全 文 ：作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(4): 555−564 http://www.chinacrops.org/zwxb/
ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9 E-mail: xbzw@chinajournal.net.cn

本研究由国家科技支撑计划项目(2006BAD13B10)和农业部财政专项(2130135)资助。
*
通讯作者(Corresponding author): 卢新雄, E-mail: xxlu@caas.net.cn, Tel: 010-62174099
第一作者联系方式: E-mail: beijing_wangdong@126.com
Received(收稿日期): 2009-11-02; Accepted(接受日期): 2010-01-05.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.00555
AFLP标记分析生活力影响大豆中黄 18种质遗传完整性
王 栋 张志娥 陈晓玲 辛 霞 辛萍萍 卢新雄*
中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程, 北京 100081
摘 要: 以中黄 18种子为试验材料, 采用不同时间(0、112、154和 196 d)老化处理, 获得 4个群体 G0-1、G0-2、G0-3
和 G0-4, 其发芽率分别为 98.0%、95.0%、81.0%和 79.0%。将这 4个群体进行 2次田间繁殖, 得到 4个繁殖一代群体
G1-1、G1-2、G1-3和 G1-4及 4个繁殖二代群体 G2-1、G2-2、G2-3和 G2-4。以群体 G0-1为对照, 选用 12对 AFLP引
物组合分析 12 个群体的遗传完整性。结果显示, 所有处理群体与对照群体 G0-1 的等位基因频率 t 检验概率值均为
1.00, 即无显著差异。群体 G2-4 与对照群体 G0-1 的遗传相似系数仍高达 0.9333, 表明发芽率为 79.0%群体的繁殖二
代群体与对照群体的遗传相似性仍然较高。显著性 t 检验结果显示, 与对照群体 G0-1 相比, 群体 G1-1、G2-1、G1-2
和 G2-2的每位点有效等位基因数(Ae)、遗传多样性指数(H)和香农指数(I)差异不显著; 群体 G0-3、G0-4、G1-3、G1-4、
G2-3和 G2-4的上述遗传多样性参数则显著降低。与对照群体 G0-1相比, 群体 G1-1、G2-1、G1-2和 G2-2的稀有等位
基因数无显著变化; 而群体 G0-3、G0-4、G1-3、G1-4、G2-3和 G2-4的稀有等位基因数则大幅下降。以上结果表明, 与
对照群体相比, 由发芽率分别为 98.0%和 95.0%的群体更新的子代群体, 其群体遗传多样性和稀有等位基因数无显著
变化, 而由发芽率分别为 81.0%和 79.0%的群体更新的子代群体, 则显著下降。因此, 生活力下降比繁殖世代对大豆
种质群体的遗传结构影响更大, 建议初始发芽率为 98.0%的大豆种质更新发芽率标准不应低于 81.0%。
关键词: 大豆; 生活力; 繁殖世代; AFLP; 遗传完整性; 种质保存
Analysis of Viability Affecting on Genetic Integrity in Soybean Germ-
plasm Zhonghuang 18 by AFLP Markers
WANG Dong, ZHANG Zhi-E, CHEN Xiao-Ling, XIN Xia, XIN Ping-Ping, and LU Xin-Xiong*
Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences / National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement,
Beijing 100081, China
Abstract: Using low temperature genebank is a main way for conserving crop germplasm resources. However, with the extension
of storage time, the viability of seeds stored in the genebank will inevitably decline. Therefore, preserved seeds need to be regen-
erated periodically. In this study, soybean cultivar Zhonghuang 18 was used as a material and aged for different days (0, 112, 154,
and 196 d) to obtain four populations G0-1, G0-2, G0-3, and G0-4. The germination percentages of the four populations were
98.0%, 95.0%, 81.0%, and 79.0%, respectively. These populations were regenerated twice in the field. The first descendant popu-
lations were marked as G1-1, G1-2, G1-3, and G1-4, and the second were marked as G2-1, G2-2, G2-3, and G2-4, respectively. Popu-
lation G0-1 was taken as the control. The genetic variation between the control and treated populations was detected using AFLP
marker. Sixty individual seedlings derived from each population were detected by 12 AFLP primer combinations. The result
showed that t-test probability values for allele frequencies were 1.00 between the control and treated populations, which indicated
that there was no significant difference in the allele frequencies of the treated population compared with the control. The genetic
similarity coefficient between population G2-4 and G0-1 was 0.9333, which manifested high genetic similarity between these two
populations. The results of t-test showed that there was no significant difference in effective number of alleles per loci (Ae), index
