全 文 ：分子植物育种，2016年，第 14卷，第 4期，第 844-850页
Molecular Plant Breeding, 2016, Vol.14, No.4, 844-850
研究报告
Research Report
三色堇 VwMYB8基因的克隆及其在月季中的瞬时表达分析
曾媛 龚胜 李婧 孙海燕 王健 * 杨文汉 李霆格 赵安瑾 梅晶晶
海南大学园艺园林学院,热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室,海口, 570228
*通讯作者, wjhnau@163.com
摘 要 三色堇花色艳丽，品种丰富，是重要的冬春季花卉。本研究采用黄底紫斑品种‘梦蝶’为研究材料，克
隆花瓣中可能参与花青素累积起调控作用的 MYB 基因 VwMYB8，结果显示：克隆得到的 cDNA 全长为
1 078 bp，经 ORF Finder分析发现其有长度为 849 bp的开放阅读框，编码 282个氨基酸；构建瞬时表达载体
pXCS-VwMYB8，采用粒子轰击的方法作用于月季‘粉扇’花瓣细胞，经过 48 h培养后观察转化材料细胞中色
素的变化，转化的细胞颜色明显加深，表明基因 VwMYB8可以提高月季花瓣细胞中色素的含量。
关键词 三色堇, VwMYB8,瞬时表达,花青素调控
Cloning of VwMYB8 Gene from viola×wittrikianan Gams. and Its Transient
Expression in Rose
Zeng Yuan Gong Sheng Li Jing Sun Haiyan Wang Jian * Yang Wenhan Li Tingge Zhao Anjin Mei
Jingjing
Key Laboratory of Protection and Development Utilization of Tropical Crop Germplasm Resources, College of Horticulture & Landscape Architec-
ture, Hainan University, Haikou, 570228
* Corresponding author, wjhnau@163.com
DOI: 10.13271/j.mpb.014.000844
Abstract Viola×wittrikianan is an important flower in winter and spring for its beautiful flower colors and rich
cultivars. In this study the yellow cultivar‘Mengdie’with purple blotch on petals was used as research material to
clone VwMYB8 of MYB gene in the petal which may be involved in regulation of anthocyanin accumulation. The
results showed that the cDNA full length of this gene was 1 078 bp. ORF Finder analyses showed that the open
reading frame was 849 bp, encoding 282 amino acids. A transient expressed vector pXCS-VwMYB8 was
constructed, using particle bombardment assay to transfer this gene into the petal cell of rose‘Pink fan’. The distinct
pigmentation was observed in the transformed rose petal cells after 48 h incubation. The result of transient
expression indicated that VwMYB8 gene may improve pigment accumulation in cells of rose petals.
Keywords Soybean, Agrobacterium-mediated transformation, GmNHX1, Salt resistance
基金项目：本研究由国家自然科学基金项目(31060265)和海南大学中西部计划学科建设项目(ZXBJH-XK008)共同资助
花色素是植物中十分重要的次级代谢产物，主
要起吸引虫媒、种子传播者以及抵御生物和非生物
胁迫的作用。目前已经清楚，花色素主要源于苯丙氨
酸途径，其形成和分布主要受两大类型基因的控制，
一类是一系列结构基因编码的酶催化完成，该生物
合成途径涉及的结构主要基因包括 PAL、CHS、CHI、
F3H、F3H、DFR、LDOX和 UF3GT，另一类是与合成
基因相关的调控基因(Ben et al., 2011; Petroni and To-
nelli, 2011; Clegg and Durbin, 2000; Zufall and Raush-
er, 2003)，这些调控基因包括MYB、bHLH和WD40
三类转录因子。研究表明大多数植物中都存在由这
三类转录因子组成的 MBW (MYB-bHLH-WD40)转
录复合体，即三类转录因子协同调控花青苷的合成。
三类转录因子中，MYB家族转录因子对花色素
苷的调节作用十分明显。MYB家族转录因子是指含
有MYB结构域的一类非常保守的转录因子。在植物
中，常见的MYB基因属于 R2R3类型(Jin et al., 1999)，
调节花色素苷合成的 MYB因子主要是 R2R3类型
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 1 VwMYB8 RACE电泳图
注: M: DL2000Marker; A: 1: 3RACE片段; B: 1: 5RACE片段
Figure 1 Electrophoretogram for VwMYB8 RACE
Note: M: DL2000 Marker; A: 1: 3RACE fragment; B: 1: 5RACE
fragment
(Gao et al., 2011; Petroni and Tonelli, 2011;许志茹等,
2008)。在研究金鱼草属(Antirrhinum) (Schwinn et al.,
2006)花色素苷基因的表达调控时发现，不同的MYB
转录因子(Ros1, Ros2, Ve)与不同的 bHLH转录因子
(Mut, Del)的组合调控造成了花色素苷在花冠的不同
区域的表达差异，从而使同一花冠上出现了不同的
花色。Hsu等(2015)研究蝴蝶兰属(Phalaenopsis spp.)
