全 文 ：第４３卷　第７期
２０１５年７月
西北农林科技大学学报（自然科学版）
Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｎｏｒｔｈｗｅｓｔ　Ａ＆Ｆ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ（Ｎａｔ．Ｓｃｉ．Ｅｄ．）
Ｖｏｌ．４３ Ｎｏ．７
Ｊｕｌ．２０１５
网络出版时间：２０１５－０６－１０　０８：４０ ＤＯＩ：１０．１３２０７／ｊ．ｃｎｋｉ．ｊｎｗａｆｕ．２０１５．０７．０１０
网络出版地址：ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｋｃｍｓ／ｄｅｔａｉｌ／６１．１３９０．Ｓ．２０１５０６１０．０８４０．０１０．ｈｔｍｌ
三色堇花色素合成途径中部分结构基因的
克隆及生物信息学分析
　［收稿日期］　２０１４－１２－０５
　［基金项目］　国家自然科学基金项目（３１０６０２６５，３１２６０４８８）；海南大学中西部计划学科建设项目（ＺＸＢＪＨ－ＸＫ００８）
　［作者简介］　龚　胜（１９８９－），男，四川资阳人，在读硕士，主要从事园林植物资源与遗传改良研究。Ｅ－ｍａｉｌ：１５６２１７５９１＠ｑｑ．ｃｏｍ
　［通信作者］　王　健（１９７７－），男，湖北宜昌人，副教授，博士，硕士生导师，主要从事园林植物分子生物学研究。
Ｅ－ｍａｉｌ：ｗｊｈｎａｕ＠１６３．ｃｏｍ
龚　胜，孙海燕，张　珂，曾　媛，李　婧，王　健，李新国
（海南大学 园艺园林学院，热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室，海南 海口５７０２２８）
［摘　要］　 【目的】对三色堇花色素合成的３个结构基因ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ和ＶｗＦ３　Ｈ 进行克隆以及生物信息
学分析。【方法】利用ＲＡＣＥ／ＰＣＲ技术克隆得到ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ和ＶｗＦ３　Ｈ 基因的全长序列，并通过在线分析软
件对其生物信息学进行分析。【结果】获得ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ和ＶｗＦ３　Ｈ 的ｃＤＮＡ全长分别是１　４８１，９７５和１　３６１
ｂｐ；经多重序列比对发现这３个基因编码的氨基酸与其他植物相关氨基酸一致性较高，主要集中在６２％～９０％，并且
在ＣＨＳ氨基酸序列中有４个催化活性位点（Ｃｙｓ１７１、Ｐｈｅ２２２、Ｈｉｓ３１０、Ａｓｎ３４３），在ＣＨＩ氨基酸序列中有４个催化活性位点
（Ｔｈｒ５０、Ｔｙｒ１０８、Ａｓｎ１１５、Ｓｅｒ１９２），在ＶｗＦ３Ｈ氨基酸序列中有５个催化活性位点（Ａｓｐ２１８、Ｈｉｓ２５３、Ａｒｇ２１５、Ａｒｇ２８４、Ｓｅｒ２８６）；
ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ、ＶｗＦ３Ｈ的蛋白质分子量分别为９．９１，５．３７，４．１ｋｕ，等电点为５．０２，５．１６，５．４４；二级结构预测发
现，ＶｗＣＨＳ和ＶｗＣＨＩ二级结构主要是α螺旋，分别占４３．３９％和４１．８９％，ＶｗＦ３Ｈ的蛋白质二级结构主要是无规
则卷曲，占４２．３０％；聚类分析发现ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ和ＶｗＦ３Ｈ分别归属于各自的聚类簇。【结论】ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ
和ＶｗＦ３Ｈ是不存在信号肽的非跨膜蛋白。
［关键词］　三色堇；查尔酮合成酶（ＣＨＳ）；查尔酮异构酶（ＣＨＩ）；黄烷酮－３－羟化酶（Ｆ３Ｈ）；生物信息学；基因克隆
［中图分类号］　Ｑ７８５ ［文献标志码］　Ａ ［文章编号］　１６７１－９３８７（２０１５）０７－０１３３－１０
Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ｔｈｒｅｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｇｅｎｅｓ
ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　Ｖｉｏｌａ×ｗｉｔｒｏｃｋｉａｎａ
ＧＯＮＧ　Ｓｈｅｎｇ，ＳＵＮ　Ｈａｉ－ｙａｎ，ＺＨＡＮＧ　Ｋｅ，ＺＥＮＧ　Ｙｕａｎ，
ＬＩ　Ｊｉｎｇ，ＷＡＮＧ　Ｊｉａｎ，ＬＩ　Ｘｉｎ－ｇｕｏ
（Ｋｅｙ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　ｏｆ　Ｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎ　ａｎｄ　Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ　Ｕｔｉｌｉｚａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｔｒｏｐｉｃａｌ　Ｃｒｏｐ　Ｇｅｒｍｐｌａｓｍ　Ｒｅｓｏｕｒｃｅｓ，Ｍｉｎｉｓｔｒｙ　ｏｆ　Ｅｄｕｃａｔｉｏｎ，
Ｃｏｌｌｅｇｅ　ｏｆ　Ｈｏｒｔｉｃｕｌｔｕｒｅ　＆Ｌａｎｄｓｃａｐｅ　Ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ，Ｈａｉｎａｎ　Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｈａｉｋｏｕ，Ｈａｉｎａｎ５７０２２８，Ｃｈｉｎａ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ：【Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ】Ｃｌｏｎｉｎｇ　ａｎｄ　ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗｅｒｅ　ｃｏｎｄｕｃｔｅｄ　ｆｏｒ　ｔｈｒｅｅ　ｇｅｎｅｓ，ＶｗＣＨＳ，
ＶｗＣＨＩ　ａｎｄ　ＶｗＦ３　Ｈ，ｗｈｉｃｈ　ａｒｅ　ｉｎｖｏｌｖｅｄ　ｉｎ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ｏｆ　ｐａｎｓｙ．【Ｍｅｔｈｏｄ】Ｔｈｅ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤ－
ＮＡ　ｏｆ　ＶｗＣＨＳ，ＶｗＣＨＩ　ａｎｄ　ＶｗＦ３　Ｈ ｗｅｒｅ　ｃｌｏｎｅｄ　ｂｙ　ＲＡＣＥ／ＰＣＲ，ａｎｄ　ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｗａｓ　ｃａｒｒｉｅｄ
ｏｕｔ　ｔｈｒｏｕｇｈ　ｏｎｌｉｎｅ　ｓｏｆｔｗａｒｅ．【Ｒｅｓｕｌｔ】Ｔｈｅ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｏｆ　ＶｗＣＨＳ，ＶｗＣＨＩ　ａｎｄ　ＶｗＦ３　Ｈｗｅｒｅ　１　４８１，
９７５ａｎｄ　１　３６１ｂｐ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｓｅｑｕｅｎｃｅ　ａｌｉｇｎｍｅｎｔ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｅｎｃｏｄｅｄ　ｂｙ　ｔｈｅ
ｔｈｒｅｅ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｇｅｎｅｓ　ｈａｄ　ｈｉｇｈ　ｉｄｅｎｔｉｔｙ　ｃｏｍｐａｒｅｄ　ｔｏ　ｏｔｈｅｒ　ｐｌａｎｔｓ（６２％－９０％）．Ｔｈｅｒｅ　ｗｅｒｅ　ｆｏｕｒ　ａｃｔｉｖｅ
ｓｉｔｅｓ（Ｃｙｓ１７１，Ｐｈｅ２２２，Ｈｉｓ３１０，ａｎｄ　Ａｓｎ３４３）ｉｎ　ｔｈｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＣＨＳ，ｆｏｕｒ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｉｔｅｓ（Ｔｈｒ５０，
Ｔｙｒ１０８，Ａｓｎ１１５，ａｎｄ　Ｓｅｒ１９２）ｉｎ　ＣＨＩ，ａｎｄ　ｆｉｖｅ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｉｔｅｓ（Ａｓｐ２１８，Ｈｉｓ２５３，Ａｒｇ２１５，Ａｒｇ２８４，ａｎｄ　Ｓｅｒ２８６）ｉｎ　Ｆ３Ｈ．
