全 文 ：植物遗传资源学报 2010, 11(4):428-432JournalofPlantGeneticResources
库存和圃存对雀麦属种质遗传完整性的影响
游国卿 1 ,石凤翎1 ,卢新雄 2 ,李志勇3 ,师文贵 3
(1内蒙古农业大学生态环境学院 ,呼和浩特 010019;2中国农业科学院作物科学研究所 /农业部作物种质资源与
生物技术重点开放实验室 ,北京 100081;3中国农业科学院草原研究所 ,呼和浩特 010010)
　　摘要:利用 20条 ISSR引物 , 对 7份雀麦属种质进行遗传完整性检测 ,每一份种质包括库存和圃存两个供试亚群体。提取
方法为混合取样。本试验 7份种质的供试亚群体之间遗传相似性系数除无芒雀麦 3为 0.78之外 , 其余均大于 0.80。采用聚
类分析除无芒雀麦 3和杂色雀麦出现分支外 , 其余种质亚群体分支都按照同一种质群分别聚类。本试验表明雀麦属种质资源
在圃存条件下 , 经多年保存易发生遗传分化 , 从而影响其遗传完整性。
关键词:雀麦属种质;遗传完整性;保存
GeneticIntegrityAnalysisofBromusAccessionsbyISSR
YOUGuo-qing1 , SHIFeng-ling1 , LUXin-xiong2 , LIZhi-yong3 , SHIWen-gui3
(1CollegeofEcologyandEnvirnment, InnerMongoliaAgriculturalUniversity, Hohhot010019;2KeyLaboratoryofCropGermplasm
andBiotechnology, MinistryofAgriculture/InstituteofCropSciences, ChineseAcademyofAgriculturalSciences, Beijing100081;
3GrasslandResearchInstitute, ChineseAcademyofAgriculturalSciences, Hohhot010019)
　　Abstract:Thegeneticintegrityof7accessionsofBromusstoredingenebankofInnerMongoliainvestigatedby
20 ISSRprimers.Eachaccessionwasrepresentedbytwosub-populationsregeneratedindiferentconservation.The
geneticsimilaritybetweenthetwosub-populationsofthesameaccessionwasabove0.80, exceptfor0.78 inWu-
mangquemai3.ClusteranalysisbasedonthesimilaritycoeficientshowedthatWumangquemai3 andZasequemai
divergedfromeachother, falingintotwobranches, andeachoneclusterwascreatedbytwosub-populationsofthe
sameaccessions.TheresultsshowedthattheBromusstoredoutsidehadmuchmoregeneticdivergence.
Keywords:Bromus;Geneticintegrity;Conservation
收稿日期:2009-04-28 修回日期:2009-12-14
基金项目:农作物基因资源安全保存评价关键技术研究(2006BAD13B10-08);中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(中国农业科学院
草原研究所)(2006-1-06);内蒙古科技厅草业专项(20071923)
作者简介:游国卿 ,硕士研究生。 E-mail:youyu1014@ 126.com
通讯作者:石凤翎 ,教授。 E-mail:sfl0000@ 126.com
　　目前牧草种质资源主要保存方式是种质圃保存
和种质库保存 ,这两种传统的保存方式便于长期保
存 ,在完整地保存某物种所有的多样性等方面有着
不可替代的重要性 。种质圃具有保存相对稳定 、效
率高 、花费少等优点 ,但是不可避免受到环境的影
响 。同时 ,繁种群体大小 、授粉方式和种子收获方式
等因素会影响遗传完整性的变化。库存不容易受到
外界环境的影响 ,保存稳定 ,但是相对圃存花费大 ,
耗费能源多 ,不利于节约[ 1-2] ,而且库存保存一定年
限后不可避免要进行繁种更新 ,因此库存和圃存要
相互补充 ,缺一不可 。
对于保存相同年限的种质 ,采用何种保存方式
对其遗传完整性影响最小这一问题越来越受到人们
的关注。因此对比研究库存和圃存对遗传完整性的
影响有着重要的意义。
1　材料与方法
1.1　试验材料
7份雀麦属材料(表 1),每一份都有两个供试
亚群体。一个亚群体来自中国农科院草原所种质
　4期 游国卿等:库存和圃存对雀麦属种质遗传完整性的影响
库 ,另一个亚群体来自中国农科院草原所种质圃 。
来源于种质圃的叶片 ,每 5株按比例混合为一份供
试材料 。对于种质库的种子将其置于 25℃黑暗条
件下发芽 ,培育 15d后得到黄化苗 ,每 15株为一个
混合样本。
供试种子入库时间为 2004年 ,同年将该种子播
入种质圃中 。
表 1　试验材料
Table1　Thematerialsusedinthisstudy
圃存编号
Number
ofnursery
库存编号
Numberof
genebank
种质名称
Name
学名
Latinname
1 2 无芒雀麦 1 B.inermisLeys.