of genetic diversity (H), Shannon’s information index (I) between the control G0-1 and G1-1, G2-1, G1-2, and G2-2. The index
values of Ae, H, and I for the populations of G0-3, G0-4, G1-3, G1-4, G2-3, and G2-4 declined significantly compared with those of
the control G0-1. The number of rare alleles for the populations G1-1, G2-1, G1-2, and G2-2 did not change significantly compared
with that for the control G0-1 while that for populations of G0-3, G0-4, G1-3, G1-4, G2-3, and G2-4 declined greatly. Above results
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showed that the genetic diversity and the number of rare alleles for the descendant population of the populations with 98.0% and
95.0% germination percentages did not change significantly compared with those for the control G0-1, but declined significantly
for the populations with 81.0% and 79.0% germination percentages. Therefore, the viability decline had a greater impact on the
genetic composition of soybean population than the regeneration times. It was recommended that soybean seeds with initial
germination percentage of 98.0% should be regenerated before its germination percentage declined to 81.0%.
Keywords: Soybean; Viability; Regeneration; AFLP; Genetic integrity; Germplasm conservation
目前, 低温种质库是植物种质资源保存的主要
场所。至 2008年, 我国国家种质库长期保存的种质
数量达 35.6 万份 , 居世界第二位(第一位为美国),
其中栽培大豆 2.5万份, 野生大豆 6 000余份。种子
在低温种质库贮藏条件下, 能延长其贮藏寿命, 而
不能阻止其生活力下降。监测表明, 胡萝卜、莴苣
种子在国家种质库–18℃条件下保存 10~12年, 其发
芽率分别下降 14%和 12%[1]。美国国家种质库保存
的 276个物种 42 000份种质, 在 5℃和–18℃条件下
保存 16~81 年后, 平均发芽率由 87.5%降至 58.0%,
其中 3 635份大豆种质保存 36年后, 平均发芽率由
92%降至 21%[2]。邱丽娟等[3]从贮藏条件为 4~10℃
的中期库中取出 68 份大豆品种, 进行田间种植, 未
出苗品种 36 份, 占 52.9%。另外, 由于生活力监测
及对外供种也使得库存种质的保存样品不断减少。
因此, 必须对生活力和保存数量降至更新临界值的
库存种质进行繁殖更新 [4], 而繁殖更新的核心问题
在于维持种质的遗传完整性[5]。
种质繁殖更新过程中, 影响种质遗传完整性的
因素包括生活力下降、繁殖世代数、繁殖群体大小、
繁殖地点、选择压力变化、竞争和植株密度及授粉
和收获方式等[6-14], 而生活力下降尤被关注, 并从染
色体畸变、点突变、叶绿素突变和 DNA标记等方面
进行了研究。Murata等[15]对人工老化的大麦种子及
其子代进行根尖细胞染色体观察, 发现其染色体畸
变并不能传递给下一代。Dourado等[16]对大麦、蚕豆
老化种子的研究表明, 随着种子生活力的降低, 点
突变也显著增加。Roberts[17]利用 X-射线诱导大麦叶
绿素缺陷突变, 并对突变频率进行估测。结果表明
用 10 000伦琴的X-射线处理新鲜种子所诱导的叶绿
素突变量与导致种子生活力丧失 50%的老化处理所
诱导的突变量相当。张晗等[18]利用 SSR标记对不同
发芽率水平的玉米种质群体进行遗传分析表明, 同
一玉米品种的老化处理群体内的遗传多样性低于对
照群体内的遗传多样性, 其群体的遗传完整性发生
了改变。
对繁殖世代数的影响也有较多的研究报道。Tao
等[19]指出, 属于异质群体的 2 个地方硬粒小麦品种
经过 8 个世代繁殖更新后, 由原来的硬粒小麦占主
导成分的地方品种变成了由普通小麦占主导地位的
品种。Soengas等[20]利用 25对 SSR引物对经过两次
繁殖更新的 3份甘蓝地方品种进行遗传完整性检测,
发现其群体结构及每位点等位基因频率与原始群体
相比差异显著。夏冰等[21]利用 SSR标记分析了30份
大豆种质, 结果未检测到 25份种质不同繁殖年份之
间等位基因的差异, 而 5 份种质的等位基因发生了
变化。章元明等[22]指出大豆地方品种种质群体连续
繁殖或者持续混杂将增加稀有基因丢失的可能, 因
此减少繁殖次数、避免混杂是维持大豆种质遗传完
整性的重要措施。
AFLP分子标记技术具有多态性丰富、结果可靠
稳定、重复性好、所需 DNA量少, 而且可以在不知
道基因组序列的情况下进行研究等优点[23]。Maghan
等[24]利用 AFLP 技术对大豆的品种多样性、孟德尔
遗传情况及近等基因系进行研究。胡小荣等[25]也将
AFLP 技术运用于小麦种子超干保存遗传完整性研
究。大豆是自花授粉作物, 本研究选择育成的纯系
品种中黄 18 为材料, 利用 AFLP 分子标记技术, 分
析评价了生活力下降及繁殖世代对大豆种质遗传完
整性的影响, 以期为制定科学的大豆种质更新策略
提供理论和实践依据。
1 材料与方法
1.1 试验材料
大豆品种中黄 18, 种子由中国农业科学院作物
科学研究所提供。2001 年大田收获, 种子含水量为
8%~9%。2002年 2月将种子放于铝箔袋内密封包装
后, 在(40±2)℃下进行不同时间的人工老化处理(0、
112、154 和 196 d), 得到 4 个不同生活力水平原始
材料(G0)种子群体(G0-1、G0-2、G0-3和 G0-4), 以未
经人工老化处理的种子(G0-1)为对照(CK)。2003年将
上述 4 个种子群体分别在田间种植, 获得 4 个繁殖
一代(G1)种子群体(G1-1、G1-2、G1-3和 G1-4), 2006
年将4个繁殖一代种子群体再次进行田间种植, 获得
4 个繁殖二代 (G2)种子群体 (G2-1、G2-2、G2-3 和
G2-4)(表 1)。繁殖地点为石家庄市河北省农林科学院
第 4期 王 栋等: AFLP标记分析生活力影响大豆中黄 18种质遗传完整性 557


