全 文 ：北方园艺２０１１（１６）：１６１～１６３ ·生物技术·
第一作者简介：刘辉（１９７９－），男，山东泰安人，在职博士，农艺师，
现主要从事观赏植物栽培技术与分子育种研究工作。Ｅ－ｍａｉｌ：
ｌｉｕｈｕｉ５１８ｌｈ＠１６３．ｃｏｍ。
基金项目：杭州市科技局科技计划资助项目（２０１０１０３２Ｂ１０）。
收稿日期：２０１１－０５－２０
三色堇花药培养技术研究初探
刘 辉，傅 巧 娟，陈 一
（杭州市农业科学研究院 园艺研究所，浙江 杭州３１００２４）
摘 要：研究了三色堇花蕾消毒方法、花蕾低温预处理和不同培养基组分对花药愈伤组织诱
导率及其分化的影响。结果表明：采用０．１％ＨｇＣｌ２灭菌２０ｍｉｎ是三色堇花蕾较为理想的表面灭
菌时间。基因型不同花药愈伤组织的诱导率也不尽相同，而且愈伤组织的诱导率总体不高。选
择合适的培养基组分、激素种类和其配比以及合适的培养条件可能是影响三色堇花药培养成功
的关键因子。
关键词：三色堇；花药；组织培养
中图分类号：Ｓ ６８１．９ 文献标识码：Ｂ 文章编号：１００１－０００９（２０１１）１６－０１６１－０３
三色堇（Ｖｉｏｌａ×ｗｉｔｒｏｃｋｉａｎａ）为堇菜科堇菜属多
年生草本植物，又名蝴蝶花、猫儿脸，其色彩丰富艳丽、
品种繁多、花色多变、花期长、适应性强，是当前我国优
良的重要花坛绿化草花。另外，三色堇较耐低温，可耐
－１５℃低温，在昼温１５～２５℃、夜温３～５℃条件下植
株发育良好，因此也是我国冬、春季节不可多得的重要
花坛绿化草花。由于三色堇具有明显的杂种优势，观
赏性强，目前市面上销售的三色堇种子多为Ｆ１ 代。利
用杂交优势进行杂交育种的关键是获得优良性状的纯
系父母本（自交系）。为了获得自交系，按常规的自交
方法，需要耗费大量的田间土地、时间和劳力，一般需
要５～６ａ的时间，而且手续十分繁琐，最终的纯度也不
够理想。而采用花药培养获得单倍体再加倍的方法，
只需１ａ时间就可以获得和多代自交效果相同的纯系，
可以极大地缩短杂交育种年限，提高育种效率。
该试验研究了三色堇花药培养的技术和条件，初
步探讨了影响三色堇花药组织培养的因素，以期最终
获得单倍体植株，并在较短的时间内培育出三色堇育
种亲本。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料
选用生产上常用的２个三色堇品种：‘清新绯红’
和‘想象力紫色’，种子由浙江虹越花卉有限公司提供。
三色堇于２００９年９月中旬种植在杭州农业科学院园
艺所试验基地，于２０１０年３月上旬开始采集花蕾进行
研究。根据杨宏光等［１］对三色堇小孢子发育时期与花
器形态相关性分析的研究，选取纵径长度１４～１５ｍｍ
与横径３～５ｍｍ的花蕾，此时期的花蕾多处于单核靠
边期。
１．２ 试验方法
１．２．１ 花蕾消毒方法研究 将选好的花蕾放在自来
水下冲洗５ｍｉｎ，再用蒸馏水冲洗３次后用吸水纸吸干
水分。在超净工作台上，用７５％的酒精消毒１ｍｉｎ，再
用无菌蒸溜水冲洗３次后用０．１％ ＨｇＣｌ２进行消毒，消
毒时间设为１０、１５、２０、２５和３０ｍｉｎ。消毒完后用无菌
蒸溜水冲洗４次，然后接种在Ｎｉｔｓｃｈ１培养基上，培养
室温度（２５±１）℃，暗培养。每处理１０瓶，每瓶接种６
个花蕾，接种７ｄ后统计１次污染率。Ｎｉｔｓｃｈ１基本培
养基，附加７ｇ／Ｌ琼脂和２０ｇ／Ｌ麦芽糖，ｐＨ ５．８。污
染率＝（污染的花蕾数／接种的花蕾总数）×１００％。
１．２．２ 花蕾低温预处理 对选定好的花蕾以５℃冷藏
１、２、３和４ｄ；采用０．１％ ＨｇＣｌ２消毒２０ｍｉｎ对处理好
的花蕾消毒，然后用镊子剥去花萼、花瓣，取出花药，去
净花丝后接种在Ｎｉｔｓｃｈ２培养基上，每瓶接种１０个花
药，各接５瓶。每隔３ｄ观察１次各瓶花药的启动情
况，接种后３０ｄ统计各花药愈伤组织的启动率情况。
培养室温度（２５±１）℃，培养条件暗培养。Ｎｉｔｓｃｈ２基