Ｔｈｅｉｒ　ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｗｅｉｇｈｔｓ　ｗｅｒｅ　９．９１，５．３７ａｎｄ　４．１ｋｕ，ａｎｄ　ｔｈｅｉｒ　ｐＩ　ｖａｌｕｅｓ　ｗｅｒｅ　５．０２，５．１６ａｎｄ　５．４４，ｒｅｓｐｅｃ－
ｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ　ｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎ　ｒｅｖｅａｌｅｄ　ｔｈａｔ　ｔｈｅ　ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ＶｗＣＨＳ　ａｎｄ　ＶｗＣＨＩ
ｐｒｏｔｅｉｎ　ｍａｉｎｌｙ　ｃｏｎｔａｉｎｅｄαｈｅｌｉｘ　ｗｉｔｈ　ｒａｔｉｏｓ　ｏｆ　４３．３９％ａｎｄ　４１．８９％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｗｈｉｌｅ　ＶｗＦ３Ｈｐｒｏｔｅｉｎ
ｗａｓ　ｍａｉｎｌｙ　ｒａｎｄｏｍ　ｃｏｉｌ　ｗｉｔｈ　ａ　ｒａｔｉｏ　ｏｆ　４２．３０％．Ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｓｈｏｗｅｄ　ｔｈａｔ　ｅａｃｈ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｔｈｒｅｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ
ｂｅｌｏｎｇｅｄ　ｔｏ　ｔｈｅ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　ｆａｍｉｌｙ　ｃｌｕｓｔｅｒ．【Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ】ＶｗＣＨＳ，ＶｗＣＨＩ　ａｎｄ　ＶｗＦ３Ｈ ｗｅｒｅ
ｎｏｎ－ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅ　ｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｗｉｔｈｏｕｔ　ｓｉｇｎａｌ　ｐｅｐｔｉｄｅ．
Ｋｅｙ　ｗｏｒｄｓ：Ｖｉｏｌａ×ｗｉｔｔｒｏｃｋｉａｎａ；ｃｈａｌｃｏｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ（ＣＨＳ）；ｃｈａｌｃｏｎｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ（ＣＨＩ）；ｆｌａｖａｎｏｎｅ－３－
ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ（Ｆ３Ｈ）；ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓ　ａｎａｌｙｓｉｓ；ｇｅｎｅ　ｃｌｏｎｅ
　　花色是植物最具有吸引力的观赏性状之一，它
赋予了植物无穷的魅力。花色素是使植物呈现万千
色彩的内在原因之一，其分布于植物的细胞液泡中，
能使花呈现出橙色、红色、紫色或蓝色等。花色素的
形成与分布主要受两大类型基因的控制：一类是与
花色素形成相关的催化酶基因，即结构基因［１］；另一
类是调控催化酶基因表达的调控基因［２－４］。与花色
素形成相关的催化酶基因是花色素生物合成的基
础，２０世纪８０年代末至９０年代初，植物花色素和
类黄酮物质代谢途径已研究的较为清楚［５］。花色素
的生物合成途径大致包括３个阶段：第１阶段是苯
丙氨酸以苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）、肉桂酸羟化酶
（Ｃ４Ｈ）和ＣｏＡ连接酶（４ＣＬ）为催化剂反应生成４－香
豆酰ＣｏＡ，该过程主要受ＰＡＬ基因调控；第２阶段
是４－香豆酰 ＣｏＡ 在查尔酮合成酶（ｃｈａｌｃｏｎｅ　ｓｙｎ－
ｔｈａｓｅ，ＣＨＳ）、查尔酮异构酶（ｃｈａｌｃｏｎｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ，
ＣＨＩ）、黄烷酮－３－羟化酶（ｆｌａｖａｎｏｎｅ－３－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，