粮油作物研究所堤上试验站。采用随机区组设计 ,
以群体为处理单位, 每处理设 3 个重复, 每个重复播
种的种子量为 200粒, 并按照《农作物种质资源整理
技术规程》[26]进行繁殖更新, 采取混合法收获种子。
所有收获的种子经晾干后在 4℃条件下保存, 以备试
验用。
1.2 室内发芽率测定
参照《国际种子检验规程》中的发芽条件进行
发芽试验[27]。采用两层滤纸的发芽床, 温度为 25 , ℃
重复 2次。逐日查发芽数, 第 3天统计发芽势, 第 4
天统计发芽率。
1.3 DNA提取与检测
从每个处理群体材料中随机取出 200 粒种子种
于蛭石中并在培养箱内进行变温培养。每天光照 14
h, 温度为 30 ; ℃ 黑暗 10 h, 温度为 20 , ℃ 相对湿度
为 80%。幼苗长至 3 叶期时, 分别从不同处理群体
中随机取 60株, 采用 SDS法, 以单株提取 DNA, 用
1×TE稀释成相同的浓度(20 ng μL–1), 4℃下备用。测
定 DNA 浓度, 并用 0.8% Agarose 胶检测 DNA 的
质量。
1.4 AFLP分析
AFLP 实验程序参照田清震等[28]的方法。选取
田清震等[29]应用于大豆AFLP研究的 12对引物组合,
即 E-CGA/M-ACT、E-CGA/M-ATT、E-GGA/M-ATT、
E-ACT/M-CGA、E-CGA/M-CGG、E-GGC/M-CGG、
E-CGA/M-CTC、E-ACT/M-GGA、E-AGG/M-GGA、
E-CGA/M-GGA、E-GGC/M-GGA、E-TGA/M-GGA
进行检测。EcoR I、Mse I 两种限制性内切酶、
T4-DNA连接酶、Taq DNA聚合酶及 pBR322 DNA/
Msp I DNA ladder marker均购自纽英伦生物技术(北
京)有限公司。EcoR I、Mse I接头和引物均由北京三
博远志生物有限公司合成(表 2)。
1.4.1 酶切 选取 EcoR I/Mse I酶切组合。酶切
反应体系为 20 μL, 含 100 ng μL–1 DNA 4.0 μL, 20 U
μL–1 EcoR I 0.5 μL, 10 U μL–1 Mse I 0.5 μL, 2.0 μL
10×NE buffer (EcoR I), 0.2 μL 100×BSA, 12.8 μL
ddH2O。混匀后在 37℃水浴中酶切 3 h, 取出后在
65℃水浴中处理 15 min后置于冰上。
1.4.2 连接 在每个酶切完成的样品中加入 10.0
μL反应液(50 pmol μL–1 EcoR I 1.0 μL接头, 50 pmol
μL–1 Mse I接头 1.0 μL, 400 U μL–1 T4-DNA连接酶
0.25 μL, 1.0 μL T4-buffer, 6.75 μL ddH2O)。将上述混
合液在 16℃下至少连接 3 h, 然后于–20℃保存。
1.4.3 预扩增 取 2.0 μL连接完成的 DNA样品,
加 50 ng μL–1 M00 2.0 μL, 50 ng μL–1 E00 2.0 μL, 2.0
μL 10×PCR buffer, 2.5 mmol L–1 dNTP 1.6 μL, 2.5 U
μL–1 Taq 酶 0.24 μL, 10.16 μL ddH2O。混匀后在
PTC-100型(MJ Research) PCR仪上进行扩增。程序
为 95 1 min; 95 30 s, 56 30 s, 72 1 min, ℃ ℃ ℃ ℃ 循
环 34 次, 最后 72℃再延伸 10 min。预扩增完成后,
用 ddH2O稀释 20倍, –20℃保存。
1.4.4 选择性扩增 取 5.0 μL稀释的预扩增产物
混合液, 加 50 ng μL–1 EcoR I 2.0 μL, 50 ng μL–1 Mse I
2.0 μL, 2.0 μL 10×buffer, 2.5 mmol L–1 dNTP 1.8 μL,
2.5 U μL–1 Taq酶 0.4 μL, 7.8 μL ddH2O。混匀后在
PTC-100型(MJ Research) PCR仪上进行扩增。程序
为 95 2 min, ℃ 而后按照 95 30 s, 65 30 s℃ ℃ (每个

