全 文 ：收稿日期:2006 10 18
基金项目:江苏省 2004 年度博士研究生创新计划项目(xm04-57)
作者简介:何　佳(1965 ), 男 ,河南洛阳人 , 副教授 ,在读博士研究生 ,主要从事微生物来源活性物质的研究。
通讯作者:陈　钧(1947 ), 男 ,安徽芜湖人 , 教授 ,博士 , 博士生导师 ,主要从事天然产物研究。
金钱松内生真菌抗植物病原真菌活性的研究
何　佳1 , 2 ,陈　钧1＊ ,赵启美1 , 2 ,祁红兵1
(1.江苏大学 生物与环境工程学院 ,江苏 镇江 212013;2.河南科技大学 食品与生物工程学院 ,河南 洛阳 471003)
摘要:首次对金钱松内生真菌进行了分离 ,并以稻瘟霉(Pyricularia ory za)P-2b活性筛选体系为
筛选模型 ,以水稻纹枯病菌(Corticium sasaki i)AS3.2872 、亚麻刺盘孢(Colletotrichum lini)AS3.
4486 、禾谷镰孢(Fusarium gram inearum)AS3.4598 和棉灰星盘多毛孢菌(Pestalotia gossypi i
Hori)等 4种常见植物病原真菌为指示菌 ,研究了金钱松内生真菌抗植物病原真菌活性菌株的抗菌
能力 。结果表明 ,金钱松内存在着大量具有抗稻瘟霉 P-2b 活性的内生真菌 , JJ18 , JJ28 , JJ314和
JJ323等 4株活性菌株对指示菌表现出强烈的广谱抗菌能力 ,其中 JJ314 , JJ323可诱导稻瘟霉 P-
2b菌丝呈现明显的念珠状变形现象 ,表明这 2 株活性菌株代谢产物中可能含有低毒性抗真菌成
分。金钱松内生真菌是潜在的杀菌生物农药资源 。
关键词:金钱松;内生真菌;稻瘟霉;植物病原真菌
中图分类号:S949.32　　文献标识码:A　　文章编号:1004 3268(2007)02 0046 04
Study on the Antifungal Activity of Endophy tes of
Pseudolarix kaemp f eri Gord
HE Jia1 , 2 ,CHEN Jun1＊ ,ZHAO Qi-mei1 , 2 , QI Hong-bing1
(1.Schoo l o f Bio-environmental Enginee ring , Jiangsu Univer sity , Zhenjiang 212013 , China;
2.School of Food &Bioenginee ring , Henan Univer sity o f Science and Techno lo gy , Luoyang , 471003 , China)
Abstract:Objective:To study antifungal activity o f endophy te s f rom Pseudolarix kaemp feri
Gord.Method:The endophy tes f rom Pseudolarix kaemp f eri Gord w ere separated fo r the fi rst
time.Antifungal endophy tes w ere screened by Pyricularia oryzae P-2b model , and the act ivity
of endophy tes against Cort icium sasak ii AS3.2872 , Colletotrichum lini AS3.4486 , Fusarium
graminearum AS3.4598 and Pestalotia gossypii Hori we re studied.Resul t:There w ere many
endophytes against Pyricularia oryzae P-2b in Pseudolarix kaemp feri Gord.JJ18 , JJ28 , JJ314
and JJ323 had broad-spect rum intense antifungal activi ty to the four indicator s.JJ18 and JJ28
could induced the fo rmation of characterist ic beads to the g rowing Pyricularia ory zae P-2b
hyphae , indicat ing that i t w as possible for the tw o st rains to produce antifungal agents of weak
to xici ty.Conclusion:The endophy te s f rom Pseudolarix kaemp f eri Gord w ere a po tential re-
source fo r antifungal ag ent.
