大乐 2 王秀娥 1 亓增军 1 刘大钧 1,*
1 作物遗传与种质创新国家重点实验室 / 南京农业大学, 江苏南京 210095; 2 河南大学棉花生物学国家重点实验室, 河南开封 475001
摘 要: 人工合成的双二倍体在遗传和植物育种中有重要作用。为探讨远缘杂交后代双二倍体育性提高及其细胞学
稳定的分子机制, 利用 ALFP、MASP 技术对节节麦-黑麦杂种及其双二倍体 S1~S4 代的基因组变异进行了分析。该双
二倍的 S1~S4 代体细胞染色体数 2n = 28 的植株的比例从 57.1%提高到 92.5%, 2n = 28 的植株的花粉母细胞减数分裂
中期二价体平均数目从 11.7 提高到 12.25, 平均结实率从 24.5%提高到 51.3%。利用两套分别扩增重复序列和单拷贝
序列的酶切引物组合 EcoR I/Mse I (E-M)、Pst I/Mse I (P-M)对节节麦-黑麦杂种 F1 和双二倍体 S1~S4 代扩增表明, 基
因组序列变异主要发生于 F1 代, 且以序列消除为主。E-M 和 P-M 引物扩增带中, 节节麦基因组在 F1 代的序列消除带
数占各代总消失带数的 70.00%和 52.95%, 而在黑麦基因组为 96.88%和 81.64%。MSAP 分析表明, 节节麦和黑麦杂
种和加倍能够导致节节麦和黑麦基因组序列甲基化状态改变, 以甲基化为主, 仅发生在 F1 和 S1 代。在 S2~S4 代中没
有检测到甲基化变异。
关键词: 双二倍体; 基因组序列变异; 节节麦; 黑麦; AFLP; MSAP
Genomic Variation in F1 Hybrid and Amphidiploid between Aegilops tauschii
and Secale cereale
LI Suo-Ping1,2, ZHANG Da-Le 2, WANG Xiu-E1, QI Zeng-Jun1, and LIU Da-Jun1,*
1 National Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement / Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2 State Key
Laboratory of Cotton Biology, Henan University, Kaifeng 475001, China
Abstract: Synthetic amphidiploids play an important role in genetic study and plant breeding. To understand the molecular
mechanism of fertility improvement and cytological stability in amphidiploid, we analyzed the fertility, genomic variation, and
cytology of the F1 hybrid and S1 to S4 amphidiploid progenies from the cross between Aegilops tauschii and Secale cereale by
means of microscopic observation and molecular markers (ALFP and MASP). The percentage of plants with chromosome number
of 2n = 28 increased from 57.1% to 92.5% in the amphidiploid progenies. The bivalent in pollen mother cells (PMCs) at meiosis I
stage increased from 11.70 to 12.25 averagely, and the mean rate of seed setting was enhanced from 24.5% to 51.3% in the am-
phidiploid progenies (2n=28). Genomic variation in the F1 hybrid and the amphidiploids was detected using AFLP markers di-
gested by EcoR I/Mse I (E-M) and Pst I/Mse I (P-M), which could primarily amplify repetitive and low-copy sequences, respec-
tively. The results showed that the genomic variation occurred mainly in the F1 hybrid with dominant form of sequence elimina-
tion. The loss percentages in F1 plants were 70.00% at E-M locus and 52.95% at P-M locus for the Ae. tauschii banding pattern
and 96.88% at E-M locus and 81.64% at P-M locus for the S. cereale banding pattern. The result of MSAP analysis showed that
the cytosine methylation alterations, mainly methylated, only occurred in the F1 hybrids and the S1 amphidiploids. In S2 to S4 am-
phidiploids, no methylation was observed.