Ｆ３Ｈ）的催化作用下形成二氢黄酮醇；第３阶段是花
色素的形成，该过程依次需要类黄酮－３′－羟化酶（ｆｌａ－
ｖｏｎｏｉｄ－３′－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，Ｆ３′Ｈ）、类黄酮－３′，５′－羟化
酶（ｆｌａｖｏｎｏｉｄ－３′，５′－ｈｙｄｒｏｘｙｌａｓｅ，Ｆ３′５′Ｈ）、二羟基黄
酮醇４－还原酶（ｄｉｈｙｄｒｏｆｌａｖｏｎｏｌ－４－ｒｅｄｕｃｔａｓｅ，ＤＦＲ）、
花青素合成酶（Ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｄｉｎ　ｓｙｎｔｈａｓｅ，ＡＮＳ）等为
催化剂［６－７］。在花青素生物合成途径中，第２阶段的
催化酶ＣＨＳ、ＣＨＩ和Ｆ３Ｈ为形成有色化合物所必需。
植物的花斑是花色素在某个特定区域的积累，
它直接影响植物的观赏价值，而了解花斑形成机理
对于观赏植物的花色育种有着十分重要的意义。以
色斑区域色素合成催化酶基因的特异性表达作为研
究花斑机理的着手点无疑为花斑机理研究提供了一
个新的方向。三色堇（Ｖｉｏｌａ×ｗｉｔｔｒｏｃｋｉａｎａ）是堇菜
科堇菜属的一二年生花卉，其花色艳丽，花期长，为
冬季花坛、花境及盆花等常用花卉，近年来在我国得
到了大量园林应用。三色堇花瓣色斑区域较大，色
斑区与非色斑区界线比较明显，它的花斑遗传规律
和花色组成研究基础较好，是研究花斑机理的理想
模式植物［８］。目前关于花色素生物合成途径中催化
酶基因ＣＨＳ、ＣＨＩ和Ｆ３　Ｈ 的研究很多，如将反义
ＣＨＳ基因转入矮牵牛中，从而抑制其花色素的合
成，进而获得白花植株［９］；利用ＲＮＡｉ技术抑制烟草
（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃｕｍ）内源基因ＣＨＩ转录，使其花
瓣颜色发生了改变［１０］；以反义抑制法抑制Ｆ３　Ｈ 基
因表达，获得的转基因植株花色发生了不同程度的
改变［１１］。但是在三色堇中关于ＣＨＳ、ＣＨＩ和Ｆ３　Ｈ
基因的研究却未见报道。
生物信息学是包含了生物信息的获取、处理、储
存、分析和解释等在内所有方面的一门交叉学科，它
以核酸和蛋白质数据库为研究对象，利用计算机、数
学等手段对原始数据进行处理、储存、分析和解释，
目的在于了解和阐明大量生物学数据所包含的生物
学意义［１２］。生物信息学的诞生为更快捷地对已知
的核酸和蛋白质序列进行比对、分析、建立计算模型
以及对蛋白质组结构与功能进行预测奠定了基
础［１３］。
本研究利用简并引物扩增保守区域后使用
ＲＡＣＥ技术扩增３′末端及５′末端，进而获得三色堇
花色素合成相关的３个结构基因的全长序列，即
ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ 和ＶｗＦ３　Ｈ，再结合生物信息学
的方法对这３个结构基因的核酸序列和编码氨基酸
序列进行结构和功能的分析、预测，以期为三色堇花
斑形成机理的研究奠定基础。
１　材料与方法
１．１　材　料
试验材料为花色黄底黑斑三色堇（Ｖｉｏｌａ×ｗｉｔ－
ｔｒｏｃｋｉａｎａ）‘宾哥’系列，种植于海南大学园艺园林学
院基地。将花瓣采摘后迅速置入液氮中速冻，然后
置于－７０℃冰箱保存备用。
１．２　方　法
三色堇花瓣总 ＲＮＡ 的提取采用改良 Ｔｒｉｚｏｌ
法［１４］。提取完成后的总ＲＮＡ用１．２％的琼脂糖凝
胶电泳检测。
４３１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷
１．２．１　结构基因ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ、ＶｗＦ３　Ｈ 的扩
增　根据其他植物相关氨基酸序列获得保守区域
后，设计简并引物（表１）。以三色堇总 ＲＮＡ为模
板，参照ＴｒａｎｓＳｃｒｉｐｔ　ＴＭⅡＯｎｅ－Ｓｔｅｐ　ｇＤＮＡ　Ｒｅｍｏｖａｌ
ａｎｄ　ｃＤＮＡ　Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ　ＳｕｐｅｒＭｉｘ （ＴｒａｎｓＧｅｎ，Ｂｅｉ－
ｊｉｎｇ）说明书进行ｃＤＮＡ第一链合成，并以ｃＤＮＡ第
一链为反应模板扩增３个结构基因的保守区域。
ＰＣＲ反应体系为：３μＬ 第一链ｃＤＮＡ，４μＬ　ｅａｃｈ