Key words:Pseudolarix kaemp f eri Gord;Endophyte;Pyricularia oryzae;Plant pathogenic fungi
　　金钱松(P seudolarix kaemp feri Gord)为我国
特有单属种植物 ,属孑遗植物 ,目前处于濒危状态 ,
被列为国家二级保护植物 ,土槿皮是其干燥根皮或
近根树皮 ,为我国传统中药 ,含有二萜类 、三萜类 、三
萜内酯及甾醇类等成分 ,具有强烈的抗真菌 、抗肿瘤
作用[ 1 , 2] ,应用前景广阔 ,但当前有限的植物资源已
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2007年第 2期
DOI :10.15933/j.cnki.1004-3268.2007.02.013
成为开发其活性产物的巨大障碍。研究发现 ,植物
内生真菌能产生大量新的天然产物 ,有些内生真菌
还可以产生与宿主植物相同或相近的代谢产物 ,近
来发现的天然产物 11%来自植物和动物 , 38%来自
土壤微生物 ,51%来自植物内生真菌 ,它已成为天然
产物潜在的重要资源[ 3 ～ 5] 。东京大学宕崎成夫建立
了以稻瘟霉(Pyricularia oryz a)P-2b 孢子及菌丝
形态学现象为指标的抗真菌 、抗肿瘤成分快速筛选
模型 ,并从海洋真菌中成功的筛选到了 fusaridin A
等抗真菌新药[ 6 , 7] ;李渤 、齐秀兰等以此模型分别从
海洋微生物 、土壤微生物中筛选到了抗真菌活性菌
株[ 8 , 9] 。本研究对金钱松内生真菌进行了分离 ,并
将稻瘟霉 P-2b模型引入内生真菌抗真菌活性筛选
中 ,研究了活性菌株对 4种常见植物病原真菌的抗
菌能力 ,旨在为开发生物农药提供新思路。目前 ,有
关金钱松内生真菌的研究尚未见文献报道。
1　材料和方法
1.1　材料
1.1.1　金钱松(P seudolarix kaemp f eri Gord)枝
和叶　采摘于江苏大学校内 ,由江苏大学药学院欧
阳臻博士鉴定。
1.1.2　筛选模型菌株及指示菌　稻瘟霉(Pyricu-
Laria oryz ae)P-2b菌株由沈阳药科大学姚新生院
士提供 , 水稻纹枯病菌 C.s(Corticium sasaki i)
AS3.2872 、亚麻刺盘孢 C.l(Colletotrichum lini)
AS3.4486 、禾谷镰孢F .g(Fusarium graminearum)
AS3.4598由中国科学院微生物研究所提供 , 棉灰
星盘多毛孢菌 P.g(Pestalot ia gossy pii Hori)由江
苏农科院植保所提供 。
1.1.3　试剂与药品　二甲亚砜(DMSO)、吐温-80
(国药集团化学试剂有限公司);两性霉素B(AmB)、
(Sunshine 公司);甲基托布津(T hM)可湿性粉剂 ,
日本曹达株式会社;沙保氏培养基南京博尔迪生物
科技有限公司)。
1.1.4　仪器　Nikon TS100倒置显微镜;上海福玛
试验设备有限公司 QYC-211 摇床;苏净集团 SW
-CJ-2FD超净工作台;Corning 96孔微量板。
1.2　方法
1.2.1　内生真菌的分离纯化　按照参考文献[ 4]进
行。
1.2.2　内生真菌发酵粗提物制备　于 250mL 的
三角瓶中加入 50mL 马铃薯葡萄糖培养液 ,分别将
内生真菌接种在培养液中 ,28 ℃摇床(120 r/min)振
荡培养 7 d。将内生真菌发酵液在 70 ～ 20 ℃条件
下冻融 3次[ 10] ,以释放胞内产物 ,过滤去菌丝体 ,滤
液冻干 ,甲醇浸提。挥干提取液中的甲醇 ,衡重称