部分MYB类转录因子表明，不同的 MYB基因对蝴
蝶兰花瓣、萼片及唇瓣中不同部位的花青素合成具
有不同程度的促进作用。在红皮砂梨(Pyrus pyriolia
Aoguan)中，PyMYB10.1和 PyMYB10基因在红色的果
肉中表达，而在非红色的部分表达量极具减少，且
PyMYB10与 bHLH转录因子共同作用促进梨果肉中
花青素累积的作用(Feng et al., 2015)。菊花(Chrysan-
themum)中 CmMYB6 能够显著激活 CmDFR 基因启
动子，能够单独或与 CmbHLH1共同作用显著提高菊
花中花青素的含量(Liu et al., 2015)。甜樱桃(Prunus
avium L. )中 PaMYB10 .1-1 也能够单独或与分别
PabHLH3和 PabHLH33共同作用，分别起增强和降低
诱导花青素合成的作用(Starkevic and Paukstyte, 2015)。
因此，植物中MYB转录因子对花青素合成起调
控作用的现象普遍存在，本研究中三色堇(Viola×wi-
trockiana Gams.)为堇菜科(Violaceae)堇菜属(Viola)一
二年生花卉，李琴等(2013)通过解剖观察发现三色堇
花瓣色斑区表皮细胞含有大量花色素，利用高效液
相质谱法分析花色素的主要成分是矢车菊素和飞燕
草素，黄色非色斑区则不存在花青素。本课题组在前
期的研究中，已经确认 VwANS、VwDFR、VwF35H等
结构基因是三色堇中花色素形成的关键基因(Li et al.,
2014)。但是，三色堇中是否存在与花青素形成密切相
关的MYB转录因子尚未有研究。本研究根据三色堇
花瓣转录组测序结果，多个 R2R3型 MYB基因在三
色堇花瓣色斑区与非色斑区的表达差异的表达进行
了检测，分析发现其中 VwMYB8基因在色斑区与非
色斑区存在明显差异，可能与花青素合成相关，因此
本研究通过 RACE 技术克隆 VwMYB8 基因序列全
长，构建瞬时表达载体，并转化月季花瓣，以验证该
调控基因的调控功能作用与花色形成的相关性。
1结果与分析
1.2 VwMYB8基因序列全长的获得
利用 PCR/RACE技术从三色堇花瓣中扩增得到
了 VwMYB8的 662 bp 3末端序列(图 1A)，和 208 bp
的 5末端序列(图 1B)。
1.3 VwMYB8基因序列分析
VwMYB8 基因 cDNA 全长 1 078 bp，经 ORF
Finder分析发现其有长度为 849 bp的开放阅读框，
编码 282个氨基酸。其中 5端有长度为 36 bp的非
编码区，3端有长度为 193 bp的非编码区，包括 12 bp
的 poly (A) (图 2)。
利用 ExPASy中的 ProtParam软件分析MYB8蛋
白质，结果发现MYB8蛋白质的分子量为 31.58 kD，等
电点为 8.76，带负电荷的残基(D, E)有 33个，占 11.7%，
带正电荷的残基(R, K)有 39个，占 13.8%，预测它的
分子式为C1362H2182N404O430S15，它的不稳定指数为 50.00，
预测其为不稳定蛋白，其疏水性平均值为-0.71，因
此推断其为亲水蛋白。
应用 TMHMM Server 在线软件对 MYB8 的蛋
白质跨膜结构进行分析，预测 VwMYB8蛋白质肽链
位于细胞膜外，不是跨膜蛋白，可能为核定位蛋白。
通过 Signal P 4.1 Server对 VwMYB8的蛋白质的信
号肽进行预测，结果发现其 mean-s分值为 0.102，小
于 0.5，则其不存在信号肽。
经 Blast软件分析显示，VwMYB8有 2个 DNA-
binding结构域(14~61, 67~112) (图 2)，为 R2R3-MYB
转录因子；用 Blastx对 NCBI的蛋白数据库进行同
源性搜索，发现与它们同源的序列全部为 MYB蛋