Keywords: Amphidiploid; Genomic sequence variation; Aegilops tauschii; Secale cereale; AFLP; MSAP
多倍体化是植物新物种形成的主要途径之一 ,
也是促进植物进化的重要动力。至少 50%以上的被
子植物在进化历史上曾发生过至少 1 次多倍体化[1-2]。
近年来 , 比较基因组研究发现 , 原来传统概念上的
第 6 期 李锁平等: 节节麦和黑麦杂种 F1及双二倍体中基因组变异分析 997


二倍体物种如水稻 [3]、玉米 [4]、大豆 [5]、拟南芥 [6-7]
等植物在进化过程中曾发生过多倍体化和加倍后广
泛的染色体断裂、融合和重排。自 Song 等[8]以新合
成芸薹属异源多倍体为材料研究基因组进化以来 ,
利用新合成的人工多倍体研究多倍体基因组进化已
用于多种植物, 发现有些多倍体, 如芸薹[8]、小麦及
其近缘属 [9]和拟南芥 [10-11], 在形成早期其基因组序
列的快速消除、序列和染色体的重排等遗传改变 ;
而棉花[12]、大米草[13]和芥菜[14]的双二倍体则真实地
继承了双亲的基因组。表明不同的物种可能存在不
同的二倍化稳定途径。
由小麦和黑麦杂交加倍而形成的小黑麦是第一
个人工合成的双二倍体作物[15]。利用小麦属物种和
黑麦杂交、加倍, 已经合成了不同倍性的初级小黑
麦如 AARR、AABBRR、AABBDDRR, 小麦和黑麦
染色体组的分化大, 这为多倍体形成后的基因组进
化研究提供了一系列遗传材料。小黑麦基因组也存
在多倍体化后的变异。Ma 等[16-17]利用六倍体小黑麦、
八倍体小黑麦为材料, 详细研究了小黑麦形成过程,
发现其基因组变异比其他小麦种间杂种有更大的遗
传改变。
AFLP (amplified fragment length polymorphism)
分析可以在整个基因组水平上调查基因组序列改
变。在 AFLP 技术的基础上建立起来的 MSAP (me-
thylation-sensitive amplified polymorphism)技术是利
用 2 个对 DNA 甲基化敏感程度不同的同裂酶(常用
的一对同裂酶为 Hpa II 和 Msp I, 这 2 个酶识别相同
的酶切位点 CCGG, 真核生物中主要的甲基化位点),
分别与一个对 DNA 甲基化不敏感的稀切酶(如 EcoR
I)一起对基因组 DNA 进行双酶切, 然后再接上相应
的限制性内切酶的接头, 利用接头序列设计引物进
行常规 AFLP 分析。由于所采用的限制性内切酶对
DNA 甲基化敏感性不同, 相同序列就可扩增出不同
的带型, 由此判断 DNA 甲基化状态, 而 DNA 甲基
化状态反映基因组重要的表观遗传修饰机制。
在前期工作中, 我们以节节麦为母本与黑麦杂
交 , 并通过胚培养获得了节节麦和黑麦间的杂种 ,
然后经秋水仙素加倍合成了节节麦-黑麦双二倍体
(DDRR), 进而自交衍生了各代双二倍体, 观察表明
该双二倍体稳定性(育性)随代数增加而逐步提高, 这
些育性不同的各代双二倍体为研究多倍体基因组变
异和稳定性的关系提供了材料。另外, 该双二倍体和
六倍体、八倍体小黑麦相比, 基因组组成简单, 更能
为小麦族属间多倍体形成、进化的分子机制提供信
息。本研究以节节麦与黑麦杂种和育性逐代提高的
各代双二倍体为材料, 利用 ALFP、MASP 技术研究
节节麦杂交和加倍后双二倍体稳定过程中的基因组
序列变化, 探讨双二倍体育性提高、细胞学稳定过程
中的分子机制, 为新物种的形成进化提供新的资料。
1 材料与方法
1.1 植物材料及其结实率调查
节节麦 85A-34 (Aegilops tauschii)原采自陕西西
安, 荆州黑麦(Secale cereale cv. Jingzhou Heimai)为
南京农业大学细胞遗传研究所保存材料。以节节麦
为母本和黑麦杂交, 授粉 14~16 d 进行幼胚培养, 越
夏后于 10 月中旬利用秋水仙素加倍处理。次年选择
开花散粉、最高结实率(12.3%)的 S0 单株自交衍生
S1、S2、S3 和 S4 代, 每代选择 3 株 2n = 28 的个体进
行分析。每植株取 5 穗, 统计基部 2 朵小花结实粒
数占小花总数的比例, 计算结实率。采用常规的醋
酸洋红压片方法进行体细胞染色体计数和花粉母细
胞减数分裂中期 I (MI)染色体配对分析。
1.2 AFLP和 MSAP分析
