全 文 ：麦类作物学报　2010 , 30(2):198-202
Journa l of T riticeae Crops
节节麦的一种 y-型HMW-GS的鉴定 、克隆及系统进化分析
①
常广阳 ,申旭芳 ,苏亚蕊 ,刘述忠 ,张大乐 ,李锁平
(河南大学农业生物技术研究所, 河南开封 475001)
摘　要:为了克隆节节麦中的 HM W-GS 基因 ,利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析了
节节麦的 HMW-GS , 发现 1 种编码序列未知的 y-型亚基 ,即 Dy8.1 t 亚基。 通过对目的片段的 AS-PC R扩增 、克
隆 、测序和氨基酸序列推导 , 发现这种未知序列具有典型 HMW-GS 的序列结构特征。通过与已知亚基序列比较发
现 , Dy8.1 t 与 Dy10 t 、Dy10.4 t 、Dy10.5t 和 Dy12 t 在 N-端序列有一个氨基酸差别(R-G)。与已知氨基酸序列的
HMW-GS 多序列比对和系统进化关系分析 ,证实 Dy8.1 t 亚基是 D基因组编码的高分子量谷蛋白 y-型亚基家族的
新成员。
关键词:节节麦;高分子量谷蛋白亚基;分子克隆
中图分类号:S512.1;S326　　　　文献标识码:A　　　　文章编号:1009-1041(2010)02-0198-05
Identif ication , Cloning and Phylogenetic Analysis of
a y-Type HMW-GS in Triticum tauschii
CHANG Guang-yang , SHEN Xu-fang , SU Ya-rui , LIU Shu-zhong , ZHANG Da-le , LI Suo-ping
(Research Inst itute of Agricu ltural Biotechnology , Henan University , Kai feng , Henan 475001 , China)
Abstract:Trit icum tauschii(2n=2x =14 , DD), as the D genome dono r of common wheat , contains a w ide
range of high molecular w eight g lutenin subunit (HMW-GS)alleles , and has more genetic variation than
the common wheat g enome.We used sodium dodecy l sulfate-poly acrylamide gel elect ropho re sis (SDS-
PAGE)to analy ze the HMW-GS of Aegi lops tauschi i , and one new y-type subunit , designated Dy8.1 t was
found.T hrough AS-PCR amplification and DNA sequencing , Dy8.1 t was cloned , w ith a typical sequence
of HMW-GS.Compared wi th the known subuni ts Dy10 t , Dy10.4t , Dy10.5 t and Dy12 t , Dy8.1t had an a-
mino acid dif ference(R-G)in the N-terminal sequence.Based on multiple sequence alignment and phylog e-
netic relationship analy sis , Dy8.1 t as a new member of HMW glutenin y-type subunits w ere confirmed.