表 1 供试大豆种质群体
Table 1 Soybean germplasm population used in the study
世代
Generation
群体
Population
老化时间
Aging duration (d)
发芽率
Germination percentage (％)
繁殖背景
Reproduction background
原始材料 G0 G0-1 0 98.0
G0-2 112 95.0
G0-3 154 81.0
G0-4 196 79.0
繁殖一代 G1 G1-1 0 88.0 由 G0-1繁殖 Reproduced by G0-1
G1-2 0 85.3 由 G0-2繁殖 Reproduced by G0-2
G1-3 0 88.0 由 G0-3繁殖 Reproduced by G0-3
G1-4 0 81.3 由 G0-4繁殖 Reproduced by G0-4
繁殖二代 G2 G2-1 0 97.0 由 G1-1繁殖 Reproduced by G1-1
G2-2 0 94.0 由 G1-2繁殖 Reproduced by G1-2
G2-3 0 96.0 由 G1-3繁殖 Reproduced by G1-3
G2-4 0 95.3 由 G1-4繁殖 Reproduced by G1-4
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表 2 DNA接头和 AFLP引物的核苷酸序列
Table 2 Sequence of DN A adapters and AFLP primers
DNA接头和 AFLP引物
DNA adapters and AFLP primers
核苷酸序列
Nucleotide sequences
用途
Application
EcoR I接头 5′-CTCGTAGACTGCGTACC-3′ 接头连接 Adapters ligation
3′-CTGACGCATGGTTAA-5′
Mse I接头 5′-GACGATGAGTCCTGAG-3′ 接头连接 Adapters ligation
3′-TACTCAGGACTCAT-5′
EcoR I引物
E00 5′-GACTGCGTACCAATTC-3′ 预扩增 Pre-amplification
E-CGA 5′-GACTGCGTACCAATTC-CGA-3′ 扩增 Amplification
E-GGA 5′-GACTGCGTACCAATTC-GGA-3′ 扩增 Amplification
E-ACT 5′-GACTGCGTACCAATTC-ACT-3′ 扩增 Amplification
E-GGC 5′-GACTGCGTACCAATTC-GGC-3′ 扩增 Amplification
E-AGG 5′-GACTGCGTACCAATTC-AGG-3′ 扩增 Amplification
E-TGA 5′-GACTGCGTACCAATTC-TGA-3′ 扩增 Amplification
Mse I引物
M00 5′-GATGAGTCCTGAGTAA-3′ 预扩增 Pre-amplification
M-ACT 5′-GATGAGTCCTGAGTAA-ACT-3′ 扩增 Amplification
M-ATT 5′-GATGAGTCCTGAGTAA-ATT-3′ 扩增 Amplification
M-CGG 5′-GATGAGTCCTGAGTAA-CGG-3′ 扩增 Amplification
M-CGA 5′-GATGAGTCCTGAGTAA-CGA-3′ 扩增 Amplification
M-CTC 5′-GATGAGTCCTGAGTAA-CTC-3′ 扩增 Amplification
M-GGA 5′-GATGAGTCCTGAGTAA-GGA-3′ 扩增 Amplification

循环降低 0.7 ), 72 1 min, ℃ ℃ 循环 12 次, 再按照
95 30 s, 56 30 s, 72 1 min, ℃ ℃ ℃ 循环 30次, 最后
72℃延伸 10 min。
1.4.5 结果检测 取 PCR 产物 4.0 μL 加 2.0 μL
Loading buffer, 95℃变性 5 min, 置冰上冷却, 在 85
W下用 6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳 1 h, 分离扩增产
物, 银染检测[30]。
1.5 数据统计分析
统计扩增条带, 在同一迁移率上有带记为 1, 无
带记为 0, 缺失记为 9, 并参照 pBR322 DNA/Msp I
DNA Ladder Marker 估计片段大小。使用 Power-
marker Ver. 3.25计算出 12个大豆种质群体每个位点
的等位基因频率; 用 POPGENE Ver. 1.31[31]完成供
试群体的多态位点数(K)、多态位点百分数(P)、每位
点有效等位基因数(Ae)、遗传多样性指数(H)和香农
指数(I)等遗传多样性参数的计算; 利用 SAS V8.2对
各处理群体与对照群体的所有位点等位基因频率及
所有位点相应遗传多样性参数进行成对法 t 检验;
用 NTSYS-pc 2.1软件[32]根据群体间的 Nei’s遗传相
似系数进行非加权类平均法(UPGMA)聚类分析, 在
Microsoft Excel 中完成稀有等位基因数比较及其他
统计分析。
2 结果与分析
2.1 群体遗传结构分析
利用 12 对 AFLP 引物组合对 12 个供试大豆种
质群体进行检测, 共得到 204条清晰可辨的条带, 每
个引物组合的条带数为 10~27个, 平均为 17个。引
物组合 E-GGC/M-GGA扩增对照群体 G0-1的 AFLP
电泳图谱见图 1。
从表 3可以看出各处理群体与对照群体 G0-1间