3 4 疏花雀麦 1 B.remotiflorum(Stend.)Ohwi
5 6 无芒雀麦 2 B.inermisLeyss.
7 8 杂色雀麦 B.variegates
9 10 草甸雀麦 B.bieberstenni
11 12 无芒雀麦 3 B.inermisLeyss.
13 14 疏花雀麦 2 B.remotiflorum(Stend.)Ohwi
1.2　方法
1.2.1　DNA的提取 　取幼嫩的材料在液氮中研
磨 ,采用俞金荣 [ 3]改良 CTAB法提取 ,略有改进 。用
UnicoUV-4802型分光光度计检测 DNA的质量和
浓度 , DNA的工作浓度为 20ng/μl。
1.2.2　引物筛选　从小麦族中选取 24条 ISSR引
物 ,从中筛出 20条条带清晰 、多态性高 、重复性好的
引物用于扩增所有样品。
1.3　PCR分析
PCR总反应体积 20μl。优化的 20μl扩增体系
为:模板 DNA40ng,引物 10μmol/L, TaqDNA聚合酶
0.5U/μl, dNTP0.3mmol/L。扩增程序为经 94℃预
变性 5min;45个循环为 94℃变性 45s, 50 ～ 56℃退
火 60s, 72℃延伸 90s;最后 1个循环完成后 ,在 72℃
下延伸 7min。
1.4　电泳和银染
扩增产物加 5μl上样缓冲液(loadingbufer)于
95℃变性 5min后冰浴冷却待用 。采用 6%变性聚
丙烯酰胺凝胶 ,预电泳 30min后上样 3μl。电泳缓
冲液上槽为 1/3 ×TBE,下槽为 1/2 ×TBE,恒功率
80W。电泳 1.5h左右 ,硝酸银染色 。胶晾干后观察
记录 ,数码相机照相。
1.5　数据处理
每个样品的电泳条带按有或无记录 ,电泳条带
存在时赋值 1,否则赋值 0。根据条带计算遗传相似
系数(GS),按 Jaccard系数的方法计算 GS:GS=X12 /
(X1 +X2 +X12),其中 X1和 X2分别为成对比较的两
个取材部位特有扩增条带数 , X12为共有带数 。聚类
分析按照 UPGMA方法进行 ,所有数据处理均由 NT-
SYS-PC2.02和 Excel完成 。
2　结果与分析
2.1　库存种子材料发芽情况
将库存 4年的种子材料 ,置于 25℃、光照条件
下 ,发芽 15d(表 2)。由此可见在低温库中 ,贮藏 4
年仍获得 90%以上的高发芽率。
表 2　试验材料发芽情况
Table2　Thegerminationstatusofthematerials
种质名称
Name
发芽率(%)
Germination
rate
发芽势(%)
Germination
energy
发芽指数
Germination
index
活力指数
Vigor
index
无芒雀麦 1 96 92 15.75 3.83
无芒雀麦 2 95 91 15.75 3.80
无芒雀麦 3 96 91 15.70 3.85
疏花雀麦 1 92 89 14.98 3.94
疏花雀麦 2 90 89 14.80 3.94
杂色雀麦 93 90 15.60 3.66
草甸雀麦 90 91 15.00 3.76
2.2　ISSR标记和遗传相似性分析
20条引物在 14份材料中共检测到 150个等位
基因 ,每个 ISSR上等位基因的个数为 4 ～ 9个 ,平均
为 7.5个(图 1)。在检测到的 150个等位基因中分
别检测到另一种保存方式所没有的等位基因 。其中
来自圃存特有等位基因的数目 4 ～ 14个 ,平均为
8.3个;来自库存特有等位基因的数目为 4 ～ 26个 ,
平均为 9.7个(表 3)。由此结果可以说明 ,同样的
种质资源采用库存和圃存两种不同的保存方式 ,经
过一定年限的保存 ,圃存会导致一些遗传片段的丢
失 ,而库存过程中遗传片段丢失的基因片段很少 ,因
此造成库存和圃存在分子标记上的差异。
根据 ISSR多态性数据 ,计算每一份材料的遗传
相似性系数(表 3),其变化范围在 0.78 ～ 0.93之间 ,
平均为 0.87。其中无芒雀麦 3种质资源库存和圃存
两个亚群体的遗传相似性系数为 0.78在各供试材料
中最低 ,这说明无芒雀麦 3的遗传物质稳定性较差 ,
更容易受到外界环境的不良影响 ,从而导致遗传物质