采用改良的 CTAB 法[18]提取 DNA。分析 AFLP
采用 EcoR I+Mse I (E-M)和 Pst I+Mse I (P-M)酶切组
合, 其中 E-M 可以探测整个基因组水平上的重复序
列的改变, 而 P-M 用于检测整个基因组水平上低拷
贝序列的改变 [16]。反应体系 20 µL, 包括 250 ng
DNA、3 U EcoR I (Pst I)、3 U Mse I 和 1×buffer。酶
切反应先 37℃温浴 3 h, 再 65℃温浴 2 h; 然后立即
进行连接反应, 将连接产物稀释 10 倍后进行预扩
增。预扩增反应程序为: 94℃ 3 min; 94 30 s, 56℃ ℃
1 min, 72℃ 1 min, 20 个循环; 72℃延伸 5 min。预扩
增完成后, 稀释 20 倍后进行选择性扩增, 其程序为:
94℃ 3 min; 94℃ 30 s, 65℃ 1 min, 72℃ 1 min, 13 个
循环, 每循环降低退火温度 0.7℃; 然后 94℃ 30 s,
56℃ 1 min, 72℃ 1 min, 23 个循环; 最后 72℃延伸
5 min。选择扩增后的样品加入 10 μL loading buffer
(98%甲酞胺; 10 mmol L1 EDTA, pH 8.0; 0.25 %溴酚
蓝; 0.25%二甲酚蓝), 95℃变性 5 min, 然后迅速放入
冰浴中冷却, 最后在 7%聚丙烯酰胺凝胶上 80 W 电
泳 3 h (含预电泳 30 min)分离产物。
分别用 EcoR I/Hpa II、EcoR I/Msp I 组合对基因
组 DNA 进行酶切, 连上接头, 进行 MSAP 分析。应
用上述 AFLP 扩增程序进行预扩增和选择性扩增,
998 作 物 学 报 第 38 卷

产物经上样缓冲液变性后, 在 6%聚丙烯酰胺凝胶上
电泳分离, 银染检测。
2 结果与分析
2.1 节节麦和黑麦双二倍体各代的育性和细胞
学稳定性
双二倍体各代体细胞染色体 2n=28 的植株比例
随自交世代的增加而升高, S1 代为 57.1%, 至 S4 代已
达 92.5% (表 1); 花粉母细胞减数分裂 MI 期的二价
体平均数从 S1 代的 11.70 提高到 S4 代的 12.25 个, 同
时结实率也从 24.5%提高到 51.3%, S4 单株个体最高
结实率达 70.5% (表 2)。表明随着世代的增加, 该双
二倍体的染色体细胞学特性趋向稳定。
2.2 节节麦和黑麦杂种和双二倍体的基因组变
异分析
2.2.1 AFLP 分析 E-M 酶切共进行了 13 个引物
组合的反应, 在两亲本间检测到 499 条带(表 3 和图
1), 其中双亲共有带 151 条, 黑麦特异带 103 条, 节
节麦特异带 245 条。在杂种 F1 和双二倍体中出现 2
种类型的序列变异 , 以序列消失类型为主 , 双亲共
消失 65 个片段, 占 13.03% (65/499), 其中双亲共有
带消失 3 条, 黑麦和节节麦特异带分别消失 32 条和
30 条。从序列消失的世代看, 在 F1消失的带数为 53
条, 占总消失带的 81.54% (53/65), 包括双亲共有带
1 条, 占双亲共有带消失总数的 33.33% (1/3), 黑麦
特异带 31 条, 占黑麦总消失带数的 96.88% (31/32),
节节麦特异带 21 条, 占节节麦总消失带数的 70.00%
(21/30)(表 3)。此外, 双二倍体各代均有少量的序列
消失。序列变异的另一种类型是出现双亲所没有的
新片段, 共检测到 18 个新增片段, 其中 8 条发生在
F1代, 占新增总片段的 44.44%, 新增片段仅在 F1或
S1中出现的 2 条, 占新增总片段的 11.11% (表 3)。
P-M 酶切组合共进行了 12 个引物组合的反应,
在两亲本中共检测到 507 条带, 其中双亲共有带 151
条, 黑麦和节节麦特异带分别为 179 条和 177 条。
在双亲杂交后代及其各衍生世代中, 同样以序列消
失为主要变异类型。双亲共消失 72 个片段(13.03%),
其中双亲共有带消失 6 条, 黑麦特异带消失 49 条,
节节麦特异带消失 17 条(表 3)。在 F1代消失的带数
最多, 为 51 条, 占总消失带数目的 70.84% (51/72),
包括双亲共有带 2 条, 占双亲共有带消失总数的 33.33%
(2/6)、 黑 麦特 异 带 40 条 , 占 黑 麦总 消 失 带 数的