Key words:Trit icum tauschi i;HWM-GS;Molecular cloning ;Phy logenetic relationships
　　节节麦(Tri t icum tauschii , DD , 2n=2x =14)
是普通小麦 D染色体组的二倍体供体物种 ,是普通
小麦的祖先种之一。节节麦的高分子量谷蛋白亚基
(HMW-GS)由位于 1号染色体长臂上的 Glu-1D t位
点的基因控制 ,分别编码 x 亚基和 y 亚基 ,它们与小
麦的加工品质紧密相关[ 1] 。前人研究发现 ,节节麦
的 HMW-GS 的变异类型丰富 ,且大多为普通小麦
中尚未发现的新类型[ 2-7] 。Mackie等[ 3] 用三对 PCR
引物对小麦近缘种粗山羊草的编码区和上游进行扩
增 ,最终获得一个长为 2 809 bp的编码高分子量谷
蛋白亚基 Dyl2 t 基因 ,与六倍体小麦 Dy10 、Dy12 亚
基基因结构比较显示其与 Dy10的相似程度要高于
Dy12。Gianibelli和 Solomon[ 8] 对其中一个分子量
较小的 y 型亚基进一步分析后 ,将其命名为 12.4t ,
并用设计的 y-型特异引物扩增 、克隆了该亚基基因
序列 ,发现该基因较已知的 Dy12 和 Dy10 分别小
600和 560 bp ,并指出其原因是中部重复区段的缺
失 。对节节麦 HMW-GS 进行编码基因的测序和氨
基酸序列的推导 ,有助于了解节节麦与普通小麦种
中的亚基在基因序列水平上的差异 ,挖掘可应用于
普通小麦品质改良的新基因资源 ,有重要的意义和
应用前景。但目前这个领域的研究报道很少。本研
①收稿日期:2009-11-08　　　修回日期:2010-01-24
基金项目:国家自然科学基金项目(30971774)。
作者简介:常广阳(1981-),男 ,硕士 ,主要从事植物遗传学研究 , E-mail:s teven19812008@126.com
通讯作者:李锁平(1962-),男 ,教授 ,博士生导师 ,主要从事植物遗传学研究 , E-mai l:lis p369@163.com
究利用十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-
PAGE)对节节麦的 HMW-GS 进行分离和鉴定 ,发
现 1种新的 y-型亚基 ,通过等位基因特异 PCR(AS-
PCR)对其编码基因进行分子克隆 、序列分析 ,旨在
为节节麦 HMW-GS的研究和利用提供遗传信息。
1　材料与方法
1.1　供试材料
本研究使用的材料节节麦(Trit icum tauschi i
2n=2x =14 , DD)(编号:Y121 ,产地:前苏联)由中
国科学院遗传研究所王道文研究组提供 。以小麦谷
蛋白亚基标准品种豫麦 34(1 , 7+9 , 5+10)和中国
春(7+8 , 2+12)为对照。
1.2　节节麦谷蛋白的提取和 SDS-PAGE
样品的提取以及 SDS-PAGE 电泳技术参照孙
辉等[ 9] 的方法。每份材料随机取 3粒进行单粒种子
的 HMW-GS 组成分析 。小麦的高分子量谷蛋白亚
基是根据 Payne 等[ 10-11] 提出的“数字命名系统”来
命名的。本研究中节节麦亚基通过与已知小麦高分
子量谷蛋白亚基进行对照而命名。
1.3　节节麦基因组 DNA提取和 PCR扩增
用CTAB法[ 12]提取材料基因组 DNA 。HMW-
GS 的 N-端和 C-端序列高度保守 ,根据已知 Dy10
和 Dy12基因序列[ 13-14] ,运用 Primer Premier5.0软
件设计一组引物 , p1:5′-A TGGCTAAGCGGC(T)
TA(G)GTCCTCTT TG-3′;p2:5′-CTATCACTG-
GCTG(A)GCCGACAA TGCG-3′(括号中为简并碱
基),由大连宝生物公司合成 。PCR反应体系为 25
μL ,含 2.5U Ex Taq 酶(大连宝生物公司), 3 μL
150 ng 模板 DNA , 2 μL 10 buffer(-), 2.5 μL
dN TP ,每条引物 25 μmol · L-1 。反应条件为:94