白。在线比对后发现 VwMYB8 与其他植物的基
MYB 蛋白一致性均达到 60%以上，其中与白梨
(Pyrus × bretschneideri)、毛果杨(Populus trichocarpa)、
毛白杨(Populus tomentosa)、枇杷(Eriobotrya japonica)、
月季 (Rosa chinensis Jacq.)、可可 (Theobroma cacao)、
苹果(Malus hybrid cultivar)、陆地棉(Gossypium hirsu-
tum)和蓖麻(Ricinus communis)、等植物的 MYB蛋白
845
图 2三色堇 VwMYB8基因核苷酸序列及推导的氨基酸序列
注:阴影:开放阅读框;划线: 2个 DNA-binding结构域(14 aa~61 aa, 67 aa~112 aa)
Figure 2 cDNA sequence of VwMYB8 of pansy and its predicted amino acid sequence,
Note: Shaded regions : open read frame; underlined portions : Two DNA-binding domains (14 aa~61 aa, 67 aa~112 aa)
图 3 VwMYB8氨基酸的聚类分析
Figure 3 Polygenic analysis of VwMYB8 based on amino acid se-
quences
一致性分别是 69%、67%、67%、68%、66%、66%、68%、
68%、67%。利用Mega软件对 VwMYB8基因编码的
氨基酸序列进行聚类分析发现，VwMYB8与枇杷、苹
果、白梨、月季中的MYB蛋白亲缘关系较近(图 3)。
1.4 pXCS-VwMYB8载体构建
本研究采用 pXCS-HAStrep载体作为表达载体，
通过质粒重组，得到重组质粒，命名为 pXCS-VwMYB8
载体(图 4)。图 5 为重组质粒检测结果，短片段为
VwMYB8，长度与开放阅读框相符。
1.5基因枪法介导 VwMYB8基因的瞬时表达
通过基因枪法，将重组载体导入月季花瓣中，以
pXCS-HAStrep空载体为空白对照(图 6)。图中黑色箭
头所指为钨粒，红色箭头为发生颜色改变的月季细
胞。将表达载体轰击至粉红月季花瓣中，经过 48 h插
水培养，对转化部分进行显微观察，发现钨粒附近的
部分细胞中部出现较为明显的红色色素的积累(图
6C;图6D;图6E)。
三色堇 VwMYB8基因的克隆及其在月季中的瞬时表达分析
Cloning of VwMYB8 Gene from viola × wittrikianan Gams. and its Transient Expression in Rose 846
分子植物育种
Molecular Plant Breeding
图 7瞬时表达材料 PCR检测
注: M: D2000 Marker; 1: 18 S引物扩增未转化材料; 2: 18 S扩
增转化材料; 3: VwMYB8引物扩增未转化材料; 4: VwMYB8扩
增转化材料
Figure 7 PCR analysis of transient expression material
Note: M: D2000 Marker, 1: PCR amplified with 18 S primers in
Non-transgenic materials; 2: PCR amplified with 18 S primers in
transgenic materials; 3: PCR amplified with VwMYB8 primers in
Non-transgenicmaterials; 4: PCR amplified with VwMYB8 primers