图 1 引物组合 E-GGC/M-GGA扩增群体 G0-1的 AFLP电泳图谱
Fig. 1 Electrophoretic patterns of AFLP with primer combi-
nations E-GGC/M-GGA in population G0-1
第 4期 王 栋等: AFLP标记分析生活力影响大豆中黄 18种质遗传完整性 559


表 3 供试大豆种质群体等位基因频率 t测验
Table 3 t-test for allele frequency of the tested soybean
germplasm population
比较群体
Compared population
t值
t-value
概率值
P>t
G0-1 vs G0-2 0 1.0000
G0-1 vs G0-3 0 1.0000
G0-1 vs G0-4 0 1.0000
G0-1 vs G1-1 0 1.0000
G0-1 vs G1-2 0 1.0000
G0-1 vs G1-3 0 1.0000
G0-1 vs G1-4 0 1.0000
G0-1 vs G2-1 0 1.0000
G0-1 vs G2-2 0 1.0000
G0-1 vs G2-3 0 1.0000
G0-1 vs G2-4 0 1.0000

的等位基因频率 t检验概率值 P均为 1.0000, 即无显
著差异。由此可见, 生活力下降和繁殖世代对大豆
种质群体的等位基因频率分布影响不大。
从表4可以看出, 原始材料(G0)中分别经过 112、
154和 196 d老化处理的群体 G0-2、G0-3和 G0-4的
各项遗传多样性参数均低于对照群体 G0-1, 而且老
化时间愈长, 生活力水平愈低, 其各项遗传多样性
参数愈低。群体 G0-2、G0-3、G0-4 的繁殖子代群体
G1-2、G1-3、G1-4、G2-2、G2-3 和 G2-4 各项遗传多
样性参数均低于对照群体 G0-1。t检验结果显示, 更
新发芽率为 81.0%和 79.0%的群体 G0-3 及 G0-4, 其
Ae、H 和 I 等 3 个遗传多样性参数与对照群体 G0-1
相比差异显著或极显著。由群体 G0-1、G0-2衍生的
群体 G1-1、G2-1、G1-2、G2-1, 其各项遗传多样性参
数与对照群体 G0-1 相比无显著差异, 表明发芽率为
98.0%和 95.0%的大豆种质材料经过两次繁殖后, 其
群体内的遗传多样性与对照群体相比得到了较好的
保持。群体 G1-3、G1-4、G2-3、G2-4 的 Ae、H 和 I
等 3个指标与对照群体G0-1相比差异显著或极显著,
表明发芽率降至 81.0%和 79.0%的大豆种质繁殖的
子代群体, 其群体遗传结构与对照群体相比变化较
大。以上结果同时表明生活力水平下降比繁殖世代
对大豆种质的群体遗传结构影响更大。
2.2 遗传相似性分析
从表 5可以看出与对照群体 G0-1遗传相似系数
最高的是群体 G1-1, 为 0.9967, 其次是群体 G2-1,
为 0.9935; 与对照群体 G0-1遗传相似系数最低的是
群体 G2-4, 为 0.9333。从图 2 可以看出, 虽然群体
G2-4与对照群体 G0-1的遗传相似系数最低, 但是其
绝对值仍然较高, 与对照群体 G0-1在 0.9547处聚成
一簇, 表明发芽率降至 79.0%的群体 G0-4 的繁殖二
代群体 G2-4 与对照群体仍具有较高的遗传相似性,
这与等位基因频率的分析相一致。群体 G1-1与对照
群体 G0-1 的遗传相似性最大, 遗传距离也就最近,
其次是群体 G2-1。这是由于群体 G1-1是由对照群体
G0-1繁殖而来, 群体G2-1又是由群体G1-1繁殖更新

表 4 供试大豆种质群体的遗传结构
Table 4 Genetic structure of the tested soybean germplasm population
群体
Population
多态位点数
K
多态位点百分数
P (%)
每位点有效等位基因数
Ae
遗传多样性指数
H
香农指数
I
G0-1 187 91.67 1.6343±0.3018 0.3622±0.1410 0.5310±0.1882
G0-2 180 88.24 1.6029±0.3067 0.3504±0.1470 0.5185±0.1983
G0-3 169 82.84 1.5701±0.3105* 0.3258±0.1513** 0.4802±0.2070**
G0-4 166 81.37 1.5513±0.3276** 0.3334±0.1627** 0.4652±0.2240**
G1-1 187 91.67 1.6145±0.3053 0.3543±0.1430 0.5227±0.1906
G1-2 178 87.25 1.6003±0.3076 0.3456±0.1475 0.5111±0.2000
G1-3 169 82.84 1.5683±0.3158* 0.3211±0.1543** 0.4789±0.2112**
G1-4 165 80.88 1.5496±0.3370** 0.2975±0.1670** 0.4619±0.2297**
G2-1 186 91.18 1.6122±0.3031 0.3530±0.1437 0.5186±0.1933
G2-2 176 86.27 1.5951±0.3014 0.3440±0.1473 0.5083±0.2020
G2-3 167 81.86 1.5847±0.3186* 0.3158±0.1604** 0.4657±0.2230**
G2-4 164 80.39 1.5413±0.3355** 0.2909±0.1690** 0.4589±0.2359**
*: 表示在 0.05的水平上显著；**: 表示在 0.01的水平上显著。
K: No. of polymorphic loci; P: percentage of polymorphic loci; Ae: effective No. of alleles per loci; H: index of genetic diversity; I:
Shannon’s information index. *: significant at the 0.05 probability level; **: significant at the 0.01 probability level, compared with population
G0-1.
560 作 物 学 报 第 36卷