ｐｒｉｍｅｒ（１０μｍｏｌ／Ｌ），５μＬ　１０×ＰＣＲ　ｂｕｆｆｅｒ，４μＬ
２５ｍｍｏｌ／Ｌ　ＭｇＣｌ２，４μＬ　２．５ｍｍｏｌ／Ｌ　ｄＮＴＰ　Ｍｉｘ－
ｔｕｒｅ，０．８μＬ　Ｅｘ　Ｔａｑ（５Ｕ／μＬ，Ｔａｋａｒａ，Ｃｈｉｎａ）和
２５．２μＬ　ｄｄＨ２Ｏ。ＰＣＲ扩增循环参数为：９４ ℃ ５
ｍｉｎ；９４℃３０ｓ，５２～５７℃４５ｓ，７２℃１ｍｉｎ，４０个
循环；７２℃１０ｍｉｎ。
表１　扩增ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ、ＶｗＦ３　Ｈ 基因保守区域的简并引物序列
Ｔａｂｌｅ　１　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅｄ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ　ｔｈｅ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｒｅｇｉｏｎ　ｏｆ　ＶｗＣＨＳ，ＶｗＣＨＩ，ａｎｄ　ＶｗＦ３　Ｈ
基因
Ｇｅｎｅ
上游引物 （５′→３′）
Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ
下游引物（５′→３′）
Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ
ＶｗＣＨＳ　 ＹＣＡＲＣＡＲＧＧＮＴＧＹＴＴＹＧＣ　 ＧＧＲＴＧＮＧＣＤＡＴＣＣＡＲＡＡＣ
ＶｗＣＨＩ　 ＧＴＴＣＡＣＧＧＣＧＡＴＴＧＧＴＧＴＡＴＡＣ　 ＡＴＣＡＴＧＧＡＣＴＣＣＡＧＴＡＴＴＧＣＣＴＣ
ＶｗＦ３　Ｈ　 ＧＴＳＣＡＲＧＡＹＴＧＧＭＧＮＧＡＲＡＴＨＧＴＶＡＣ　 ＧＣＹＴＧＲＴＧＲＴＣＨＧＣＲＴＴＣＴＴＧＡＡＢＣ
　　利用保守区域序列设计３′ＲＡＣＥ和５′ＲＡＣＥ
扩增的特异性引物（表２）。以三色堇总ＲＮＡ为模
板，参照 ＳＭＡＲＴＴＭ　ｒａｃｅ　ｃＤＮＡ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｋｉｔ
（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ，Ｓｈａｎｇｈａｉ）说明书进行３′ＲＡＣＥ 和５′
ＲＡＣＥ扩增。获得全长序列后，以其开放阅读框设
计全长扩增特异性引物（表３），进行ｃＤＮＡ全长扩
增。
表２　ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ、ＶｗＦ３　Ｈ 基因３′和５′末端ＲＡＣＥ引物序列
Ｔａｂｌｅ　２　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　３′ＲＡＣＥ　ａｎｄ　５′ＲＡＣＥ　ｏｆ　ＶｗＣＨＳ，ＶｗＣＨＩ，ａｎｄ　ＶｗＦ３　Ｈ
基因
Ｇｅｎｅ
位置
Ｐｏｓｉｔｉｏｎ
３′－ＲＡＣＥ引物 （５′→３′）
３′－ＲＡＣＥ　ｐｒｉｍｅｒ
５′－ＲＡＣＥ引物（５′→３′）
５′－ＲＡＣＥ　ｐｒｉｍｅｒ
ＶｗＣＨＳ 外侧 Ｏｕｔｅｒ　 ＴＴＣＣＡＴＴＴＧＣＴＧＡＡＡＧＡＴＧＴＡＣＣ　 ＣＡＣＣＧＴＣＴＣＣＧＡＡＣＡＧＣＧ
内侧Ｉｎｎｅｒ　 ＡＡＧＴＣＣＣＴＧＧＴＴＧＡＧＧＣＡＴＴ　 ＧＧＡＣＴＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＴＧＴＴＧＴＴ
ＶｗＣＨＩ 外侧 Ｏｕｔｅｒ　 ＣＣＣＴＣＣＴＧＧＣＴＣＣＴＣＴＡＴＴＣ　 ＡＧＴＣＡＡＡＧＧＣＴＡＧＡＴＣＡＴＴＧＴＣＡＣ
内侧Ｉｎｎｅｒ　 ＴＡＣＧＣＡＡＡＣＡＣＣＴＣＴＴＧＧＡＡＣ　 ＣＴＧＡＧＣＧＧＴＡＴＣＣＴＣＣＡＡＧＴＡ
ＶｗＦ３　Ｈ 外侧 Ｏｕｔｅｒ　 ＴＣＴＴＣＡＧＧＣＴＡＣＣＡＡＧＧＡＴＡＡＣＡ　 ＧＴＡＣＴＣＣＴＴＴＧＴＣＡＣＧＴＣＴＡＴＣＣＡＴ
内侧Ｉｎｎｅｒ　 ＴＣＡＡＧＡＡＣＧＣＡＧＡＣＣＡＴＣＡＡＧ　 ＧＧＧＡＡＴＴＧＧＧＴＡＴＧＡＧＡＡＧＴＡＴＧＴ
表３　ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ、ＶｗＦ３　Ｈ 基因ｃＤＮＡ全长扩增引物序列