in transgenic materials
图 4表达载体 pXCS-VwMYB8构建示意图
Figure 4 Schemes of pXCS-VwMYB8 vector
图 5 pXCS-VwMYB8酶切验证
注: M: DL2000 Marker; 1,2:重组质粒酶切检测
Figure 5 pXCS-VwMYB8 vector verified by digestion
Note: M: DL2000 Marker; 1,2: Fragments of digestion
图 6 VwMYB8月季花瓣的瞬时表达
注: A:未转化月季细胞; B: pXCS-HAStrep载体转化月季花瓣
细胞; C,D,E: pXCS-VwMYB8转化月季细胞 bar=100 μm
Figure 6 Transient expression ofVwMYB8 inChineseRose flower
Note: A: Non-transgenic cells of rose; B: Transient expression of
pXCS-HAStrep vector in cells of rose; C,D,E: pXCS-VwMYB8
transient expression bar=100 μm
1.6瞬时表达材料的 PCR检测
分别以未转化和转化的月季花瓣为材料提取总
RNA (谢吉容等, 2007)，逆转录为 cDNA 后以引物
18S-FTCAACCATAAACGATGCCGACC，18S-R TT
TCAGCCTTGCGACCATACTCC 以及特异性引物
VwMYB8-RT-qPCR-F，VwMYB8-RT-qPCR-R扩增，
18S引物扩增均有条带(图 7)，特异引物对未转化材
料 cDNA扩增没有目的条带，泳道 4为瞬时表达材
料中 VwMYB8条带，说明目的基因 VwMYB8在该月
季花瓣中有表达，因其表达量低导致条带亮度较低。
2讨论
MYB转录因子在植物中的功能同样多种多样，
可参与植物表皮细胞分化、气孔细胞运动、黄酮类化
合物(黄烷酮,花青苷和原花青苷)生物合成调控、抵
御冷害和干旱、糖响应和抗真菌感染等生命进程
(Feller et al., 2011)。已在多种观赏植物中验证 MYB
转录因子对花青素合成的调控作用。本研究中对
VwMYB8基因氨基酸与模式植物拟南芥中所有已知
的 MYB 转录因子进行 clustal W 比对，发现其与
AtMYB4的同源性最高(59%)。已知 AtMYB4起抑制
肉桂酸-4-羟化酶基因(C4H)表达的作用，促进提高
叶片中芥子酸酯的含量，对花青素的调控起到负调
控作用(Jin et al., 2000)。此外，与 VwMYB8基因氨基
酸与其亲缘关系较近的苹果MdMYB6 (Gaoetal., 2011)，
葡萄 VvMYB4a (Pérez-Díaz et al., 2015)，也起着相似
的负调控作用，暗示该基因似乎也应对 C4H起着负
调控作用。然而本研究结果表明，在月季花瓣中，瞬
时表达的细胞颜色加深，VwMYB8基因起到了正调
控的作用，这与其氨基酸序列相似性最高的可可中
TcMYB113 对花色的正调控作用比较一致 (Mota-
mayor et al., 2013) (图 3)。值得注意的是，红色色素积
847
图 8三色堇‘梦蝶’以及月季‘粉扇’
注: A:完整的花蕾; B:对应于 A花瓣形态解剖结构; C:月季
Figure 8 Pansy‘Mengdie’, Rosa‘Fenshan’
Note: A for full bud; B: morphological and anatomy structure of
petal corresponding to A; C: Rosa Chinensis Jacq
累集中于细胞中部细胞核位置，而周边的颜色减淡，