的丢失。而疏花雀麦 1和无芒雀麦 2的遗传相似性
系数均为 0.93,远远高于平均值 。由此说明疏花雀麦
1和无芒雀麦 2的遗传物质稳定 ,不易丢失。
429
植　物　遗　传　资　源　学　报 11卷
图 1　引物 UBC825和 UBC835的电泳图谱
Fig.1　PolyacrylamidegelelectrophoresisofprimersUBC825andUBC835
1 ～ 14:库(圃)存编号
表 3　14份供试材料 ISSR数据分析结果
Table3　Analysisofdata
种质名称
Name
共有等位基因
No.oftotalaleles
圃存 Nursery
特有等位基因数
No.ofuniquealeles
百分比(%)
Percentage
库存 Genebank
特有等位基因数
No.ofuniquealeles
百分比(%)
Percentage
遗传相似系数
Geneticsimilarity
无芒雀麦 1 118 9 6.6 10 7.2 0.86
疏花雀麦 1 112 4 3.0 5 3.8 0.93
无芒雀麦 2 125 4 2.9 6 5.1 0.93
杂色雀麦 128 7 5.0 4 2.8 0.92
草甸雀麦 117 14 10 9 6.4 0.82
无芒雀麦 3 105 9 6.4 26 19.6 0.78
疏花雀麦 2 117 11 8.0 8 5.9 0.86
合计 117.4 8.3 6.0 9.7 7.3 0.87
2.3　聚类分析
根据 ISSR数据矩阵 ,按照 UPGMA进行聚类分
析得到 14份材料的树状聚类图(图 2)。从聚类图
可以看出 ,除无芒雀麦 3和杂色雀麦遗传上出现分
化外 ,其他群体分支都按照同一种质群分别聚类 。
无芒雀麦 3的种质材料亚群体和无芒雀麦 2种质群
遗传距离近于其与无芒雀麦 3叶片材料。这说明无
芒雀麦 3的种质内遗传相似性低于与无芒雀麦 3种
间的遗传相似性 ,从而导致了遗传聚类上的分支 。
同样 ,圃存杂色雀麦和疏花雀麦 1遗传距离要比其
与疏花雀麦 2的距离近 ,这说明种质间遗传相似性
系数明显高于种质内遗传相似性。其余种质的群体
之间未出现明显的遗传分化 ,种质内的遗传相似性
高于种质间遗传相似性。
2.4　取样方法验证
鉴于单株取样和混合取样两种方法的优点不
同 ,在重复试验过程中针对一些处理采取单株取样
的方法 ,希望可以弥补混合取样带来的不足。试验
结果表明 ,单株取样与混合取样对试验结果几乎没
有影响(图 3)。所以单株取样和混合取样策略均可
运用于牧草种质资源遗传完整性检测。
3　讨论
3.1　保持种质遗传完整性的重要性
在种子保存过程中 , 种子的活力会随保存时间
的延长而逐步降低 [ 5] , 不同种子会因为基因型的不
同 ,在圃存过程中影响其遗传完整性 ,同时贮藏还可
诱发可遗传的点突变 , 因此繁殖更新可以降低贮藏
种子基因突变和田间选择对种质资源遗传完整性的
430
　4期 游国卿等:库存和圃存对雀麦属种质遗传完整性的影响
图 2　14份雀麦属种质群体的聚类分析
Fig.2　UPGMAdendrogramof14Bromusbasedongeneticsimilarity
图 3 单株取样和混合取样对照图
Fig.3 Individualandmixedsampling
影响 [ 6] 。目前国内外种质基因库繁殖更新的发芽率
标准通常在 65% ～ 85%[ 7] 。如 IPGRI推荐标准为发
芽率 85%, 或活力下降 15%, 最低临界值为发芽率
65%[ 8-9] ;印度的更新发芽率指标为 75%[ 10] 。具体到
牧草种质资源也可参考上述繁殖更新发芽指标。本
试验中取自种质库的材料发芽率指标均高于 90%。
对于库存种质的繁殖更新 ,为了保持其遗传完
整性 ,可以采用套袋自交的方式 ,防止生物学混杂 ,
繁殖更新过程中需要对繁殖后代进行观察鉴定 ,以
便确定是否有变异和性状出现分离现象。
确保种质在繁种更新过程中维持群体遗传结构
稳定 ,即保持种质群体的基因频率分布及等位基因频
率分布和原始群体一样 ,是种质安全保存的重要目
标 [ 4] 。本试验通过对 7个群体的遗传完整性检测 ,发
现大部分种质的两个供试材料之间具有较高的遗传