℃预变性 2 min;然后 94 ℃变性 1 min ,68℃退火及
延伸 4 min;36个循环;最后 68℃延伸 7 min。
1.4　目的基因的克隆和测序
PCR产物用 0.8%琼脂糖凝胶电泳分离 , 用
DNA 凝胶回收试剂盒 Ver2.0(TaKaRa 公司 ,上海
生工北京测序部)对目的片段进行回收。将回收的
PCR产物与 PMD-19T vector(Takara 公司)连接 ,
转化大肠杆菌 DH-10B 。DNA 序列测定由上海生
工测序部完成(ht tp://www .sangon.com/)。
1.5　序列比对和系统进化分析
采用生物学分析软件 Bioedit7.0.1 ,对本研究
中克隆的亚基 Dy8.1t 与已知序列的氨基酸序列
(ht tp://www .ncbi.nlm.nih.gov/)进行 ClustalW
多序列比较分析。这 25个亚基分别来自于六倍体
普通小麦(T .aestivum)、斯卑尔脱小麦(T .aesti-
vum subsp.spelta)、节节麦(T .tauschi i)、肥山羊草
(Ae.crassa)、柱穗山羊草(Ae.cy l indrica)、四倍体
提莫非维小麦(T .t imopheevi)和四倍体圆锥小麦
(T .turg idum)[ 3 , 13-21] ,利用 DNAMan 软件构建系
统进化树。
2　结果与分析
2.1　节节麦的高分子量谷蛋白组成分析
SDS-PAGE鉴定结果表明 ,在节节麦 Y121中
发现 1种 x-型亚基和 1种 y-型亚基。其中 x-型亚
基已经有研究 ,被命名为1.4 t[ 22] ;y-型亚基在 SDS-
PAGE 胶上的迁移率均较 Dy9稍慢 ,较 Dy8稍快 ,
是一种新型亚基 ,命名为 Dy8.1 t ,其亚基组合为
1.4t +8.1t(图 1)。
从左到右为:豫麦 34,节节麦 Y121 ,中国春。
From lef t to right:Yumai 34 , T.tausch ii Y121 , Chines e Sp ring
(CS).
图 1　节节麦 Y121的 HMW-GS电泳图谱
Fig.1　Electrophoresisof SDS-PAGE in T.tauschii Y121
2.2　Dy8.1t 亚基的分子克隆与序列分析
根据 HMW-GS 的 N-端和 C-端序列高度保守
序列设计特异引物 P1 和 P2。以 RM0182 Y121
DNA 作为模板 ,扩增相应亚基的编码基因序列 ,均
在约 2 000 bp左右处获得 2条扩增条带 ,分别推测
为 x-型亚基和 y-型亚基(图 2)。
图 2　Dy8.1 t新亚基 PCR扩增(y为扩增目的条带)
Fig.2　Agarose-gel separation of PCR products
from Triticum tauschii accession Dy8.1t(The
target fragments were indicated by y)
分别将 2 000 bp左右处的目的条带回收纯化 、
克隆测序 , 得到了亚基 Dy8.1t 的基因编码序列 ,
DNA 序列全长为 1 995 bp(GenBank 登录号为
·199·第 2 期　　　　　　　　常广阳等:节节麦的一种 y-型 HMW-GS 的鉴定 、克隆及系统进化分析
FJ499503),以 ATG 起始密码子开始 ,双终止密码
子 TGA TAG 结束 ,编码 665 个氨基酸残基 。推导
的 Dy8.1t 亚基的氨基酸序列包括一个含有 21个氨
基酸残基的信号肽 ,一个含有 104个氨基酸残基的
N-端保守区 , 23 个 6肽(PGQGQQ)和 4个 9 肽
(GYYPTSLQQ),以及位于重复区起始端的十一肽
(GYYPSV TSPRQ)、十二肽(GSYY PGQASPQQ)
和重复区末端的三肽(GYD),在重复区中没有发现
x 型亚基所特有的三肽(GQQ)。
DY8.1 t 亚基含有 7个半胱氨酸残基 , 5个分布
在 N-端 , 1个在靠近 C-端区的重复区 ,最后 1个在
