全 文 ：第２０卷　第１期
　Ｖｏｌ．２０　 Ｎｏ．１
草　地　学　报
ＡＣＴＡ　ＡＧＲＥＳＴＩＡ　ＳＩＮＩＣＡ
　　　２０１２年　 １月
　 Ｊａｎ．　　２０１２
ＡＦＬＰ分析人工老化对扁蓿豆遗传完整性的影响
宿　宇１，王建光１＊，卢新雄２，３
（１．内蒙古农业大学生态环境学院，内蒙古 呼和浩特　０１００１８；２．中国农业科学院作物科学研究所，北京　１０００８１；
３．农业部作物种质资源与生物技术重点开放实验室，北京　１０００８１）
摘要：采用ＡＦＬＰ分子标记对经过人工老化处理的不同发芽率水平的扁蓿豆（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ　ｒｕｔｈｅｎｉｃａ　Ｌ．）种质（００－
４０８）进行分析，以探索人工老化在分子水平上对扁蓿豆种质遗传完整性的影响。结果表明：老化处理群体的多态
位点百分比、有效等位基因数、遗传多样性指数和Ｓｈａｎｎｏｎ指数均低于对照群体（Ｐ＞０．０５）。因此，人工老化处理
使扁蓿豆种质的遗传多样性水平有所下降，但对其遗传完整性没有显著影响，由此表明扁蓿豆种质的耐贮性较强。
关键词：扁蓿豆；人工老化；ＡＦＬＰ；遗传完整性
中图分类号：Ｑ９４３　　　　文献标识码：Ａ　　　　　文章编号：１００７－０４３５（２０１２）０１－０１２５－０５
Ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　Ａｇｅｉｎｇ　ｏｎ　Ｇｅｎｅｔｉｃ　Ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ　ｒｕｔｈｅｎｉｃａ　Ｌ．
ＳＵ　Ｙｕ１，ＷＡＮＧ　Ｊｉａｎ－ｇｕａｎｇ１＊，ＬＵ　Ｘｉｎ－ｘｉｏｎｇ２，３
（１．Ｃｏｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｅｃｏｌｏｇｙ　ａｎｄ　Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔ　Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈｏｈｈｏｔ，Ｉｎｎｅｒ　Ｍｏｎｇｏｌｉａ　０１００１８，Ｃｈｉｎａ；
２．Ｃｒｏｐ　Ｓｃｉｅｎｃｅ　Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ，Ｃｈｉｎｅｓｅ　Ａｃａｄｅｍｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ　Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８１，Ｃｈｉｎａ；
３．Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｃｒｏｐ　Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ａｎｄ　Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｂｅｉｊｉｎｇ　１０００８１，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌｙ　ａｇｅｄ　Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ　ｒｕｔｈｅｎｉｃａ　Ｌ．ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　００－４０８ｗｉｔｈ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｇｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ　ｒａｔｅｓ　ｗａｓ
ａｎａｌｙｚｅｄ　ｂｙ　ＡＦＬＰ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｍａｒｋｅｒｓ　ｔｏ　ｅｘｐｌｏｒｅ　ｔｈｅ　ｉｎｆｌｕｅｎｃｅ　ｏｆ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ａｇｉｎｇ　ｏｎ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ　ｏｆ
Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ　ｒｕｔｈｅｎｉｃａ　Ｌ．ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ａｔ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｌｅｖｅｌｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ　ｏｆ　ｐｏｌｙｍｏｒ－
ｐｈｉｃ　ｌｏｃｉ（ＰＰＢ），ｅｆｆｅｃｔｉｖｅ　ｎｕｍｂｅｒ　ｏｆ　ａｌｅｌｅｓ（Ｎｅ），Ｎｅｉ’ｓ　ｇｅｎｅ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｉｎｄｅｘ（Ｈ），Ｓｈａｎｎｏｎ’ｓ　ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ
ｉｎｄｅｘ（Ｉ）ｏｆ　ａｇｉｎｇ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔｓ　ｗｅｒｅ　ｌｏｗｅｒ　ｔｈａｎ　ｔｈａｔ　ｏｆ　ｃｏｎｔｒｏｌ，ｂｕｔ　ｔｈｅｒｅ　ｗａｓ　ｎｏ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ｂａｓｅ
ｏｎ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｖａｒｉａｎｃｅ．Ｔｈｉｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅｄ　ｔｈａｔ　ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ａｇｉｎｇ　ｃａｕｓｅｄ　ｄｅｃｌｉｎｉｎｇ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｖｅｒｓｉｔｙ　ｂｕｔ　ｄｉｄ　ｎｏｔ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ　ａｆｆｅｃｔ　ｔｈｅ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ　ｏｆ　Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ　ｒｕｔｈｅｎｉｃａ　Ｌ．ｇｅｒｍｐｌａｓｍ．Ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ　ｒｕ－
ｔｈｅｎｉｃａ　Ｌ．ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　ｈａｓ　ａ　ｈｉｇｈ　ｓｔｏｒａｂｉｌｉｔｙ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ　ｒｕｔｈｅｎｉｃａ　Ｌ．；Ａｒｔｉｆｉｃｉａｌ　ａｇｉｎｇ；ＡＦＬＰ；Ｇｅｎｅｔｉｃ　ｉｎｔｅｇｒｉｔｙ
　　扁蓿豆（Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ　ｒｕｔｈｅｎｉｃａ　Ｌ．）是多年生豆
科牧草，广泛分布于我国北方地区，其营养价值高、
抗寒性强、抗干旱、耐盐碱、耐瘠薄，在黑钙土、栗钙
土和中度盐碱土上均能良好生长，尤其在紫花苜蓿
（Ｍｅｄｉｃａｇｏ　ｓａｔｉｖａ　Ｌ．）不能越冬生长的寒冷地区和
相对干旱地区都可以生长良好，是非常适合于北方
地区开发的豆科牧草资源［１］。目前，有少量的针对
扁蓿豆种群遗传多样性的研究［２～３］，而遗传完整性
的研究还较少。
ＡＦＬＰ（ａｍｐｌｉｆｉｅｄ　ｆｒａｇｍｅｎｔ　ｌｅｎｇｔｈ　ｐｏｌｙｍｏｒ
ｐｈｉｓｍ，ＡＦＬＰ）是一种新型的分子标记技术，目前已
广泛应用于生物遗传多样性研究、种质资源鉴定及
动植物育种等领域的研究。本研究以扁蓿豆种质为
材料，首次使用 ＡＦＬＰ分子标记，探讨人工老化处
理所得到的不同发芽率水平群体，其种质遗传完整
性发生变化的情况，为科学制定扁蓿豆种质保存和
更新策略提供理论依据和实践指导。
１　材料与方法
１．１　试验材料