相似性 ,未见有明显的分化。个别种质从聚类图上出
现分支现象 ,究其原因可能是圃存种质受到的外界环
境因素影响比较大 ,经过多年的保存受到的选择压力
较大 ,导致遗传分化的出现。而库存的种质自入库以
来从未或者很少进行过繁种更新 ,因此两个亚群体之
间出现遗传差异是可能的。同时保存相同的年限 ,无
芒雀麦 3分化比较明显 ,而疏花雀麦 1和无芒雀麦 2
仍有较高的遗传相似性 ,这说明材料自身基因型比较
稳定 ,不易丢失。因此在繁种更新时应因材更新 ,这
样才能保持种质资源的遗传完整性 。
3.2　ISSR分子标记与雀麦属种质的遗传完整性
检测
分子标记比形态标记稳定 ,不受外界环境影响 ,
准确反映个体间在等位基因上的差别。同工酶也是
一种常用的生理生化指标 ,但是对于自然老化严重
的种质来说 ,因同工酶失去活性而无法准确检测遗
传完整性变化 ,也就是说同工酶受限于种质个体酶
431
植　物　遗　传　资　源　学　报 11卷
活而不能达到准确检测遗传完整性的目的 。目前看
来 , DNA分子标记是普遍认同的遗传检测手段 ,但
是各种标记间也有差别;各种标记都能对一份样品
检测到各自特有指纹 ,但在检测多态性的量上有差
异 ,经筛选的 ISSR引物和其他分子标记相比多态性
带的百分比最大 ,每检测单位带数和基因数都高于
RFLP和 RAPD,而低于 AFLP。但是由于 AFLP是显
性标记 ,而共显性标记的 ISSR可以解决交配系统 、
计算杂合度和父系分析等问题 ,因而 ISSR在遗传检
测中更受青睐 [ 17] 。本试验得到的数据表明 , ISSR
分子标记在扩增雀麦属牧草图谱时 ,同样可以获得
丰富的条带以及显著的差异 ,因此 ISSR分子标记可
以用于雀麦属种质遗传完整性的检测 。
3.3　取样策略
供试样品的取样策略也是遗传完整性检测研究
必须考虑的主要因素。一般认为 ,异花和常异花授粉
植物的居群内遗传多样性丰富 ,个体间差异比较大 ,
个别植株不能反映居群的整体遗传水平 ,大多采取集
团取样 (bulkedseedsamples)来代表居群整体水
平 [ 11-14] 。采用混合取样的分析方法是大规模样本分
析和研究中经济 、省时 、有效的途径。关于牧草遗传
多样性研究的混合取样策略已有很多报道。车永和
等 [ 15]在冰草属取样策略的研究中 ,建议在利用生化
指纹进行冰草属居群间及种间的遗传多样性研究时 ,
其混合取样量最低应保持在 12个个体及以上方能代
表居群整体 ,其数据才能反映居群的整体遗传特性。
刘文献等[ 16]在华山新麦草居群取样策略的 SSR分析
一文中 ,建议利用 SSR技术进行华山新麦草居群遗传
多样性研究 ,以单个居群随机采集 18株华山新麦草
为最佳分析单位个体数目 。在玉米种质遗传完整性
检测中 ,马延飞 [ 4]论文表示可采用混合取样 。但由于
混合样品不同单株间的 DNA互补 ,使某些个体的遗
传变异被隐含 ,不能充分地被检测出来。所以在重复
试验过程中针对一些处理采取单株取样的方法 ,希望
可以弥补混合取样带来的不足。
参考文献
[ 1] 　 WissuwaMAeN.Genotypicdiferencesinthepresenceofhairs
onrootsandgynophoresofpeanut(ArachishypogaeaL.)and
theirsignificanceforphosphorusuptake[ J] .JournalofExperi-
mentalBotany, 2001, 52(361):1703-1710
[ 2] 　 杨秀红 ,吴宗璞 ,张国栋.不同生育期大豆品种根系性状的比
较研究 [ J].大豆科学 , 2002, 21(1):68-70
[ 3] 　 俞金蓉.苜蓿品种间遗传多样性的 ISSR分析 [ D] .重庆:西
南大学 , 2007
[ 4] 　 马延飞.玉米种质衰老及遗传完整性研究 [ D] .北京:中国
农业大学 , 2007
[ 5] 　 ChebotarS, RöderMS, KorzunV, etal.Molecularstudiesonge-
neticintegyityofopen-polinatingspeciesrye(SecalecerealeL.)