本培养基，附加１．０ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ、０．５ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ、０．５
ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ、７ｇ／Ｌ琼脂和２０ｇ／Ｌ麦芽糖，ｐＨ ５．８。启
动率＝（膨大的花药数／接种的花药总数）×１００％。
１．２．３ 花药愈伤组织的诱导 对选定好的花蕾以
５℃冷藏２ｄ，按上述花蕾消毒方法和花药剥取方法，将
花药接种在含不同激素的培养基上，每瓶接种１０个花
药，各接５瓶。培养基种类分为Ｎｉｔｓｃｈ基本培养基和
ＭＳ基本培养基，各培养基附加７ｇ／Ｌ琼脂和２０ｇ／Ｌ
麦芽糖，ｐＨ ５．８。培养室温度（２５±１）℃，培养条件暗
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·生物技术· 北方园艺２０１１（１６）：１６１～１６３
培养。愈伤组织诱导前期每２０ｄ换１次新鲜的原培
养基，待愈伤组织形成后及时将初代愈伤组织转接到
新鲜的原培养基上进行继代培养。每隔３ｄ观察１次
各瓶花药的诱导情况，接种后４０ｄ统计各处理花药愈
伤组织诱导率。诱导率＝（形成愈伤组织的花药数／接
种的花药总数）×１００％。
１．２．４ 花药愈伤组织的分化 将继代１次后获得的
愈伤织织转接到分化培养基上进行不定芽的分化。各
处理共接１０瓶，每瓶接种６块愈伤组织。接种后每
３０ｄ统计１次分化率。分化培养基：Ｎｉｔｓｃｈ基本培养
基，７ｇ／Ｌ琼脂，２０ｇ／Ｌ麦芽糖和０．５ｇ／Ｌ脯氨酸，ｐＨ
５．８，分别附加１ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ和１ｍｇ／Ｌ ＫＴ，或１ｍｇ／Ｌ
ＴＤＺ和０．１ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ。培养室温度（２５±１）℃，光照
培养（光照强度为２００μｍｏｌ·ｍ
－２·ｓ－１），光照周期
１４ｈ（５：００～１９：００）。
２ 结果与分析
２．１ 不同灭菌时间对三色堇花药污染率的影响
由表１可知，短时间的０．１％ ＨｇＣｌ２灭菌，三色堇
花蕾污染率较高，而随着灭菌时间的延长，接种的花蕾
污染率逐渐下降，当灭菌时间为２０ｍｉｎ时，污染率下
降到１０％，２５ｍｉｎ以上时基本没有污染。由于 ＨｇＣｌ２
是一种杀伤力很强的消毒剂，消毒时间过长会对细胞
产生毒害作用，抑制细胞生长。表明２个三色堇品种
的花蕾在ＨｇＣｌ２灭菌时间为２０ｍｉｎ时污染率较低，因
此为了减少 ＨｇＣｌ２对花蕾内花药的损伤，进而影响愈
伤组织的诱导，采用０．１％ ＨｇＣｌ２灭菌２０ｍｉｎ是三色
堇花蕾较为理想的表面灭菌时间。
表１ 不同灭菌时间对三色堇花药污染率的影响
品种 消毒时间／ｍｉｎ 污染数／瓶 污染率／％
１０ ８ ６０
１５ ５ ５０
‘清新绯红’ ２０ １ １０
２５ ０ ０
３０ ０ ０
１０ ７ ６０
１５ ４ ４０
‘想象力紫色’ ２０ １ １０
２５ ０ ０
３０ ０ ０
注：每一处理１０瓶，每瓶接种６个花蕾，接种７ｄ后统计１次污染率。
２．２ 不同低温预处理时间对三色堇花药愈伤组织启
动率的影响
已有研究表明，在花药培养前对花蕾预处理可提
高花药的出愈率，花蕾预处理包括低温、高温等处理，
其中低温处理方法比较常用［２］。该试验以花药初期膨
大即表明花药有可能诱导出愈伤组织为判断依据（表
２），不同的低温预处理时间对２个品种的花药愈伤组
织启动率有明显差异，５℃处理２ｄ的２个品种花药均
有明显膨大现象，‘清新绯红’和‘想象力紫色’的启动
率分别为２５．６％和２６．３％，表明低温处理２ｄ能明显
促进花药愈伤组织的形成。
表２ 不同低温预处理时间
对三色堇花药愈伤组织诱导率的影响
品种 低温处理时间／ｄ 启动率／％
１ １３．５
２ ２５．６‘清新绯红’
３ ２１．２
４ １８．３
１ １０．５
２ ２６．３‘想象力紫色’
３ ２４．３
４ １５．６