Ｔａｂｌｅ　３　Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｐｒｉｍｅｒｓ　ｆｏｒ　ａｍｐｌｉｆｙｉｎｇ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡｓ　ｏｆ　ＶｗＣＨＳ，ＶｗＣＨＩ，ａｎｄ　ＶｗＦ３　Ｈ
基因
Ｇｅｎｅ
上游引物 （５′→３′）
Ｆｏｒｗａｒｄ　ｐｒｉｍｅｒ
下游引物（５′→３′）
Ｒｅｖｅｒｓｅ　ｐｒｉｍｅｒ
ＶｗＣＨＳ　 ＧＧＴＡＣＡＧＣＣＡＣＡＣＣＴＣＣＡＡＡＣ　 ＣＴＣＣＡＧＣＡＧＴＴＴＧＣＣＣＴＡＴＴＡＴＴ
ＶｗＣＨＩ　 ＧＧＧＧＴＣＣＡＧＴＡＡＴＣＡＧＣＴＴＣ　 ＣＴＣＴＧＴＡＴＣＴＧＴＴＣＣＡＡＴＡＡＧＴＧＣ
ＶｗＦ３　Ｈ　 ＣＣＡＧＣＣＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣＡＣＡ　 ＡＧＣＡＡＡＴＴＡＡＡＴＡＴＡＡＡＣＧＣＡＧＣ
１．２．２　扩增片段的克隆及生物信息学分析　利用
１．６％琼脂糖凝胶电泳对ＰＣＲ产物进行纯化，并用
琼脂糖凝胶ＤＮＡ回收试剂盒（中科瑞泰）回收特异
性条带，再连接ｐＭＤ１８－Ｔ　Ｓｉｍｐｌｅ　ｖｅｃｔｏｒ（Ｔａｋａｒａ，
Ｓｈａｎｇｈａｉ），转化大肠杆菌ＤＨ５α感受态细胞，进行
蓝白斑筛选，挑取白色菌落摇菌培养，最后利用
Ｍ１３引物进行ＰＣＲ扩增，检测连接状况。ＰＣＲ扩
增循环参数为：９５℃１０ｍｉｎ；９５℃４５ｓ，５５℃４５ｓ，
７２℃１ｍｉｎ，３５个循环；７２℃１０ｍｉｎ。将结果为阳
性的菌液送往上海生工生物技术有限公司进行测
序。
获得序列后，利用 ＮＣＢＩ的ＢＬＡＳＴ软件分析
比对序列，验证所得序列是否为目的基因序列；利用
ＯＦＲ　Ｆｉｎｄｅｒ在线分析软件分析开放阅读框；利用
ＤＮＡＭＡＮ　６．０或ＣｌｕｓｔａｌＷ　２软件将其与其他物种
同源序列进行多重序列比对和系统进化分析；使用
Ｅｘｐａｓｙ和ＴＭＨＭＭ　Ｓｅｒｖｅｒ　ｖ．２．０相关在线分析软
件，对编码蛋白的结构特点和基本性质进行综合预
测分析。
２　结果与分析
２．１　三色堇花瓣总ＲＮＡ的提取
经改良Ｔｒｉｚｏｌ法提取的三色堇花瓣总ＲＮＡ利
用琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，结果如图１所示，
ＲＮＡ条带清晰，２８Ｓ与１８Ｓ条带亮度接近２∶１，说
明总ＲＮＡ完整性好，点样孔无残留，表明纯度高，
可以用于后续试验。
５３１第７期 龚　胜，等：三色堇花色素合成途径中部分结构基因的克隆及生物信息学分析
图１　三色堇花瓣总ＲＮＡ电泳结果
Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１～２．总ＲＮＡ
Ｆｉｇ．１　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ　ｆｏｒ　ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ　ｏｆ　ｐｅｔａｌｓ　ｉｎ　ｐａｎｓｙ
Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１－２．Ｔｏｔａｌ　ＲＮＡ
２．２　三色堇花色素合成中３个结构基因的扩增与
克隆
首先，通过ＲＴ－ＰＣＲ技术，从三色堇花瓣中扩
增得到３个结构基因的部分片段，经 ＢＬＡＳＴ 比
对后，分别获得ＣＨＳ（４３２ｂｐ）、ＣＨＩ（４３８ｂｐ）和
Ｆ３　Ｈ（４６１ｂｐ）基因的保守区域（图２）。其次，利用
ＲＡＣＥ技术，从三色堇花瓣中扩增得到ＣＨＳ（５４４
ｂｐ）、ＣＨＩ（４７０ｂｐ）和Ｆ３　Ｈ（５２１ｂｐ）基因的３′末端
序列（图３），以及ＣＨＳ（６５６ｂｐ）、ＣＨＩ（２２７ｂｐ）和
Ｆ３　Ｈ（４７４ｂｐ）基因的５′末端序列（图４）。最后，将
扩增得到的３个结构基因的中间片段、３′末端ｃＤ－
ＮＡ序列及５′末端ｃＤＮＡ序列利用ＤＮＡＭＡＮ　６．０
软件拼接后，分别获得ＣＨＳ、ＣＨＩ、Ｆ３　Ｈ 基因的
ｃＤＮＡ全长序列，用全长引物进行全长扩增得到
ＣＨＳ（１　４８１ｂｐ）、ＣＨＩ（９７５ｂｐ）、Ｆ３　Ｈ（１　３６１ｂｐ）
（图５）。
图２　ＣＨＳ、ＣＨＩ、Ｆ３　Ｈ 基因保守区域电泳结果
Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１～２．ＣＨＳ；３～４．ＣＨＩ；５～６．Ｆ３　Ｈ