表 5 供试大豆种质群体间遗传相似系数
Table 5 Genetic similarity coefficient among the tested soybean germplasm populations
群体
Population
G0-1 G0-2 G0-3 G0-4 G1-1 G1-2 G1-3 G1-4 G2-1 G2-2 G2-3 G2-4
G0-1 1.0000
G0-2 0.9834 1.0000
G0-3 0.9789 0.9680 1.0000
G0-4 0.9720 0.9633 0.9677 1.0000
G1-1 0.9967 0.9749 0.9730 0.9645 1.0000
G1-2 0.9680 0.9836 0.9646 0.9618 0.9694 1.0000
G1-3 0.9592 0.9675 0.9803 0.9659 0.9694 0.9694 1.0000
G1-4 0.9441 0.9530 0.9512 0.9713 0.9524 0.9553 0.9598 1.0000
G2-1 0.9935 0.9750 0.9702 0.9614 0.9917 0.9724 0.9720 0.9533 1.0000
G2-2 0.9531 0.9773 0.9452 0.9506 0.9449 0.9851 0.9553 0.9476 0.9555 1.0000
G2-3 0.9492 0.9538 0.9755 0.9559 0.9498 0.9578 0.9812 0.9521 0.9584 0.9651 1.0000
G2-4 0.9333 0.9440 0.9465 0.9651 0.9388 0.9500 0.9559 0.9761 0.9431 0.9669 0.9673 1.0000



图 2 供试大豆种质群体 UPGMA聚类分析
Fig. 2 UPGMA dendrogram of the tested soybean germplasm
populations

而来, 表明初始发芽率为 98.0%的大豆种质材料经
过两次繁殖后, 与对照群体仍具有很高的遗传相似
性。原始材料(G0)中, 更新发芽率降至 95.0%、81.0%
和 79.0%的群体 G0-2、G0-3及 G0-4与对照群体 G0-1
的遗传相似性相对较低, 表明生活力下降对大豆种
质材料遗传相似性的影响较大。由群体 G0-2、G0-3
和 G0-4 繁殖一代群体 G1-2、G1-3 和 G1-4 与对照群
体 G0-1 的遗传相似性比相应的亲代群体要低, 由以
上群体再次繁殖二代群体 G2-2、G2-3和 G2-4与对照
群体 G0-1 的遗传相似性与其亲代相比更低, 这表明
发芽率分别为 95.0%、81.0%和 79.0%的群体繁殖的
子代群体与原始群体的遗传相似性差别逐渐加大 ,
而且其遗传相似性随着繁殖代数的增加而降低。
2.3 稀有等位基因(P<0.05)变化分析
群体内的遗传多样性差异可能是由于稀有等位
基因(P<0.05)结合或综合到基因型背景中。稀有等位
基因由于自身所占的比重较小, 在受到种子老化、
繁殖世代数、繁殖群体大小等因素的影响时容易发
生丢失或增加 , 从而导致群体内遗传多样性的变
化。因此, 在研究种质遗传完整性时应对群体内稀
有等位基因的变化加以分析。从表6可以看出, 原始
材料(G0)中发芽率降至 81.0%和 79.0%的群体 G0-3
及G0-4的稀有等位基因数要明显低于对照群体G0-1,
与对照群体 G0-1 共有的稀有等位基因数, 随着生活
力水平的降低而减少, 稀有等位基因的变化数(丢失
数/增加数)也有类似的趋势, 表明生活力下降可以
显著地影响大豆种质群体内的稀有等位基因数目 ,
且主要是减少其数目。由群体 G0-1、G0-2繁殖的群
体G1-1、G1-2、G2-1和G2-2与对照群体G0-1相比, 以
上 3个指标变化较小。表明发芽率为 98.0%和 95.0%
的大豆种质材料经过两次繁殖后, 其稀有等位基因
得到了较好的保持。由群体 G0-3、G0-4繁殖的群体
G1-3、G1-4、G2-3和 G2-4与对照群体 G0-1相比稀有
等位基因数明显减少; 与对照群体共有的稀有等位
基因数的变化趋势一致; 稀有等位基因变化数(丢失
数/增加数)却显著增加 , 这表明更新发芽率分别为
81.0%和 79.0%的群体的子代群体与对照群体相比,
其稀有等位基因数变化较大。以上分析还表明生活
力下降比繁殖世代对稀有等位基因变化的影响
更大。