81.64% (40/49)、节节麦特异带 9 条, 占节节麦总消
失带数的 52.95% (9/17)(表 3)。双二倍体各代均有少
量的序列消失。在杂种和双二倍体各世代中共发现
14 条新增带, 其中 F1 代检测到 5 条, 占新增片段的
35.71% (表 3)。
上述结果表明, 在节节麦和黑麦杂交和加倍过
程中, 子代继承双亲基因组均发生了较大的遗传改
变 , 尤其是黑麦基因组 , 并且基因组的变异主要发
生于 F1 代。
2.2.2 MSAP 分析 在全部 319 条扩增带中, 285
条(89.34%)在亲本、杂种和双二倍体各世代没有变
化(表 4 和图 2)。甲基化状态发生改变的位点有 34

表 1 双二倍体各世代根尖细胞染色体倍性
Table 1 Diploidy of root tip cells in Ae. tauschii-S. cereale amphidiploid progenies
三倍体 Triploid (2n = 21) 四倍体 Tetraploid (2n = 28) 五倍体 Pentaploid (2n = 35) 非整倍体 Aneuploid 世代
Generation
种子数
No. of
seeds
植株数
No. of plants
比例
Rate (%)
植株数
No. of plants
比例
Rate (%)
植株数
No. of plants
比例
Rate (%)
植株数
No. of plants
比例
Rate (%)
S1 28 5 17.9 16 57.1 3 10.7 4 14.3
S2 40 2 5.0 31 77.5 1 2.5 6 15.0
S3 36 1 2.8 29 80.6 1 2.8 5 13.9
S4 40 0 0.0 37 92.5 0 0.0 3 7.5

表 2 不同世代的双二倍体(2n = 28)的花粉母细胞(PMC) MI 期染色体配对构型
Table 2 Chromosomal configuration of pollen mother cells (PMCs) at MI stage in amphidiploids (2n = 28) of different generations
二价体 Bivalent 结实率 Seed-setting rate (%)世代
Generation
植株数
No. of plants
PMC 数
No. of
PMCs
单价体
Univalent 环型 Ring 棒型 Rod 合计 Total
三价体
Trivalent 平均值 Mean 范围 Range
S1 21 1050 4.51 6.13 5.57 11.70 0.03 24.5 6.137.5
S2 27 810 4.33 6.44 5.35 11.79 0.03 31.2 24.147.6
S3 20 452 3.82 7.12 4.91 12.03 0.04 45.2 33.660.2
S4 20 460 3.44 6.85 5.40 12.25 0.02 51.3 33.070.5
第 6 期 李锁平等: 节节麦和黑麦杂种 F1及双二倍体中基因组变异分析 999


表 3 节节麦与黑麦杂交 F1 及其双二倍体各世代的基因组序列变异
Table 3 Variation of genomic sequence in F1 hybrid and amphidiploids derived from cross between Ae. tauschii and S. cereale
消失的亲本带型 Lost parental bands AFLP 标记
AFLP marker
世代
Generation DD+RR RR DD 总数 Total
新增带
Novel bands
EcoR I/Mse I 片段数 No. of fragments 151 103 245 499 18
F1 1(0.66) 31(30.09) 21(8.57) 53(10.63) 8(44.44)
S1 1(0.66) 0(0.00) 2(0.81) 3(0.61) 3(16.67)
S2 0(0.00) 1(0.97) 4(1.62) 5(1.00) 3(16.67)
S3 1(0.66) 0(0.00) 3(1.22) 4(0.81) 2(11.11)
S4 0(0.00) 0(0.00) 0(0.00) 0(0.00) 0(0.00)