供试的扁蓿豆材料（００－４０８）来自中国农业科学
收稿日期：２０１１－０５－３０；修回日期：２０１１－１１－１４
基金项目：农业部农作物种质资源保护利用项目（２１３０１３５）资助
作者简介：宿宇（１９８５－），男，山西忻州人，硕士研究生，主要从事牧草种质资源和牧草生产领域的研究，Ｅ－ｍａｉｌ：ｓｙ１２０１＠１２６．ｃｏｍ；＊通信
作者 Ａｕｔｈｏｒ　ｆｏｒ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ，Ｅ－ｍａｉｌ：ｗａｎｇｊｇ８５８０＠１６３．ｃｏｍ
草　地　学　报 第２０卷
院草原研究所。
１．２　人工老化处理
将扁蓿豆种子在高温（Ｔ＝４０℃）、高湿（相对湿
度＝９６％）条件下进行老化处理［４］，经过５ｄ，６ｄ和
７ｄ的老化，分别获得发芽率为７０％，６０％和３４％的
处理材料，并以未经人工老化处理发芽率为９５％的
种子作为对照。
１．３　室内发芽率测定
参照《牧草种子检验规程》［５］中规定的发芽条件
进行发芽试验，试验前用砂纸打磨种子，以破除硬
实。发芽床为两层滤纸，将其置于温度２０℃，光照
８ｈ／黑暗１６ｈ的光照培养箱中，逐日检查发芽数，
末次为１４ｄ记数，统计发芽率。
１．４　ＤＮＡ的提取
从不同发芽率水平的处理中取出适量种子种植
于蛭石中并在光照培养箱内培养。温度为２５℃，相
对湿度８０％。待幼苗长至３叶时，分别从每个处理
中随机选取３０株，单株提取ＤＮＡ。提取方法为使
用天根快捷型植物基因组 ＤＮＡ 提取试剂盒进行
ＤＮＡ提取。并将ＤＮＡ用１×ＴＥ稀释成相同的浓
度（５０ｎｇ·μＬ
－１），４℃下备用。
１．５　ＡＦＬＰ分析
ＡＦＬＰ试验程序参照刘秀菊等［６］的方法进行。
ＥｃｏＲⅠ、ＭｓｅⅠ接头和引物由北京三博远志生物
有限公司合成（表１）。ＥｃｏＲⅠ和 ＭｓｅⅠ这２种限
制性内切酶、Ｔ４ＤＮＡ连接酶购自纽英伦生物技术
有限公司。Ｔａｑ　ＤＮＡ聚合酶购自北京天根生化科
技有限公司。
表１　ＤＮＡ接头和ＡＦＬＰ引物的核苷酸系列
Ｔａｂｌｅ　１　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＤＮＡ　ａｄａｐｔｅｒｓ　ａｎｄ　ＡＦＬＰ　ｐｒｉｍｅｒｓ
ＤＮＡ接头和ＡＦＬＰ引物
ＤＮＡ　ａｄａｐｔｅｒ　ａｎｄ　ＡＦＬＰ　ｐｒｉｍｅｒ
核苷酸序列　　　　　　
Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　　　　　　
用途
Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ
ＥｃｏＲⅠ接头 ５′－ＣＴＣＧＴＡＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣ－３′
５′－ＡＡＴＴＧＧＴＡＣＧＣＡＧＴＣＴＡＣ－３′
Ａｄａｐｔｅｒｓ　ｌｉｇａｔｉｏｎ
ＭｓｅⅠ接头 ５′－ＧＡＣＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧ－３′
５′－ＴＡＣＴＣＡＧＧＡＣＴＣＡＴ－３′
Ａｄａｐｔｅｒｓ　ｌｉｇａｔｉｏｎ
ＥｃｏＲⅠ引物
Ｅ００　 ５′－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡ－３′ Ｐｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｅ－ＡＧＧ　 ５′－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＧＧ－３′ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｅ－ＡＣＧ　 ５′－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＧ－３′ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｅ－ＡＡＣ　 ５′－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡＣ－３′ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｅ－ＡＣＡ　 ５′－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＡ－３′ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｅ－ＡＧＣ　 ５′－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＧＣ－３′ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｅ－ＡＣＴ　 ５′－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＴ－３′ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｅ－ＡＡＧ　 ５′－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＡＧ－３′ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｅ－ＡＣＣ　 ５′－ＧＡＣＴＧＣＧＴＡＣＣＡＡＴＴＣＡＣＣ－３′ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ＭｓｅⅠ引物
Ｍ００　 ５′－ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣ－３′ Ｐｒｅ－ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｍ－ＣＡＡ　 ５′－ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＡＡ－３′ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｍ－ＣＡＣ　 ５′－ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＡＣＣ－３′ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｍ－ＣＡＧ　 ５′－ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＡＧ－３′ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｍ－ＣＴＡ　 ５′－ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＴＡ－３′ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｍ－ＣＡＴ　 ５′－ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＡＴ－３′ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｍ－ＣＴＣ　 ５′－ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＴＣ－３′ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｍ－ＣＴＧ　 ５′－ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＴＧ－３′ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
Ｍ－ＣＴＴ　 ５′－ＧＡＴＧＡＧＴＣＣＴＧＡＧＴＡＡＣＴＴ－３′ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ
１．５．１　酶切连接　酶切连接总体系１２．５μＬ，含
ＤＮＡ（５０ｎｇ·μＬ
－１）２μＬ，２０Ｕ·μＬ
－１　ＥｃｏＲⅠ内切
酶０．０７５μＬ，１０Ｕ·μＬ
－１　ＭｓｅⅠ内切酶０．１５μＬ，
４００Ｕ·μＬ
－１　Ｔ４－ＤＮＡ连接酶０．１２５μＬ，ＥｃｏＲ Ⅰ
接头２．５ｐｍｏｌ，ＭｓｅⅠ接头２５ｐｍｏｌ，１０×Ｔ４Ｌｉｇ－
ａｓｅ　ｂｕｆｆｅｒ　０．２５μＬ，１００×ＢＳＡ　０．１２５μＬ。３７℃酶
切连接，过夜（１２～１４ｈ），结束后，６５℃温育２０ｍｉｎ，