Ｆｉｇ．２　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ　ｆｏｒ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｒｅｇｉｏｎｓ　ｏｆ　ＣＨＳ，ＣＨＩａｎｄ　Ｆ３Ｈ
图３　ＣＨＳ、ＣＨＩ、Ｆ３　Ｈ 基因３′ＲＡＣＥ电泳结果
Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１．ＣＨＳ；２．ＣＨＩ；３．Ｆ３　Ｈ
Ｆｉｇ．３　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ　ｆｏｒ　３′ＲＡＣＥ　ｏｆ　ＣＨＳ，ＣＨＩａｎｄ　Ｆ３Ｈ
图４　ＣＨＳ、ＣＨＩ、Ｆ３　Ｈ 基因５′ＲＡＣＥ电泳结果
Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１．ＣＨＳ；２．ＣＨＩ；３．Ｆ３　Ｈ
Ｆｉｇ．４　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ　ｆｏｒ　５′ＲＡＣＥ　ｏｆ　ＣＨＳ，ＣＨＩａｎｄ　Ｆ３　Ｈ
６３１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷
图５　ＣＨＳ、ＣＨＩ、Ｆ３　Ｈ 基因全长扩增电泳结果
Ｍ．ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ；１．ＣＨＳ；２．ＣＨＩ；３．Ｆ３　Ｈ
Ｆｉｇ．５　Ｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｔｏｇｒａｍ　ｆｏｒ　ｆｕｌ－ｌｅｎｇｔｈ　ｃＤＮＡ　ｏｆ　ＣＨＳ，ＣＨＩａｎｄ　Ｆ３　Ｈ
２．３　三色堇花色素合成中３个结构基因的生物信
息学分析
经分离获得３个三色堇花色素合成相关的结构
基因，即ＶｗＣＨＳ（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为 ＫＪ４６３６２０）、
ＶｗＣＨＩ （ＧｅｎＢａｎｋ登录号为 ＫＪ４６３６１９）、ＶｗＦ３　Ｈ
（ＧｅｎＢａｎｋ登录号为ＫＪ４６３６２２）。
２．３．１　ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ和ＶｗＦ３　Ｈ 基因的核苷
酸序列分析　利用ＢＬＡＳＴ在线分析软件，将三色
堇ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ 和ＶｗＦ３　Ｈ 基因的核苷酸序
列进行同源性分析，发现这３个基因与其他植物相
关基因的核苷酸序列相似性均超过６９％。而 ＯＲＦ
Ｆｉｎｄｅｒ在线分析软件分析得到ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ
和ＶｗＦ３　Ｈ 基因的开放阅读框的长度依次是１　２１２
ｂｐ（７７－１　２８８）、６５１ｂｐ（４５－６９５）和１　０９８ｂｐ（３５－
１　１３２），并分别编码４０３，２１６和３６５个氨基酸。
２．３．２　ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ和 ＶｗＦ３Ｈ 蛋白质分析
　（１）蛋白质一级结构分析。将ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ
和ＶｗＦ３　Ｈ 编码的氨基酸序列进行多重序列比对，
发现这３个基因编码的氨基酸与其他植物相关氨基
酸的一致性较高，主要集中在６２％～９０％（表４）。
表４　三色堇花色素合成中结构基因编码的氨基酸与其他植物相关氨基酸的比较
Ｔａｂｌｅ　４　Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ｄｅｄｕｃｅｄ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ａｎｔｈｏｃｙａｎｉｎ　ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｔｉｃ　ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ　ｇｅｎｅｓ　ｆｏｒ