合计 Total 3(1.99) 32(31.07) 30(12.24) 65(13.03) 16(89.89)
仅 F1 消失片段 Bands lost only in F1 2(1.32) 5(4.85) 2(0.81) 9(1.80)
仅 F1 和 S1 新增片段 Novel bands only in F1 and S1 2(11.11)
Pst I/Mse I 片段数 Number of fragments 151 179 177 507 14
F1 2(1.32) 40(22.34) 9(5.08) 51(10.06) 5(35.71)
S1 1(0.66) 4(2.23) 8(4.51) 13(2.57) 2(14.29)
S2 1(0.66) 1(0.55) 0(0.00) 2(0.40) 3(21.43)
S3 0(0.00) 0(0.00) 0(0.00) 0(0.00) 1(7.15)
S4 2(1.32) 4(2.23) 0(0.00) 6(1.19) 1(7.15)
合计 Total 6(3.97) 49(27.37) 17(9.60) 72(14.21) 12(85.71)
仅 F1 消失片段 Bands lost only in F1 4(2.64) 9(5.02) 3(1.69) 16(3.16)
仅 F1 和 S1 新增片段 Novel bands only in F1 and S1 2(14.29)
括号中数据表示百分率。DD+RR: 节节麦和黑麦共有带; RR: 黑麦特有带: DD: 节节麦特有带。
Data in parentheses are percentages. DD+RR: common bands of Ae. tauschii and S. cereale; RR: specific band of S. cereale; DD: spe-
cific band of Ae. tauschii.



图 1 节节麦与黑麦杂种和双二倍体的 AFLP 带型
(EcoR I/Mse I)
Fig. 1 AFLP banding patterns in hybrids and amphidiploids
between Ae. tauschii and S. cereale (EcoR I/Mse I)
R: 黑麦; D: 节节麦; F1: 黑麦–节节麦杂种; S1~S4: 双二倍体
1~4 代。每世代检测 3 株, 株号为 1~3。箭头示在杂种或双二倍
体中亲本带消失; 星号示新增带。
R: S. cereale; D: Ae. tauschii; F1: Ae. tauschii-S. cereale hybrids;
S1–S4: amphidiploid generations 1 to 4. In each generation, three
plants, encoded with 1, 2, and 3, were detected. Arrows show lost
parental bands in F1 hybrids or amphidiploid generations. Asterisks
show novel fragments in F1 or amphidiploid plants.
个, 其中甲基化和去甲基化位点分别为 27 个和 7 个,
表明以甲基化变异为主。F1 代甲基化状态改变位点
为 21 个(包括 16 个甲基化和 5 个去甲基化位点, 其
中 15 个甲基化和 3 个甲基化位点可遗传到双倍体各
代), 多于 S1 代 13 个甲基化位点改变(11 个甲基化位
点和 2 个去甲基化位点)(表 4)。在 S2~S4 代中没有检
测到甲基化变异。
3 讨论
3.1 节节麦和黑麦杂种和双二倍体遗传改变和
表观遗传改变
小麦族种间杂种和属间杂种、多倍体的遗传和
表观遗传改变已有报道。最初是利用一套有限位点
来研究杂种或新合成的多倍体中的遗传改变[9,19-20]。
Shaked 等[21]试验表明 ALFP 及其派生的 MSAP 技术
可以有效地用于分析小麦族全基因组遗传和表观遗
传改变。
Ozkan 等 [9]以小麦属和山羊草属种间或属间杂
种为材料, 研究了小麦基因组特异的低拷贝、非编
码序列(GSS)或染色体特异的低拷贝、非编码序列
(CSS)的丢失规律, 表明 GSS 丢失始于 F1, 而 CSS
丢失一般在 S1 发生。在 Ae. sharonensis (S1S1)与 Ae.