－２０℃保存或用于扩增。
６２１
第１期 宿宇等：ＡＦＬＰ分析人工老化对扁蓿豆遗传完整性的影响
１．５．２　预扩增　预扩增反应液总体系为２０μＬ，含
酶切连接产物２μＬ，５０ｎｇ·μＬ
－１Ｅ００引物０．６μＬ，
５０ｎｇ·μＬ
－１　Ｍ００引物０．６μＬ，２．５ｍｍｏｌ·Ｌ
－１
ｄＮＴＰ　１．６μＬ，１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　２μＬ，２．５Ｕ·μＬ
－１
Ｔａｑ酶０．２４μＬ。混匀后在ＰＴＣ－１００型ＰＣＲ仪上进
行扩增。程序为９４℃，２ｍｉｎ；９４℃，３０ｓ；５６℃，３０ｓ；
７２℃，１ｍｉｎ；循环３０次，最后７２℃延伸５ｍｉｎ。预扩
增完成后，用超纯水稀释２０倍，－２０℃保存。
１．５．３　选择性扩增　选择性扩增总体系为１０μＬ，
含稀释过的预扩增产物２μＬ，５０ｎｇ·μＬ
－１　ＥｃｏＲⅠ
引物０．５μＬ，５０ｎｇ·μＬ
－１　ＭｓｅⅠ引物０．５μＬ，２．５
ｍｍｏｌ·Ｌ－１　ｄＮＴＰ　０．９μＬ，１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ　１μＬ，
２．５Ｕ·μＬ
－１　Ｔａｑ酶０．２μＬ。混匀后仍在上述
ＰＣＲ仪上进行扩增，程序为９４℃，２ｍｉｎ，然后按照
９４℃，３０ｓ；６５℃，３０ｓ（每个循环降低０．７℃）；７２℃，
１ｍｉｎ，循环１２次，再按照９４℃，３０ｓ；５６℃，３０ｓ；
７２℃，１ｍｉｎ，循环２３次，最后７２℃延伸５ｍｉｎ。最
终产物－２０℃保存备用。
１．５．４　ＰＣＲ产物电泳检测　在选择性扩增产物中
加入４μＬ　ｌｏａｄｉｎｇ　ｂｕｆｆｅｒ，９５℃变性５ｍｉｎ，立即置
于冰上冷却，以６％变性聚丙烯酰胺凝胶在恒功率
７５Ｗ 下电泳１ｈ，然后银染，显影，读取条带。
１．６　数据处理
统计扩增条带，在同一迁移率上有带记为“１”，
无带记为 “０”，缺失记为 “．”。使用 ＰＯＰＧＥＮＥ
ＶＥＲＳＩＯＮ　１．３２对各个扁蓿豆群体进行遗传相似
性分析和遗传多样性分析，遗传多样性参数包括：多
态位点百分比（ＰＰＢ）、等位基因数（Ｎａ）、有效等位
基因数（Ｎｅ）、遗传多样性指数（Ｈ）、Ｓｈａｎｎｏｎ指数
（Ｉ）等；利用ＳＡＳ　９．０对各老化处理群体遗传多样
性参数进行单因素方差分析。
２　结果与分析
２．１　基因组ＤＮＡ的检测
经０．８％的琼脂糖凝胶电泳检测，试剂盒提取
的基因组ＤＮＡ的带型完整明亮，没有拖尾或弥散，
符合ＡＦＬＰ分析的要求，如图１所示。
图１　扁蓿豆基因组ＤＮＡ琼脂糖凝胶电泳检测结果
Ｆｉｇ．１　Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ　ｒｕｔｈｅｎｉｃａ　Ｌ．ｇｅｎｏｍｉｃ　ＤＮＡ　ｏｎ　ａｇａｒｏｓｅ　ｇｅｌ
２．２　引物筛选
参考其他牧草的 ＡＦＬＰ 分析结果，将 ８ 个
ＥｃｏＲⅠ引物和８个 ＭｓｅⅠ引物两两随机组合［７］，
共有６４个引物对。用５个单株ＤＮＡ分别对其进
行扩增，从中选出多态性好，电泳条带较为清晰的８
对引物组合，用于扁蓿豆材料的ＡＦＬＰ分析，８对引
物的电泳结果如图２所示。
　　８对引物共扩增出９２个位点，其中多态性位点
４１个，占总位点数的４４．５７％，每个引物组合扩增的
位点数在９～１４个之间，引物组合Ｅ－ＡＡＧ／Ｍ－ＣＴＡ
和Ｅ－ＡＣＡ／Ｍ－ＣＴＧ扩增出的多态位点和多态位点
百分比均为最高，分别为７个和５８％；引物 Ｅ－
ＡＣＡ／Ｍ－ＣＴＣ扩增出的多态位点和多态位点百分
比最低，分别为３个和３３％。
２．３　不同老化处理群体遗传多样性分析
由表２可知，对照群体以及经过人工老化处理
后发芽率分别为７０％，６０％和３４％的群体扩增出
的多态性位点数分别为３４，３２，２９和２７，多态性百
分比为３６．９６％，３４．７８％，３１．５２％和２９．３５％。
各老化处理群体的每位点有效等位基因数、遗传
多样性指数和Ｓｈａｎｎｏｎ指数均低于对照群体，由此
表明人工老化后扁蓿豆种质的遗传多样性水平有
所下降。使用ＳＡＳ　９．０对３个参数进行单因素方
差分析，结果显示各个群体间的遗传参数差异未
达到显著水平。
７２１
草　地　学　报 第２０卷
图２　８对引物聚丙烯酰胺凝胶电泳图谱