afterlong-genebankmaintenance[ J] .TheorApplGenet, 2003,
107:1469-1476
[ 6] 　 王吉明 , 马双武 .西瓜甜瓜种质资源的收集 、保存及更新
[ J] .中国瓜菜 , 2007(3):27-29
[ 7] 　 FrankelOH, BrownAHD, BurdonJJ.Theconservationof
plantbio-diversity[ M] .CambridgeUniversityPress, Cam-
bridge, 1995
[ 8] 　 SackvileHamiltonNR, ChorltonKH.Regenerationofacces-
sionsinseedcolection[ M].IPGRIRome, 1997
[ 9] 　 FAO/IPGRI.Genebankstandards[M].FAO/IPGRI, Rome, 1994
[ 10] 　vanHintumJL, VisserDL.Duplicationwithinandbetweengerm-
plasmcolections.II.DuplicationinfourEuropeanbarleycolections
[J].GeneticResourcesandCropEvolution, 1995, 42:135-145
[ 11] 　孙志民.冰草属植物的遗传多样性研究 [ D].北京:中国农业
科学院研究生院 , 2000
[ 12] 　解新明 ,云锦风 ,赵冰 ,等.蒙古冰草遗传多样性的等位酶分
析 [ J] .草业科学 , 2001, 18(6):6-11
[ 13] 　ZongXX, KagaA, TomookaN.ThegeneticdiversityoftheVigna
angulariscomplexinAsia[ J].Genome, 2003, 46:647-658
[ 14] 　Segovia-LermaA, CantrelRG, ConwayJM, etal.AFLP-based
asessmentofgeneticdiversityamongninealfalfagermplasm
usingbulkDNAtemplates[ J].Genome, 2003, 46:51-58
[ 15] 　车永和 ,李立会 ,何蓓如 .冰草属(AgropyronGaertn.)植物遗
传多样性取样策略基于醇溶蛋白的研究 [ J] .植物遗传资源
学报 , 2004, 5(3):216-221
[ 16] 　刘文献 ,李立会 , 刘伟华 , 等.华山新麦草居群取样策略的
SSR分析 [ J].麦类作物学报 , 2006, 26(2):16-20
[ 17] 　王心宇,陈佩度,元增军,等.ISSR标记在小麦指纹图谱分析中的
应用研究初探[ J].农业生物技术学报 , 2001, 9(3):261-263
(上接第 427页)
[ 9] 　 张黎玉,徐品莲 ,邱瑞镰 .甘薯近缘野生种的搜集和利用研
究 [ J] .中国甘薯 , 1987(1):26-29
[ 10] 　张黎玉, 徐品莲 ,邱瑞镰 ,等 .甘薯近缘野生种三浅裂野牵牛
和白花野牵牛在甘薯育种中的利用 [ J].江苏农业科学 , 1988
(11)∶9-12
[ 11] 　谢一芝, 尹晴红 ,戴起伟 ,等 .甘薯品种抗黑斑病鉴定及其遗
传趋势[ J] .植物遗传资源学报 , 2003, 4(4):311-313
[ 12] 　谢一芝 , 邱瑞镰 ,戴起伟 , 等 .甘薯抗黑斑病育种研究进展
[ J] .杂粮作物 , 1997(2):22-24
[ 13] 　KukimuraH, KomakiK, YoshinagaM.Currentprogressofsweet-
potatobreedinginJapan[ J].JapanAgriResQuarterly, 1990, 24
(3):169-174
[ 14] 　张黎玉 ,邱瑞镰 ,徐品莲 ,等.甘薯 F1抗黑斑病的表现与亲本
抗性水平的关系 [ J].江苏农业科学 , 1994(6):27-29
[ 15] 　黎裕 ,贾继增 ,王天宇.分子标记的种类及其发展 [ J] .生物
技术通报 , 1999, 15(4):19-22
[ 16] 　唐静.甘薯黑斑病抗性基因 AFLP分子标记 [ D].成都:四川
农业大学农学院 , 2005
[ 17] 　袁照年 ,陈选阳 ,张招娟 ,等.甘薯抗 Ⅰ型薯瘟病的 RAPD标
记筛选 [ J].江西农业大学报 , 2005, 27(6):861-863
[ 18] 　蒲志刚 ,唐静 ,王大一 ,等.甘薯抗黑斑病材料 AFLP标记分子
鉴定初步研究 [ J].西南农业学报 , 2008, 21(1):93-95
432