C-端区 ,其中第 2个和第 3个半胱氨酸残基相邻 。
应用 BioEdi t7.0.1软件对 Dy8.1 t 与 Dy10.4t 、
Dy10.5t 、Dy10 t 和 Dy12t 比较分析 , 如图 3 所示 ,
Dy8.1 t 与 Dy10.4 t 、Dy10.5t 在信号肽的部位有一
个氨基酸差别(F-L);Dy8.1t 与 Dy10.4t 、Dy10.5t 、
Dy10t 和 Dy12t 在 N-端序列也有一个氨基酸差别
(R-G);Dy8.1 t 与 Dy10.4t 在 N-端序列处也有一个
氨基酸差别(P-S)。
a:信号肽序列;b:N-端序列;c:C-端序列。
a:S ignal pept ide;b:N-terminal sequence;c:C-terminal sequ ence
图 3　Dy8.1t与已知亚基的氨基酸序列的比较
Fig.3　Dy8.1 t comparied with the amino acid sequence of known subunits
2.3　与已知 HMW-GS 亚基编码基因的序列比对
和系统进化分析
亚基序列比对结果显示 ,Dy8.1 t与其他 HMW-
GS 的结构在氨基酸的组成上十分相似 ,均包括 4个
区域 ,即信号肽 、非重复的 N-端和 C-端区以及一个
高度重复的中部区。这与前人的研究一致[ 23] 。
Dy8.1t与已知 Glu-1亚基全编码序列一致性比较结
果如表 1显示 ,这个亚基的结构特点表现为 N-端非
重复区氨基酸数量均为 104个;重复区域序列均起
始于两个长的重复区域 ,均结束于 1 个 3 肽 GYD ,
且未出现 x-型高分子量麦谷蛋白亚基所特有 3肽
(GQQ)结构;整个编码区含有 4 个半胱氨酸残基 ,
存在位置保守;这个亚基与所有已知的 y-型亚基的
一致性高于与 x-型亚基的一致性 ,且全序列与已知
的 y-型亚基全编码序列一致性较高 ,达到 90%以
上 ,而与来自其他染色体组亚基的氨基酸序列差别
·200· 麦　类　作　物　学　报　　　　　　　　　　　　　　　　　　第 30 卷
较大 。
表 1　Dy8.1t 与已知亚基全编码序列的一致性比较
Table 1　Identity of Dy8.1t with other Glu-1 genes
基因序号
No.of gene
亚基类型
Subunite type
来源
Resource
全序列
一致性/ %
Ident ity
X12929 Dy10 普通小麦　T.aest ivum 94
AY695379 Dy10.1 普通小麦　T.aest ivum 96
FJ499504 Dy10.4 节节麦　T.tausch ii 98
FJ499503 Dy10.5 节节麦　T.tausch ii 98
FJ499502 Dy10.5＊ 节节麦　T.tausch ii 97
X03041 Dy12 普通小麦　T.aest ivum 95
AY248704 Dy12.1t 节节麦　T.tausch ii 94
AY424274 Dy12.4t 节节麦　T.tausch ii 98
AJ306975 Dx 柱穗山羊草　Ae.cy lindr ica 55
EF051701 Dx1.1t 节节麦　T.tausch ii 53
DQ857243 Dx1.6t 节节麦　T.tausch ii 55
AY245797 By8 硬粒小麦　T.turgid um 83
X61026 By9 普通小麦　T.aest ivum 85
EF540765 By16 普通小麦　T.aest ivum 81
EF540764 Bx13 普通小麦　T.aest ivum 59
横坐标为聚类重新标定距离;纵坐标为聚类之间的遗传距离
(最上端的标尺值为根据距离按比例重新标定的值)。
Ab scis sa:Rescaled distance clu ster com bine;Vert ical coordi-
nates:The genetic dis tances betw een the clustering.