注：每瓶接种１０个花药，各接５瓶。下同。
２．３ 不同培养基组分对三色堇花药愈伤组织诱导率
的影响
培养基的种类、激素水平和配比对诱发细胞的分
裂、生长和分化起着决定性作用。采用不同的培养基
种类和激素配比对三色堇花药愈伤组织诱导率的研究
表明（表３－Ａ），在相同培养基成分的条件下，Ｎｉｔｓｃｈ培
养基比 ＭＳ培养基有利于三色堇花药愈伤组织的形
成，而 ＭＳ培养基对三色堇花药愈伤组织诱导率差异
不明显；结果还表明，在同为Ｎｉｔｓｃｈ基本培养基条件
下，６－ＢＡ对诱导三色堇花药愈伤组织起着重要作用，２
个品种间差异明显，‘清新绯红’在添加有１．０ｍｇ／Ｌ
６－ＢＡ培养基上有最高的花药愈伤组织诱导率，达到
２１．４％，而‘想象力紫色’则在１．５ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ培养基
上有最高的花药愈伤组织诱导率，达到２５．６％。
表３ 不同培养基水平和配比
对三色堇花药愈伤组织诱导率的影响
Ａ
培养基种类 生长调节剂 诱导率／％
６－ＢＡ／ｍｇ·Ｌ－１ ＩＢＡ／ｍｇ·Ｌ－１ ‘清新绯红’‘想象力紫色’
Ｎｉｔｓｃｈ
ＭＳ
０
０．５
１．０
１．５
２．０
０
０．５
１．０
１．５
２．０
０．５
０
１７．４
２１．４
２０．３
１４．５
５．６
１２．９
１５．６
１７．３
１４．５
０
１２．３
２０．８
２５．６
１８．６
１０．５
１４．５
１４．６
１２．６
１３．７
Ｂ
培养基 生长调节剂 诱导率／％
种类 ６－ＢＡ／ｍｇ·Ｌ－１ ＩＢＡ ＮＡＡ／ｍｇ·Ｌ－１ ‘清新绯红’‘想象力紫色’
０．５ ０．２ ０．５ ２１．３ １９．８
１．０ ０．２ ０．５ ２７．６ ２２．５
Ｎｉｔｓｃｈ ０．５ ０．５ ０．５ １５．６ １７．３
１．０ ０．５ ０．５ １２．３ ２６．９
０．５ ０．５ １．０ １１．３ １２．７
为了获得更为理想的诱导三色堇花药愈伤组织的
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北方园艺２０１１（１６）：１６１～１６３ ·生物技术·
激素水平和配比，该试验还研究了６－ＢＡ、ＩＢＡ和ＮＡＡ
组合对三色堇花药愈伤组织诱导率的影响。由表３－Ｂ
可知，不同激素种类及浓度对２个品种的花药愈伤组
织诱导率有明显差异，‘清新绯红’在添加有１．０ｍｇ／Ｌ
６－ＢＡ、０．２ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ和０．５ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ培养基上有最
高的愈伤组织诱导率，达到２７．６％，而‘想象力紫色’则
在１．０ｍｇ／Ｌ ６－ＢＡ、０．５ｍｇ／Ｌ ＩＢＡ和０．５ｍｇ／Ｌ ＮＡＡ
培养基上有最高的花药愈伤组织诱导率，达到２６．９％。
２．４ 不同培养基组分对花药愈伤组织分化的影响
该研究将继代１次后获得的各花药愈伤组织选取
较好的转接到不同的分化培养基上进行不定芽的诱
导，３０ｄ后的统计结果表明，２个品种的所有愈伤组织
在２种培养上均不能分化，最后褐化死亡。可见，三色
堇花药虽能诱导形成愈伤组织，但形成的愈伤组织进
一步分化难度很大，不能获得再生植株。
３ 讨论与结论
目前，三色堇是我国重要的花坛和盆栽花卉，市场
需求量大，然而其育种研究远远落后于其广泛的园林
应用现状［３］。国内有关三色堇花药培养的研究特别
少，而通过三色堇花药培养成功获得再生植株的研究
更是鲜有报道。该文对三色堇花药组织培养进行了初
步研究，结果表明，三色堇花蕾通过低温预处理２ｄ后
能提高花药愈伤组织诱导率，但进一步的研究显示，继
代后的愈伤组织分化出不定芽的能力很差，不能获得
再生植株。有关园艺植物花药培养的研究认为，基因
型、小孢子发育时期、培养基成分（基本培养基种类、激
素、碳源、附加成分）及培养条件是影响花药培养成功
的主要因素［４］。该研究采用２个不同基因型的三色堇