重 ,将提取物溶于 3mL 甲醇 ,即为甲醇粗提液供试
样品。
1.2.3 　抗真菌阳性药物溶液制备 　参考 NC-
CLSM 38-A[ 1 1] 方案 ,先用 DMSO 溶解两性霉素 B 、
甲基托布津 , 再用无菌水稀释成含 10%DMSO
2 000μg/mL 两性霉素 B , 7 000μg/mL 甲基托布津
储液 , 70 ℃保存 ,使用时用无菌水稀释 ,使DMSO
终浓度低于 1%。
1.2.4　稻瘟霉模型筛选[ 6] 　将稻瘟霉 P-2b菌种
接种在 PDA 斜面上 , 28 ℃培养14 d。每个斜面加无
菌水 10mL ,刮下孢子 ,振摇片刻 ,用 4层纱布过滤 ,
镜检调整至孢子数为 4×104cfu/mL (cfu ,菌落形成
单位),孢子悬液中加入 3%沙保氏液体培养基。
将 10μL 各样品甲醇粗提液分别加入 96孔微
量板中 ,挥干甲醇后 ,每孔加无菌水 10μL;以甲醇
为阴性对照 ,阴性对照孔每孔加甲醇 10μL , 挥干
后 ,加无菌水 10μL;空白对照孔每孔加 10μL 无菌
水 。所有孔加孢子悬液 40μL ,每孔总体积 50μL。
4 ℃低温放置扩散 2h , 28 ℃培养 18 h。3 次重复。
在倒置显微镜下观察稻瘟霉孢子萌发 、菌丝生长及
形态变化情况。
根据以上初筛结果 ,采用微量稀释法对活性菌
株进行复筛。96孔微量板每列 1 ～ 7孔分别加入
20μL ,15μL , 10μL ,8μL , 6μL , 4μL , 2μL 各甲醇粗
提物样品 ,挥干甲醇后 ,每孔加无菌水 10μL;以二
倍系列稀释的两性霉素 B 、甲基托布津为阳性对照
药品 ,每孔加 10μL ,使阳性对照 1 ～ 8 孔两性霉素
B 、甲基托布津终浓度分别为 20 ～ 0.15 μg/mL , 700
～ 5.5μg/mL。其余操作同前 。
1.2.5　活性菌株抗植物病原真菌试验[ 11] 　各植物
病原真菌在 PDA斜面上 28℃培养 7 ～ 14 d ,产生孢
子 ,将其加入到含有 0.1%吐温-80的沙保氏液体
培养基制备悬液 ,悬液静置 3 ～ 5min 后 ,大颗粒沉
于底部 ,取上层均质液体(含孢子以及菌丝片段)至
无菌试管 ,振荡 5 s ,镜检 ,用沙保氏液体培养基调整
菌悬液浓度 4×104cfu/mL。
采用微量稀释法 ,对植物病原菌进行抗菌研究 ,
样品处理方法同复筛 , 所有孔加病原菌菌悬液
40μL ,每孔总体积 50μL。28 ℃培养 3 d。在倒置显
微镜下观察 ,两性霉素 B 、甲基托布津的最小抑菌浓
度(M IC)为没有可见生长的病原菌最低药物浓度 ,
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河南农业科学
供试样品以未见生长的病原菌最低药物浓度为其
MIC ,每处理 3次重复。
2　结果与分析
2.1　内生真菌分离结果
根据菌落培养特征 ,先后 4次共从金钱松茎和
叶中分离出内生真菌 105株 ,
2.2　活性菌株的初筛
初筛结果显示 ,以稻瘟霉 P-2b菌株分生孢子
萌发及生长形态为指标 , 105株内生真菌中有 47株
发酵粗提物原液对稻瘟霉具有抗菌活性 ,活性菌株
占总分离菌株的 44.8%,其中 , 12株使孢子不能萌
发 ,占 11.4%;9株使孢子略微萌发 , 严重变形 ,占
8.6%;13株使菌丝生长缓慢 ,中度变形 ,占 12.3%,
13株使菌丝轻度变形 ,占 12.3%。这表明金钱松内
生真菌具有广泛的抗真菌活性 。结合各菌株的生长
特点和抗菌活性稳定性 ,从对稻瘟霉 P-2b 菌株具
有强烈抗性的菌株中选出 JJ18 , JJ28 , JJ210 , JJ243 ,