1000 作 物 学 报 第 38 卷

表 4 节节麦、黑麦及杂种 F1、双二倍体胞嘧啶甲基化变化模式
Table 4 Patterns of cytosine methylation alteration in F1 hybrid and amphiploids between Ae. tauschii and S. cereale
位点数 No. of sites 子代甲基化变化模式
Methylation alteration pattern in progenies 亲本间单态
Monomorphism between parents
亲本间多态
Polymorphism between parents
总数
Total
比例
Percentage
(%)
无变化 No change F1 ,S1 121 164 285 89.34
去甲基化 Demethylation F1 1 4 5†
S1 2 0 2
合计 Subtotal 3 4† 7 2.23
甲基化 Methylation F1 0 16 16††
S1 5 6 11
合计 Subtotal 5 22†† 27 8.47
† F1 和 S1 代均发生去甲基化的位点有 3 个; †† F1 和 S1 代均发生甲基化的位点有 15 个。
† Three sites occurred demethylation in both F1 and S1 generations. †† Fifteen sites occurred methylation in both F1 and S1 generations.



图 2 节节麦和黑麦杂种和双倍体 MSAP 带型模式(Hpa II /Msp I)
Fig. 2 MSAP banding profiles of the hybrids and amphidiploids between Ae. tauschii and S. cereale
R: 黑麦; D: 节节麦; F1: 杂种; S1~S4: 双二倍体 1 到 4 代。1, 2, 3 代表株号。H 和 M 分别代表用 EcoR I-Hpa II 和 EcoR I-Msp I 切割。
箭头表示在杂种或双倍体中亲本带消失, 星号表示新增带。
R: S. cereale; D: Ae. tauschii; F1: hybrids; S1–S4: amphidiploids 1 to 4 generations. Numbers from 1 to 3 represent three plants in the corre-
sponding generation. H and M refer to digestion with EcoR I-Hpa II and EcoR I-Msp I, respectively. Arrows indicate those bands that absent
in the hybrids or amphidiploids, whereas asterisks indicate novel fragments in the F1 or amphidiploids．

umbellulata (UU)杂交中, AFLP 带消失主要在杂种中
发生; 而在另一个杂交 Ae. longissima × T. urartu 组
合中, 序列消除在加倍后更频繁发生[21]。在芸薹属
(Brassica)和山羊草属 (Aegilops)中也观察到序列消
除现象, 被消除的序列在某种程度上倾向于来自其
中 一 个 亲 本 基 因 组 的 序 列 。 在 异 源 多 倍 体 小 麦
AABB[12]中观察到丢失的片段倾向于来自父本基因
组, 但在异源多倍体芸薹属多倍体 AACC 中并没有
第 6 期 李锁平等: 节节麦和黑麦杂种 F1及双二倍体中基因组变异分析 1001


类似的现象[8]。Shaked 等[21]在山羊草属的 Ae. Sharo-
nensis (S1S1)与 Ae. umbellulata (UU)杂种中发现, 前
者 AFLP 带在杂种中丢失达 14%, 而后者仅丢失
0.5%。Feldman 等[19]和 Liu 等[20,22]以小麦特异序列
为探针, 发现某一序列是否会从一个亲本基因组成
分中被消除, 与其他亲本基因组中是否存在该序列
的同源序列有关。若在异源多倍体的 2 个亲本基因
组中都有该序列, 则更被易消除。
Ma 等[16]在小黑麦中用酶切组合 E-M 和 P-M 引