品种进行花药培养研究，尽管基因型不同花药愈伤组
织的诱导率也不尽相同，但愈伤组织的诱导率总体不
高，最高不到３０％，而且最终均没有成功获得再生植
株。因此，选择合适的培养基组分、激素种类及其配比
以及合适的培养条件可能是影响三色堇花药培养成功
的关键因子。在下一步的试验中，将在此基础上对三
色堇花药培养做更为深入的研究。
参考文献
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Ｅｌｅｍｅｎｔａｒｙ Ｓｔｕｄｙ ｏｎ Ａｎｔｈｅｒ Ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ Ｐａｎｓｙ（Ｖｉｏｌａ×ｗｉｔｔｒｏｃｋｉａｎａ）
ＬＩＵ Ｈｕｉ，ＦＵ Ｑｉａｏ－ｊｕａｎ，ＣＨＥＮ Ｙｉ
（Ｄｅｐａｒｔｍｅｎｔ ｏｆ Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ Ａｃａｄｅｍｙ ｏｆ Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌ ａｎｄ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，Ｈａｎｇｚｈｏｕ，Ｚｈｅｊｉａｎｇ ３１００２４）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｈｅ ｅｆｅｃｔｓ ｏｆ ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｗａｙｓ ｏｆ ｂｕｄ ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ，ｂｕｄ ｃｏｌｄ ｐｒｅｔｒｅａｔｍｅｎｔ，ｄｉｆｅｒｅｎｔ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎｓ ｏｆ ｐｌａｎｔ
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ｓｈｏｗｅｄ ｔｈａｔ ２０ｍｉｎ ｗｉｔｈ ０．１％ ＨｇＣｌ２ｗａｓ ａｎ ｉｄｅａｌ ｂｕｄ ｓｕｒｆａｃｅ ｓｔｅｒｉｌｉｚａｔｉｏｎ ｔｉｍｅ，ａｎｄ ｏｂｖｉｏｕｓ ｄｉｆｅｒｅｎｃｅ ｗａｓ ｄｅｔｅｃｔｅｄ
ｂｅｔｗｅｅｎ ｔｗｏ ｇｅｎｏｔｙｐｅｓ ｉｎ ｔｈｅｉｒ ｅｆｅｃｔ ｏｎ ｃａｌｕｓ ｉｎｉｔｉａｔｉｏｎ ｏｆ ａｎｔｈｅｒ，ｂｕｔ ｔｈｅ ｏｖｅｒａｌ ｒａｔｅ ｏｆ ｃａｌｕｓ ｉｎｄｕｃｔｉｏｎ ｗａｓ ｎｏｔ
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ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌ ａｎｔｈｅｒ ｃｕｌｔｕｒｅ ｏｆ ｐａｎｓｙ．
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ：Ｖｉｏｌａ×ｗｉｔｒｏｃｋｉａｎａ；ａｎｔｈｅｒ；
ｔｉｓｓｕｅ ｃｕｌｔｕｒｅ
肥害预防措施
熏伤型肥害主要是施用氨水、碳酸氢铵等肥料，这类化肥在气温较高时施用，容易产生大量的氨气，对农作物
造成伤害，轻者使下部叶尖发黄，影响生长发育，重者使全株赤黄枯死。预防：该类肥料应避免在高温时施用。
烧种型肥害为施种肥时用量过大，或用过磷酸钙、碳酸氢铵、尿素、石灰氮等化肥拌种，常常会出现烧种，导致
缺苗。预防：种肥用量不可过大，不用过磷酸钙、碳酸氢铵、尿素、石灰氮等拌种。
毒害型肥害有些化肥如石灰氮，施入土壤后，要经过一系列转化才能被植物吸收，但在转化过程中会产生一
些有毒物质毒害农作物，使其受害或死亡。预防：在施用肥料时要严格控制施用量，安全合理施用化肥。
（来源：农民日报）
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