第 4期 王 栋等: AFLP标记分析生活力影响大豆中黄 18种质遗传完整性 561


表 6 供试大豆种质群体稀有等位基因数目变化
Table 6 Change of rare alleles number of the tested soybean germplasm populations
群体
Population
稀有等位基因数
Rare alleles number
处理群体与对照群体共有的稀有等位基因数
No. of common rare alleles between control group
and treatment group
稀有等位基因变化数(丢失数/增加数)
Change of rare alleles number (lose or increase)
G0-1 57 57 0/0
G0-2 51 51 –6/0
G0-3 45 41 –14/+2
G0-4 38 35 –22/+3
G1-1 56 56 –1/0
G1-2 51 51 –6/0
G1-3 45 42 –15/+3
G1-4 37 33 –24/+4
G2-1 55 55 –2/0
G2-2 52 52 –5/0
G2-3 46 43 –14/+3
G2-4 36 32 –25/+4

3 讨论
Stoyanova[33]通过对农艺性状一致的小麦品种
(Sadovol)醇溶蛋白谱带的分析, 发现该品种群体含
有 A、B、C、D四种类型的蛋白谱带。将种子老化
处理使发芽率下降到 30%以下时, 子代群体中仅极
个别具 D 型谱带和具大部分 B 型谱带植株存活, 具
C型和 A型谱带的植株皆消失。Parzies等[34]研究了
保存 10、40 和 72 年一直生产应用的两份大麦地方
品种 , 发现随保存时间的延长 , 发芽率下降 , 等位
基因酶的平均基因多样性、每一位点的等位基因和
平均多态位点显著下降, 品种间的遗传差异明显增
加。Roos[35]将 8 个不同种子壳色和荚果颜色的菜豆
品种混合为一个群体, 经过 15次种子老化和更新周
期后, 其中 6个品种从这一群体中丧失。Börner等[36]
采用 9对 SSR引物对 8份 Gatersleben基因库中保存
并更新达 24次的小麦种质进行遗传完整性分析, 虽
然没有发现外来花粉的污染和人为混杂的现象, 但
是在材料 TRI 4599中发现了遗传漂变。上述研究表
明, 生活力下降及繁殖世代对种质的遗传完整性变
化产生了影响。本研究结果显示各处理群体的等位
基因频率与对照群体相比差别不大, 表明生活力下
降和繁殖世代对中黄18 的等位基因频率分布影响并
不显著。这可能与大豆属于典型自花授粉作物的遗
传结构特点有关, 且供试材料中黄18是育成品种, 基
因型纯合, 其个体之间遗传基础基本相同。在繁殖
更新过程中 , 大豆受到外来花粉污染的概率也极
小。因此, 各处理群体与对照群体相比, 等位基因频
率分布得到了较好的维持。经过进一步分析发现 ,
更新发芽率降至 81.0%和 79.0%的群体及其繁殖子
代群体与对照群体相比, 多态位点数、多态位点百
分数、每位点有效等位基因数、遗传多样性指数和
香农指数均显著下降, 而且生活力水平越低, 各项
遗传多样性参数下降的程度越大, 这似乎与等位基
因频率分析不符, 但通过对稀有等位基因变化的研
究找到了问题的关键。
Marshall 和 Brown[37]将群体内的等位基因分为
两大类 , 即普遍的等位基因(P>0.05)和稀有的等位
基因(P<0.05)。根据等位基因的频率和分布情况, 可
细分为 4类: (1) 普遍且广泛分布的等位基因; (2) 稀
有但广泛分布的等位基因; (3) 局部常见的等位基因;
(4) 稀有而且是局部分布的等位基因。稀有等位基因
(P<0.05)在群体内占有极小的份额 , 但是却大大增
加了群体内的遗传多样性。稀有等位基因易受到生
活力下降、繁殖群体大小、种子收获方式、繁殖世
代等因素影响而丢失[6,38]。稀有等位基因的变化可以
较小地改变群体内的基因型频率和等位基因频率 ,
却较大地改变群体内的遗传多样性。本研究更新发
芽率降至 81.0%和 79.0%的群体因受到人工老化处
理的影响, 稀有等位基因丢失, 因此群体内的遗传
多样性下降。在随后的更新过程中, 丢失的稀有等
位基因无法传递给其子代群体, 因而其子代群体内
的遗传多样性与对照群体相比也明显下降。中黄 18
为育成品种, 其稀有等位基因应属第(2)类, 即稀有
但广泛分布 , 受到生活力下降的影响尚且发生丢
562 作 物 学 报 第 36卷