Ｆｉｇ．２　Ｔｈｅ　ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ　ｏｆ　ｐｏｌｙａｃｒｙｌａｍｉｄｅ　ｇｅｌ　ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｂｙ　ｅｉｇｈｔ　ｐｒｉｍｅｒｓ
（１～８：Ｅ－ＡＡＣ／Ｍ－ＣＡＣ，Ｅ－ＡＡＧ／Ｍ－ＣＴＡ，Ｅ－ＡＡＧ／Ｍ－ＣＴＣ，Ｅ－ＡＣＡ／Ｍ－ＣＴＣ，Ｅ－ＡＣＡ／Ｍ－ＣＴＧ，
Ｅ－ＡＣＣ／Ｍ－ＣＴＡ，Ｅ－ＡＣＴ／Ｍ－ＣＡＣ，Ｅ－ＡＧＣ／Ｍ－ＣＴＡ）
表２　扁蓿豆种质群体的遗传参数
Ｔａｂｌｅ　２　Ｈｅｒｉｔａｂｉｌｉｔｙ　ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔ　ｏｆ　Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ　ｒｕｔｈｅｎｉｃａ　Ｌ．ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
群体（发芽率）
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ／％
多态位点数
Ｋ
多态位点百分比
ＰＰＢ／％
有效等位基因数
Ｎｅ
遗传多样性指数
Ｈ
Ｓｈａｎｎｏｎ指数
Ｉ
９４（ＣＫ） ３４　 ３６．９６　 １．１８５３±０．２９５２ａ ０．１１４９±０．１７０２ａ ０．１７６７±０．２５１９ａ
７０　 ３２　 ３４．７８　 １．１７１９±０．３０２５ａ ０．１０４０±０．１６８８ａ ０．１５９９±０．２４６５ａ
６０　 ２９　 ３１．５２　 １．１６３７±０．２９９９ａ ０．０９８２±０．１６８１ａ ０．１４９６±０．２４５４ａ
３４　 ２７　 ２９．３５　 １．１６６０±０．３１２３ａ ０．０９７３±０．１７１８ａ ０．１４６４±０．２４９１ａ
　　注：同列不同小写字母表示在０．０５水平下差异显著
Ｎｏｔｅ：Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ　ｓｍａｌ　ｌｅｔｔｅｒｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ　ｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅ　ａｔ　ｔｈｅ　０．０５ｌｅｖｅｌ
２．４　不同发芽率群体遗传相似性分析
使用ＰＯＰＧＥＮＥ分析各个群体间的遗传相似性，
由表３可知，与对照群体遗传相似性最高的群体是发
芽率为６０％的群体，遗传相似系数为０．９８５８；与对照
群体遗传相似性最低的群体是发芽率为３４％的群
体，但其遗传相似系数仍然较高，达到０．９７７９。这个
结果表明各个老化处理群体与对照群体的遗传一致
性较高，这与遗传多样性分析的结果一致。
表３　扁蓿豆群体间的遗传相似性（对角线上）
和遗传距离（对角线下）矩阵
Ｔａｂｌｅ　３　Ｍａｔｒｉｘ　ｏｆ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ（ａｂｏｖｅ　ｄｉａｇｏｎａｌ）
ａｎｄ　ｇｅｎｅｔｉｃ　ｄｉｓｔａｎｃｅ（ｂｅｌｏｗ　ｄｉａｇｏｎａｌ）ｂｅｔｗｅｅｎ　ｔｈｅ
Ｔｒｉｇｏｎｅｌｌａ　ｒｕｔｈｅｎｉｃａ　Ｌ．ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
群体（发芽率）／％
Ｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ
９４（ＣＫ） ７０　 ６０　 ３４
９４（ＣＫ） － ０．９８３９　 ０．９８５８　 ０．９７７９
７０　 ０．０１６２ － ０．９８９３　 ０．９８０１
６０　 ０．０１４３　 ０．０１０７ － ０．９８３４
３４　 ０．０２２３　 ０．０２０１　 ０．０１６７ －
３　讨论
３．１　扁蓿豆种质的ＡＦＬＰ分析
ＡＦＬＰ是由Ｚａｂｅａｕ和Ｖｏｓ提出的一种分子标
记技术，呈共显性和显隐性遗传，它结合了 ＲＡＰＤ
和ＲＦＬＰ的优点，稳定性高，用少量的选择性引物
就能检测到大量位点，并且检测到的位点都或多或
少随机分布在多条染色体上［８］，现已广泛应用于品
种指纹图谱的绘制、种质资源鉴定及遗传多样性的
研究。Ｐａｒａｎ等［９］使用 ＲＡＰＤ和 ＡＦＬＰ鉴定辣椒