JJ314 , JJ318 , JJ323 , JJ324 , JJ326 , JY47 等 10 株内
生真菌进行进一步研究 。
2.3　活性菌株的复筛及抗病原真菌能力测定
从表 1可以发现 ,内生真菌 JJ18 , JJ28 , JJ243 ,
JJ314 , JJ318 , JJ323菌株发酵粗提物和两性霉素 B 、
甲基托布津在高浓度下可完全抑制稻瘟霉孢子的萌
发 ,96 h时孢子仍不能萌发 ,随着浓度的降低 ,稻瘟
霉的形态变化从略微萌发的孢子严重变形至生长缓
慢的菌丝变形 ,发酵粗提物浓度和其对稻瘟霉抗性
之间呈正相关关系 ,表明其活性物质具有量效关系 ,
其中 , JJ243 , JJ314 , JJ323分别在浓度 9.58mg/mL ,
3.22mg/mL 和 23.22mg/mL 时使稻瘟霉菌丝表现
出明显的念珠状变形现象;JJ18 , JJ28 , JJ318 分别在
浓度 3.18mg/mL ,7.95mg/mL 和 4.70mg/mL 时
使稻瘟霉菌丝呈现卷曲变形 。 JJ210 , JJ324 , JJ326 ,
JY47只在高浓度下表现出抑制稻瘟霉孢子萌发的
表 1　活性菌株对稻瘟霉 P-2b的抗菌活性
活性 样品浓度(mg/mL)
JJ18 JJ28 JJ210 J J243 J J314 JJ318 JJ323 JJ324 J J326 JY47
对照(μg/mL)
AmB ThM
× 9.53 12.24 15.33 17.95 6.44 9.40 58.04 10.38 10.63 7.95 2.5 175
+++ 6.35 160.00 × 11.97 4.83 7.06 30.96 × × × 1.25 87.5
++ 3.18 7.95 × 9.58 3.22 4.70 23.22 × × × 0.31 21.8
　注:“ ×”表示抑制孢子萌发 , “ +++”表示孢子略微萌发,严重变形 , “ ++”表示菌丝生长缓慢 ,中度变形
活性 ,浓度降低后不表现活性 ,这表明这些菌株发酵
粗提物活性成分不具量效关系 。
　　10 株活性内生真菌对指示菌的 M IC 见表 2 ,
JJ18 , JJ28 , JJ314和 JJ323对 4种指示菌都具有强抗
菌活性 ,可完全抑制指示菌的生长 ,表现出广谱的抗
菌活性;JJ324除对亚麻刺盘孢没有测出 M IC外 ,可
完全抑制其他 3 种指示菌的生长;JJ210 , JJ243 ,
JJ326 , JJ318和 JY47 只表现出对水稻纹枯病菌和
禾谷镰孢的抑制活性 ,而对亚麻刺盘孢和棉灰星盘
多毛孢菌无活性。从各活性菌株对 4种指示菌的抗
菌能力看 ,指示菌耐药能力由大到小依次为:棉灰星
盘多毛孢菌(p.g)>亚麻刺盘孢(C.l)>水稻纹枯病
菌(C.s)、禾谷镰孢(F.g),这与阳性对照药物两性霉
素 B和甲基托布津对 4种指示菌 MIC 相对应 ,表明
稻瘟霉 P-2b活性筛选模型对内生真菌活性产物也
具有理想的筛选作用。
表 2　活性菌株对指示菌的MIC
指示菌 样品 MIC(mg/mL)
JJ18 JJ28 JJ210 J J243 J J314 JJ318 JJ323 JJ324 J J326 JY47
对照 MIC(μg/mL)
AmB ThM
C.l 15.88 19.87 × × 12.07 × 77.39 × × × 10 175
P.g 23.81 26.49 × × 12.07 × 58.04 25.96 × × 20 350
C.s 6.35 12.24 10.22 11.97 8.05 9.4 15.48 10.38 7.08 7.95 5 87
F.g 6.35 5.3 10.22 11.97 4.83 4.7 38.7 10.38 5.67 3.98 2.5 87