图 4　Glu-1位点基于全编码区氨基酸序列的系统进化关系
Fig.4　Phylogenetic tree generated from the nucleotide
sequence alignment of Glu-1 by clustal W
(neighbor-joining method)
为了进一步探讨不同染色体组编码的 HMW-
GS 基因间的遗传进化关系 ,将克隆的 Dy 亚基和己
克隆的 25个 HMW-GS 基于全编码序列构建系统
进化关系树(图 4 , 25 个 HMW-GS 的来源见 1.5
节)从系统关系树中可以看出 , Dy10.4 t 和 Dy12.4 t
这 2个亚基间的遗传距离较小 ,亲缘关系较近 ,所以
聚在一小类中 ,这可能与材料处于同一地理分布区
因而来源单一有关;Bx13和 Bx17 这 2 个亚基间的
遗传距离较小 ,亲缘关系较近 , 也聚在一小类中;
Dy8＊和 Dy10.1 t 这 2个亚基间的遗传距离较小 ,亲
缘关系较近 ,也聚在一小类中 。此外 , 相对其他 D
组亚基 ,Dy8.1t 和 Dy8＊与来自普通小麦的Dy 亚基
亲缘关系相对较远 ,没有聚在一类中 。
3　讨 论
本研究以节节麦为材料 ,利用 SDS-PAGE 技术
对其 HMW-GS 进行分离和鉴定 ,并克隆得到 1个
HMW-GS基因 Dy8.1t 。通过序列测定与结构比
较 ,发现这个亚基的核苷酸 、氨基酸序列与已知的亚
基均不相同。这些特点均为典型的 y-型高分子量
麦谷蛋白亚基特征 ,进一步证明 Dy8.1 t 这 1个亚基
确为 Dy 亚基 。
Dy8.1 t 亚基的氨基酸序列表现为 Dy8.1t 与已
知 Dy10t 亚基存在着一个多个氨基酸的差异;2个
亚基基因的共同结构特点如:N-端非重复区氨基酸
数量均为 104个;重复区域序列 ,均起始于两个长的
重复区域 ,均终结于 1 个 3 肽 GYD ,且都没有 x-型
高分子量谷蛋白亚基所特有 3肽(GQQ)结构;Dy8.
1 t 和 Dy10 t 的整个编码区含有 4 个半胱氨酸残基 ,
存在位置保守;且全序列与所有的 y-型亚基全编码
序列一致性较高 ,这些特征均为典型的 y-型高分子
量谷蛋白亚基特征 ,进一步证明 Dy8.1 t 和 Dy10 t 这
2个亚基确为 Dy 亚基。同时 ,比对显示 Dy8.1t 谷
蛋白亚基与已知亚基序列均不一致 ,是 1 个完全不
同的新型 HWM-GS 亚基 。
亚基 Dy8.1t 的编码基因与已知 y-型亚基编码
基因的比较分析表明 ,所有的 y-型亚基都有极为相
似的重复区排列方式 ,且同一染色体组上的亚基间
的相似性更高 ,推测这些 y-型亚基可能是由共同祖
先进化而来的。所有的 y-型亚基同时也具有一定
的差异 ,这主要是由重复区域重复单元的变化造成
的 。重复基元每一个位置的变异比较显示 , Dy8.1 t
与来自小麦的优质亚基 Dy10相比具有类似的重复
单元的缺失和氨基酸代换类型 ,而重复单元的缺失
和氨基酸代换可能对面包加工品质的影响共同起作
用[ 2 4] 。这 1 个 y-型亚基和来自小麦的优质亚基
Dy10对加工品质的影响是否相似 ,以及它们在小麦
加工品质改良中的潜在利用价值还有待进一步研
·201·第 2 期　　　　　　　　常广阳等:节节麦的一种 y-型 HMW-GS 的鉴定 、克隆及系统进化分析
究。通过对 Dy8.1t 亚基基因核苷酸序列的研究 ,发
现该序列的 GC 含量很高 ,达到 69.92%。由核苷
酸推导出氨基酸序列的二级结构 ,对研究节节麦亚
基氨基酸结构有重要意义。在小麦品质分析研究
中 ,N-端附加有半胱氨酸残基 ,中间重复单元中的
β-螺旋的数目对高分子谷蛋白亚基的品质有存在一
些影响 ,由 Dy8.1 t 氨基酸的二级结构图发现 ,其中
部重复区是由重复的 β 反向折叠组成的螺旋结构 ,
两端的非重复区是由α螺旋构成的结构 , β 螺旋比
较多 ,两端非重复区的胱氨酸残基可使 HMW-GS
形成分子间的二硫键 。本研究的结果为研究小麦族
相关物种的起源和进化提供了遗传学信息 ,有关该
亚基对小麦的品质效应有待于进一步的分析鉴定 。
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