这可能与 VwMYB8在细胞中的亚定位与表达范围模
式有关，需要进一步通过亚细胞定位实验确认其定
位部位。因而该基因的具体调控模式与表达范围，可
以进一步转化模式植物如烟草加以验证。
月季(Rosa chinensis Jacq.)是世界四大切花之一，
具有极高的观赏价值与商品价值，利用分子手段改
良花色是其花色育种的热点。已有研究报道，通过分
子手段调节月季中 F35H基因的表达使花瓣中产生
飞燕草素，使月季花呈现出不同程度的蓝色，极大地
丰富了月季的观赏性(Mizutani et al., 2007)。本研究
采用月季作为 VwMYB8基因功能验证材料，可为将
来利用该基因改良其花色提供依据，研究的结果也
表明，该基因具有加深月季花色的潜在利用价值。
3材料与方法
3.1植物材料
实验材料使用花瓣为黄底紫斑斑的三色堇(Vio-
la × wittrockiana Gams.)‘梦蝶’，种植于海南大学园艺
园林学院基地，采摘花瓣后置于液氮中速冻，然后于
-80℃冰箱保存备用。采用粉红月季‘粉扇’(Rosa ch-
inensis Jacq.‘Pink fan’)为瞬时表达实验材料(图 8)。
3.2实验方法
3.2.1花瓣总 RNA提取
三色堇花瓣总 RNA 的提取方法采用李琴等
(2013)的改良 Trizol法。月季花瓣总 RNA的提取方
法采用谢吉容等(2007)的改良 SDS法。
3.2.2 VwMYB8基因的克隆
根据转录组测序获得的 VwMYB8基因片段，利
用 Primer Premier 5.0引物设计软件设计 3 RACE、5
RACE、全长扩增引物(表 1)。以三色堇总 RNA为模
版，根据 3-Full RACE Core Set with PrimeScriptTM R-
Tase (TaKaRa)的使用说明书合成 3 RACE的 cDNA
第一链，根据 5-Full RACE Kit with TAP (TaKaRa)的
使用说明书合成 5 RACE的 cDNA第一链，然后利
用巢式 PCR对 VwMYB8进行 3和 5末端的快速扩
增。在获得 MYB基因完整 3末端和 5末端序列后，
利用 DNAMAN等软件进行序列拼接，从而得到全
长序列，再根据获得的序列设计全长引物，PCR扩
增，参照快捷型琼脂糖 DNA回收试剂盒Ⅱ型(BioT-
eke)回收凝胶中的目的基因，用 pMD18-T Vector进
行 TA克隆，送上海英潍捷基贸易有限公司(Therm
ofisher, Shanghai, China)测序。
3.2.3 VwMYB8基因生物信息学分析
在获得 MYB基因 cDNA序列后，利用 NCBI中
Blast在线分析软件进行两两序列比对，进而验证该
序列是否为目的序列；通过 ORF Finder在线软件分
析基因的开放阅读框；使用 DNAMAN 软件对
VwMYB8基因编码的氨基酸序列进行聚类分析。利
用 ExPASy中的 ProtParam软件分析MYB8蛋白质，
应用 TMHMM Server 在线软件对 MYB8 的蛋白质
跨膜结构进行分析，通过 SignalP 4.1 Server 对
MYB8的蛋白质的信号肽进行预测。
3.2.4 VwMYB8基因表达载体构建
载体 pXCS-HAStrep用于瞬时表达载体的构建。
根据 VwMYB8开放阅读框两端序列设计引物(表 2)，
并在 VwMYB8的上、下游引物分别加入 XmaⅠ(CC-
CGGG)、PstⅠ (CTGCAG)酶切位点。使用高保真的
聚合酶进行 PCR扩增，反应条件为 94℃ 5 min；94℃
30 s，57℃~60℃ 1 min，72℃ 45 s，35 个循环；72℃
10 min。PCR产物进行回收、TA克隆和测序。将含有
载体 pXCS-HAStrep的大肠杆菌菌液在 LB液体培养
基中于 37℃振荡培养 12~16 h，然后参照 E.Z.N.A.