物分别扩增重复序列和低拷贝的序列, 结果发现序
列消除是主要的 , 新增带少 , 重复序列比低拷贝序
列更容易变异 ; 小麦的基因组较黑麦基因组保守 ,
特别是在八倍体小黑麦中, 黑麦的基因组在八倍体
和六倍体中都发生了频率较大的变异 (68%~72%);
以 cDNA 探针的 RFLP 检测表明, 97%以上的小麦编
码序列在小黑麦中得到保留, 而仅有 61.6%的黑麦
编码序列被维持, 变异频率大大高于其他研究的多
倍体, 推测这和小黑麦中亲本间的基因组来自不同
属的物种、相互差异较大有关, 同时小麦细胞质背
景也是决定序列变异的一个因素。Ma 等[17]还研究了
小麦和黑麦杂种和双二倍体基因组改变的频率和时
间, 发现小黑麦的大量基因组变异伴随着远缘杂交
立即发生, 在 E-M 和 P-M 引物组合中各有 46.3%和
36.2%小麦亲本消失带是在杂种中发生的 , 而黑麦
中, 这个比例大约分别是 74.5%和 68.4%。染色体加
倍后, 基因组的变异以很小的频率发生。黑麦基因
组的变异在前 5 代有较大的变异频率, 其中 C3 代频
率最高, 而不是 C1 代, 推测细胞质和亲缘程度是序
列变化方向、时间、数量和速率的决定因素。本研
究的节节麦和黑麦在 E-M 和 P-M 引物组合中, 其特
异 带 在 杂 种 中 消 失 的 占 总 消 失 带 的 比 分 别 为
70.00%、52.95%和 96.88%、81.64%。说明序列消除
主要发生在杂种中, 双二倍体各代均有一定的变异,
这和 Ma 等[17]的结果一致。另外, 在杂种和双二倍体
中出现新增片段, 黑麦基因组比节节麦发生更大的
遗传变异。
Liu 等 [20,22]首先发现小麦中异源多倍体物种形
成可诱发稳定遗传的胞嘧啶甲基化变异, 变异的序
列包括整个基因组范围内的低拷贝编码序列和非编
码序列。Shaked 等[21]在 Ae. sharonensis (S1S1)和 T.
monococcum (AmAm)杂种和双二倍体 MSAP 分析中
发现, 约 6.9%的甲基化位点在杂种中发生改变并在
双二倍体中维持, 1.8%的位点在杂种中改变但在双
二倍体中恢复到亲本状态, 4.4%的位点在双二倍体
中改变。总体上不同模式甲基化的频率可达 13%。
在本研究中节节麦和黑麦杂种和加倍能够导致节节
麦和黑麦基因组表观遗传改变, 主要发生在杂种中,
加倍后主要发生在双二倍体的早期时代, 甲基化改
变以甲基化为主。本研究的材料为连续 4 代自交后
代 , 在 S2 代以后 , 没有检测到甲基化状态的改变 ,
在后代可以稳定地遗传。Liu 等[23]发现甲基化已经存
在于人工合成的多倍体小麦 S5、S6 和 S7 代, 且 3 代
各 3 个单株的 RFLP 带高度一致, 在 3 个世代间可以
稳定地遗传, 推测甲基化的变异可能更早。本研究
结果证实了这一推测。
3.2 节节麦和黑麦双二倍体稳定性及其和序列
遗传改变和表观遗传改变的关系
人工合成多倍体最初几代往往存在细胞学不稳
定性, 结实性差。快速选择获得细胞学稳定、结实
率高的多倍体是形成新物种的前提。鲍文奎[24]在总
结 40 年小黑麦育种经验时指出, 新合成的八倍小黑
麦的育性差和不饱满问题不是亲本黑麦和小麦带来
的 , 而是两亲本基因组的相互作用引起的 , 并指出
新形成的多倍体的育种必须选择新的基因组合。在
多倍体形成过程中, 出现重复序列大量扩增和互渗
现象, 这种变化和多倍体稳定密切相关[25]。本研究
利用结实性和细胞学稳定性逐代提高的多倍体基因
组序列分析表明 , 在这个过程中 , 亲本基因组序列
消除和新增, S2 代后序列变化改变较小, 但没有发
生表观遗传改变 , 说明节节麦–黑麦双二倍体在细
胞学稳定过程中序列遗传改变可能发挥重要作用 ,
而表观遗传改变作用较小。
4 结论
AFLP 分析表明, 在节节麦和黑麦杂交和加倍
过程中 , 两者的基因组均发生了较大的遗传改变 ,
其中黑麦的基因组发生更大的遗传改变, 节节麦和
黑麦特异带以消失为主 , 且主要发生在杂种 F1。
MSAP 分析表明, 节节麦和黑麦杂种和加倍能够导致
节节麦和黑麦基因组表观遗传改变, 主要发生在杂
种中 , 加倍后主要发生在双二倍体的早期时代 , 甲
基化改变以甲基化为主。在节节麦–黑麦双二倍体 S2
代以后育性稳定过程中, 没有检测到甲基化的改变,
推测新合成的双二倍体育性的提高和甲基化无关。
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