失。由此推测, 对于那些大豆地方品种, 其拥有的稀
有且局部分布的等位基因, 受生活力下降而丢失的
几率会更大。
Chwedorzewska 等[39-40]利用 AFLP 标记和微卫
星标记分析4份黑麦材料的结果显示, 发芽率水平比繁
殖世代数对基因组 DNA 的影响大。Zurek[41]对牛尾
草的研究结果也表明, 发芽率下降是影响种质遗传
完整性的主要因素, 减少繁殖次数对于维持种质遗
传完整性具有重要的作用。本研究从群体的遗传结
构、遗传相似性及稀有等位基因变化等方面分析也
表明, 生活力下降比繁殖世代对大豆种质遗传完整
性的影响更大。因此, 大豆种质繁殖更新时应将种
子生活力水平作为首要考虑因素。目前, 国内外种
质库繁殖更新的发芽率标准通常在 65%~85%之
间[4]。IBPGR推荐的更新标准为发芽率下降 5%~10%,
按该标准执行可能会增加更新频率, 而频繁的更新
不仅增加繁殖费用, 还增加诸如遗传漂变、种子混
杂及遗传选择的可能性[15]。因此, 确定适宜的更新
发芽率标准对于科学的种质保存至关重要。IPGRI
推荐更新发芽率标准为降至初始发芽率的 85%, 但
前提是初始发芽率不低于 85%[42]。李灵芝等[43]认为
为避免大豆种质的遗传漂移, 并考虑到繁殖费用等
因素, 建议种质库大豆种质更新发芽率标准为 80%。
本研究表明发芽率为 98.0%和 95.0%的群体与其子
代群体相比, 每位点有效等位基因数、遗传多样性
指数、香农指数和稀有等位基因数没有显著性差异,
遗传相似性较高 ; 而更新发芽率降至 81.0%和
79.0%(即为初始发芽率 98.0%的 82.7%和 80.6%)的
群体G0-3和 G0-4及其子代群体与对照群体相比, 每
位点有效等位基因数、遗传多样性指数、香农指数
显著降低, 稀有等位基因数目显著减少, 且遗传相
似性相对较低。这证明 IPGRI 推荐的标准对指导种
质库更新工作具有重要作用。中黄 18异质度较低, 因
此对于那些异质度较高的大豆地方品种, 更应该严
格执行此更新发芽率标准。建议初始发芽率为 98.0%
的大豆种质的更新发芽率标准不应低于 81.0%。在
条件允许的情况下, 应按照 IPGRI 推荐更新发芽率
标准执行。
大豆种质在更新过程中, 还应考虑繁殖群体大
小和种子收获方式对其遗传完整性的影响。适宜的
繁殖群体大小可以有效地保持大豆种质遗传完整性,
若过大则加大繁殖更新的成本, 过小则易丧失稀有
等位基因。据 Sackville Hamilton等[44]推断, 在 100
个单株的更新群体中, 频率为 0.05 的基因的丢失概
率仅为 0.000 35, 因此他们推荐繁殖群体量为 100个
单株。Schoen 等[45]研究指出, 只有当更新群体等于
或大于 75 个单株时, 有害突变的累积作用才可以忽
略; 反之, 经过 25~50个连续更新周期后, 有害突变
数目显著增加。因此, 建议大豆种质的繁殖群体量
不应少于 75株。种质更新的田间收获方式主要有两
种, 即混合法和等量法[45-46]。混合法指混合收获全
部植株种子, 随机取样形成下一轮保存样本, 具有
田间操作容易的优点; 等量法指根据保存样本所需
种子量多少 , 从每一植株上收获相同数量的种子 ,
形成下一轮保存样本, 但费时、费工。Schoen 等[45]
通过对不同繁殖群体(25、50、75和 100个单株) 50
个连续繁殖周期的模拟计算, 认为混合法收获可降
低种质资源保存过程中基因突变的累积效应。异花
授粉作物胡萝卜种质资源更新的田间试验显示, 等
量法对更新种质资源原始基因频率的影响要小于混
合法[46]。对于大豆育成品种可以采取混合法, 这样
做省时省力, 又可以较好地保持遗传完整性; 对于
大豆地方品种则最好采取等量法, 因为等量法可较
好地降低由于遗传漂变而造成遗传完整性丧失的风
险。同时种子收获时还要注意防止品种间的人为混
杂, 以保证品种的纯度。综上所述, 在大豆种质更新
过程中应综合考虑生活力水平、繁殖世代数、繁殖
群体大小及收获方式等多方面因素, 采取相应的措
施以最大程度维持其种质遗传完整性。
4 结论
生活力下降及繁殖世代对大豆种质群体的等位
基因频率分布没有产生显著影响, 更新发芽率降至
79.0%的群体其繁殖子代群体与对照群体的遗传相
似系数仍达到 0.9333。发芽率为 98.0%和 95.0%的群
体与其繁殖子代群体相比, 群体的遗传结构没有显
著变化; 发芽率降至 81.0%和 79.0%的群体及其子代
群体的遗传结构与对照群体相比差异显著。生活力
下降比繁殖世代对大豆种质群体的遗传结构影响更
大, 建议初始发芽率为 98.0%的大豆种质其更新发
芽率标准不应低于 81.0%。
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