（Ｃａｐｓｉｃｕｍ　ａｎｎｕｕｍ）种质资源，结果 显 示 虽 然
ＲＡＰＤ扩增出的多态位点百分比高于 ＡＦＬＰ，但平
均每对ＡＦＬＰ引物扩增出的产物是每个ＲＡＰＤ引
物的６倍还多，ＡＦＬＰ引物在检测多态性方面比
ＲＡＰＤ引物更有效。王栋［１０］使用 ＡＦＬＰ分析大豆
（Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）种质的遗传完整性，结果显示对照群
体与各老化处理群体在等位基因频率上差异均不显
著，但发芽率为８１％和７９％的老化处理群体与对照
群体在有效等位基因数、遗传多样性指数和Ｓｈａｎ－
８２１
第１期 宿宇等：ＡＦＬＰ分析人工老化对扁蓿豆遗传完整性的影响
ｎｏｎ指数上存在显著或极显著差异，其稀有等位基
因数目也显著减少。
使用８对引物对４个扁蓿豆不同老化处理群体
进行ＡＦＬＰ分析，结果显示老化处理群体的多态位
点百分比、遗传多样性指数和Ｓｈａｎｎｏｎ指数均低于
对照群体，且随着发芽率水平的降低而降低，但群体
间的差异均没有达到显著水平。由此表明：经过老
化处理的扁蓿豆群体的遗传多样性水平有一定程度
的下降，但其遗传完整性没有显著变化，证明扁蓿豆
种质的耐贮性较强。
３．２　扁蓿豆种子耐贮性与其生物学特性的关系
影响种子耐贮性的因素较多，外在因素有贮藏
环境的温度、湿度、化学、物理因素等；内在因素有种
子的遗传因子、休眠、成熟度、硬实和含水量等。硬
实是指特殊的种皮和种脐的结构：在种子成熟的过
程中，种皮最外侧形成了一层坚硬的角质层，妨碍水
分渗入种内；角质层内侧的栅栏细胞在种子发育过
程中排列的越来越紧密，形成一层严密的保护层，阻
止了水分进入，使种子不能吸胀萌发。
虽然硬实种子在自然状态下不易萌发，影响田
间出苗率。但在植物育种和种质资源保存上却有积
极意义。王金龙［１１］对大豆种质的研究结果显示：硬
实种子和正常种子在室温条件下储存寿命有显著不
同，正常种子在室温下储存２年左右就丧失了生活
力，而硬实种质储存了４年发芽率仍在９０％以上；
寿惠霞等［１２］用加速老化法鉴定１０个栽培大豆和野
生大豆品种的抗老化性。结果显示在人工老化后，
各野生大豆品种仍保持较高的种子活力，而栽培大
豆的种子活力下降较快。电镜观察发现，野生大豆
的种皮栅状细胞排列紧密，细胞层厚度大大高于栽
培大豆，种皮发芽孔小于栽培大豆，这正是野生大豆
种子抗老化性强的原因所在。因此，可以认为扁蓿
豆种子的硬实特性对其耐贮性有重要影响。
３．３　扁蓿豆种质更新的发芽率标准
正常情况下种子内的基因突变频率很低，只有
１０－５～１０－６，显然这样低的突变率不会对群体的遗
传结构造成很大影响。可是，随着种子的衰老、生活
力的下降，基因突变的频率会大大增加。因此，需要
对库存种子进行定期或不定期的更新繁殖。ＦＡＯ／
ＩＰＧＲＩ推荐更新发芽率标准为降至初始发芽率的
８５％，前提是初始发芽率不低于８５％［１３］。但由于主
效基因突变很大程度上是隐性的，一般是有害的，不
能遗传至下一代，以及在更新繁殖过程中，由于繁种
次数、取样随机误差、样本量大小、种子收获方式等
诸多因素的影响，造成遗传漂变，这要求种质更新标
准可以低一些。印度的更新发芽率标准为７５％；美
国的更新标准是发芽率降到初始发芽率的５０％；我
国国家牧草中心库把６０％作为牧草种质更新的发
芽率标准。不难看出国际上种质更新繁殖虽有标
准，但标准之间差异很大。王小丽［１４，１５］使用ＳＳＲ和
ＩＳＳＲ这２种分子标记研究人工老化处理的扁蓿豆
种子，发现２０％发芽率群体与对照相比遗传完整性
产生显著差异，结合本试验结果，可见扁蓿豆种质更
新发芽率临界值为２０％～３０％。
４　结论
ＡＦＬＰ分析结果表明，人工老化处理后，扁蓿豆
群体的多态位点百分比、有效等位基因数、遗传多样
性指数和Ｓｈａｎｎｏｎ指数均低于对照群体，但降幅没
有达到显著性水平。因此，人工老化处理使扁蓿豆
种质的遗传多样性水平有所下降，但对其遗传完整
性没有造成显著影响，扁蓿豆种质的耐贮性较强。
结合前人的研究结果认为，扁蓿豆种质更新发芽率
临界值为２０％～３０％。
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（责任编辑　李美娟）
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