Plasmid Mini Kit Ⅱ (OMEGA)说明书进行质粒的提
取。获得质粒后用 1.2%的琼脂糖凝胶进行电泳检测
其完整性。然后采用单酶切反应，先采用 XmaⅠ，后
采用 PstⅠ，通过两次酶切将质粒片段切开。将完全
酶切的产物进行电泳，并将目的基因的小片段和载
体的大片段切胶回收。将切胶回收的目的基因片段
和载体的大片段通过 T4 DNA连接酶进行 16℃连接
过夜，再全部转化大肠杆菌，于 LB固体培养基(Ampr)
上培养过夜。挑选白色菌于 LB培养基中 37℃振荡
培养过夜，利用表达载体特异性引物进行菌液 PCR，
挑选阳性菌液再扩大培养，提取质粒，双酶切再次检
三色堇 VwMYB8基因的克隆及其在月季中的瞬时表达分析
Cloning of VwMYB8 Gene from viola × wittrikianan Gams. and its Transient Expression in Rose 848
分子植物育种
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表 2 VwMYB8酶切引物
Table 2 The digestion primers of VwMYB8
引物名称
Primer
VwMYB8-XmaⅠ-F
VwMYB8-pstⅠ-R
引物序列(5-3)
Primer sequences (5-3)
ACTCCCGGGATGGGCAGGTCTCCTTGCTGCGAG
ACTGCTGCAGCTCCAGCCCCCTATAATCCAAAACC
测，确认得到重组载体 pXCS-VwMYB8。
3.2.5 VwMYB8瞬时表达
将粉红月季鲜花清水瓶插培养，基因枪(GJ-1000,
Scientz Biotechnology, China)用于 VwMYB8 基因的
瞬时表达验证。操作步骤参照高压气体基因枪说明
书和 Schwinn等(2006)的方法，具体步骤如下：使用
约 1mg钨粉(直径 1μm)，加入 10μL质粒，振荡 30 s，
再边振荡边加入 60 μL CaCl2 (2.5 mol/L)，振荡 30 s，
加入 24 μL亚精胺(0.1 mol/L)，漩涡振荡 1 min，冰上
放置 5 min，8 000×g离心 5 s，弃上清。加入 200 μL
70%乙醇，吹打沉淀使之悬浮，3 000 rpm离心 10 s，
弃上清，加入 200 μL无水乙醇，此步骤不要破坏沉
淀，静置 1 min后弃上清。加入 60 μL无水乙醇振
荡，使其成为悬浮液。将飞行膜置于飞行膜座中，涡
旋振荡微弹的同时吸取 10 μL液体，迅速均匀涂布
于飞行膜中心直径 1 cm位置处，待其干燥后即可使
用。粒子轰击采用的轰击参数为：压力为 8 MPa，距
离为 95 mm，真空度为-0.08 MPa。将完成转化的月
季插入水中，于长日照(16 h/8 h)、25℃条件下培养 2
天，然后在显微镜下观察转化情况，并拍照记录。提取
月季转化后花色出现深红色斑的花瓣 RNA，以未转
化花瓣为对照(Zufall and Rausher, 2003)，利用 MYB8
特殊引物进行 RT-PCR扩增验证其是否在月季花瓣
中真实表达。
作者贡献
曾媛和龚胜是本实验设计及执行人，论文初稿
表 1三色堇MYB基因 3 RACE, 5 RACE和全长扩增引物
Table 1 The MYB primers for 3 RACE, 5 RACE and full length PCR in pansy
引物名称
Primer
VwMYB8-3 RACE-Outer
VwMYB8-3 RACE-Inner
VwMYB8-5 RACE-Outer
VwMYB8-5 RACE-Inner
VwMYB8-Full-length-F
VwMYB8-Full-length-R
引物序列(5-3)
Primer sequences (5-3)
GCTCGCTCCCTAAATCCG
ATCACTCAACGAGCCACC
AGACCATTTGTTGCCAAGGAGGCTGTG
GGAGACCTGCCCATTTTTGTGTGTGTTA
ACACCCACCAAACCATATTTAT
GCAAAGGAGTAGTACTAGTTAAGAT
由曾媛完成；李婧，孙海燕，杨文汉，李霆格，赵安瑾
和梅晶晶参与实验研究的部分工作；王健为项目负
责人，指导实验设计，论文写作与修改。全体作者都
阅读并同意最终的文本。
致谢
本研究由国家自然科学基金项目(31060265)和
海南大学中西部计划学科建设项目(ZXBJH-XK008)
共同资助。
参考文献
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