　注:“ ×”表示没有测出
3　讨论
当前 ,从药用植物中分离筛选抗真菌成分或活
性先导化合物 ,开发生物农药已成研究热点 ,但一些
植物 ,尤其是珍稀植物 ,有限的资源成了限制因子 。
1993年 ,Stierle 等人首次从短叶红豆杉(Ta xusbre-
v i f lia)中分离到 1株能合成抗癌物质紫杉醇的内
生真菌(Ta xomyces andreanae),表明有的内生菌
具有合成和宿主植物相同或相似的活性成分的能
力 。这一发现掀起了一场从药用植物中分离内生菌
的热潮 ,为人类解决某些药用植物生长缓慢 ,资源紧
缺等因素带来的药源紧张和生态破坏问题 ,利用植
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2007年第 2期
物内生菌进行工业化发酵生产某些重要天然药物提
供了新的思路。我国的植物多样性居亚洲第 1 、世
界第 3 ,拥有 11000种传统药用植物 ,其中 ,许多具
有抗菌功能 ,是研究抗菌成分的巨大宝库。金钱松
具有强烈的抗真菌活性 ,土槿皮拥有千百年的使用
历史 ,对于这种我国特有的孑遗植物 ,其体内就是一
个特殊的生态环境 ,是分离 、筛选具有抗真菌活性内
生真菌的理想目的植物。
筛选对人畜无害 、高效低毒抗真菌剂具有重要
的应用价值 ,但在初筛选时 ,往往无法甄别高毒性抗
真菌成分 。Gary Strobel等认为[ 12] :内生真菌和宿
主长期共生 ,已形成和谐的共生关系 ,由内生真菌产
生的抗真核生物抗生物质 ,对宿主植物应该是低毒
的 ,否则 ,易造成宿主组织死亡 ,宿主植物和高等动
物都是真核生物 ,因此推测 ,对于内生真菌产生的抗
生物质 ,宿主植物本身就是一个对高等生物低毒性
抗生物质的筛选系统。宕崎成夫认为 ,以稻瘟霉 P
-2b菌丝念珠状变形为指标 ,可以筛选到低毒性抗
真菌活性成分 , Fusarielin A 就是一种低毒性抗真
菌剂 ,它表现出对 HeLaS3 ,NCI-H69 细胞株很弱
的细胞毒性;认为以菌丝卷曲变形为指标筛选抗肿
瘤成分是可行的 ,且筛选到了具有细胞毒性的抗肿
瘤药物 Rhizoxin[ 6] 。Gunji S 等以诱导稻瘟霉菌体
变形为指标 ,筛选的 po lyox in可阻止真菌细胞壁几
丁质的合成 ,引起稻瘟霉的菌丝念珠状变形 ,对高等
动物来说 ,是一种选择性低毒抗真菌剂[ 13] 。因此 ,
笔者认为 ,以稻瘟霉 P-2b为模型 ,筛选植物内生真
菌抗真菌活性成分 ,得到低毒性抗真菌成分的可能
性更大。
本研究发现 ,内生真菌 JJ243 , JJ314 , JJ323在低
浓度条件下可使稻瘟霉菌丝表现出明显的念珠状变
形现象 ,表明这 3个菌株代谢产物中可能含有低毒
性抗真菌成分;JJ18 , JJ28 , JJ318在低浓度下使稻瘟
霉菌丝呈现卷曲变形 ,具有较大的细胞毒性 ,可能不
适宜作生物农药 ,其活性成分有待进一步研究 。
5　结论
1)系统研究了金钱松内生真菌抗植物病原菌
活性 ,分离出内生真菌 105 株 ,其中 47 株对稻瘟霉
孢子具抗菌活性 ,表明金钱松内生真菌中存在广泛
的抗菌资源 ,而其中的 JJ314和 JJ323 菌株对指示
菌表现出强烈的广谱抗菌能力 ,可能含有低毒性抗
真菌成分 。关于抗菌物质基础有待进一步研究。
2)稻瘟霉 P-2b 模型对植物内生真菌抗真菌
活性的筛选结果 ,与活性菌株 、阳性药物对指示菌的
抗性具有良好的相关性 ,这表明筛选方法可靠 、准确
率高 ,适用于内生真菌的筛选。
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