ｐａｎｓｙ（Ｖｉｏｌａ×ｗｉｔｔｒｏｃｋｉａｎａ）ａｎｄ　ｏｔｈｅｒ　ｓｐｅｃｉｅｓ
基因
Ｇｅｎｅ
其他物种 Ｏｔｈｅｒ　ｓｐｅｃｉｅｓ
名称
Ｎａｍｅ
蛋白质
Ｐｒｏｔｅｉｎ
登录号
Ａｃｃｅｓｓｉｏｎ　Ｎｏ．
一致性／％
Ｉｄｅｎｔｉｔｙ
陆地棉Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ　 ＧｈＣＨＳ　 ＡＥＯ９６９８５．１　 ９０
葡萄Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ　 ＶｖＣＨＳ　 ＢＡＡ３１２５９．１　 ９０
ＣＨＳ 毛果杨Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ ＰｔＣＨＳ　 ＸＰ００２３２１０８１．１　 ８８
康乃馨Ｄｉａｎｔｈｕｓ　ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ　 ＤｃＣＨＳ　 ＣＡＡ９１９２３．１　 ８０
圆叶牵牛Ｉｐｏｍｏｅａ　ｐｕｒｐｕｒｅａ　 ＩｐＣＨＳ　 Ｐ４８３９７．１　 ６５
毛果杨Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ ＰｔＣＨＩ　 ＸＰ００２３１５２５８．１　 ７７
陆地棉Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ　 ＧｈＣＨＩ　 Ａ２ＩＢＦ８．１　 ７２
ＣＨＩ 康乃馨Ｄｉａｎｔｈｕｓ　ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ　 ＤｃＣＨＩ　 Ｑ４３７５４．１　 ６７
大豆Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ　 ＧｍＣＨＩ　 ＡＣＵ１３６８０．１　 ６４
拟南芥Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ　 ＡｔＣＨＩ　 ＣＡＢ９４９７０．１　 ６２
陆地棉Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ　 ＧｈＦ３Ｈ ＡＢＭ６４７９９．１　 ８９
毛果杨Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ ＰｔＦ３Ｈ ＡＢＫ９４７５７．１　 ８７
Ｆ３　Ｈ 葡萄Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ　 ＶｖＦ３Ｈ ＣＡＮ６１９５１．１　 ８６
康乃馨Ｄｉａｎｔｈｕｓ　ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ　 ＤｃＦ３Ｈ Ｑ０５９６４．１　 ８０
玉米Ｚｅａ　ｍａｙｓ ＺｍＦ３Ｈ ＮＰ００１１０５６９５．１　 ７３
　　三色堇ＣＨＳ基因编码的氨基酸序列具有ＣＨＳ
发挥作用所必需的高度保守的催化活性位点Ｃｙｓ１７１、
Ｐｈｅ２２２、Ｈｉｓ３１０和Ａｓｎ３４３，其中Ｃｙｓ是香豆酰辅酶Ａ的
结合位点，并且还具有ＣＨＳ特别保守的信号序列
ＧＦＧＰＧ，此外，在三色堇ＣＨＳ基因编码的氨基酸序
列的１６３－１７９氨基酸（ＲＬＭＭＹＱＱＧＣＦＡＧＧＴＶＬＲ）
为查尔酮合成酶的活性位点（图６）。在三色堇ＣＨＩ
基因编码的氨基酸序列中，Ｔｈｒ５０、Ｔｙｒ　１０８、Ａｓｎ１１５和
Ｓｅｒ１９２为ＣＨＩ必需的活性位点，而其中Ｔｈｒ能催化黄
酮醇底物中的酮基极性化（图７－Ａ）。在Ｆ３Ｈ氨基酸
序列中，氨基酸残基Ａｓｐ２１８和 Ｈｉｓ２５３是与铁离子结合
位点，而Ａｒｇ２１５、Ａｒｇ２８４和Ｓｅｒ２８６位点与２－酮戊二酸结
７３１第７期 龚　胜，等：三色堇花色素合成途径中部分结构基因的克隆及生物信息学分析
合（ＲＸＳ基序），这些位点在不同物种的Ｆ３Ｈ氨基酸 序列中都高度保守［１５－１７］（图７－Ｂ）。
图６　三色堇ＣＨＳ蛋白与其他植物相关氨基酸的多重比对
Ｐｏｐｕｌｕｓ．毛果杨；Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ．陆地棉；Ｖｉｔｉｓ．葡萄；Ｄｉａｎｔｈｕｓ．康乃馨；横线为ＣＨＳ蛋白活性位点；
“★”为组成活性位点的残基和丙二酰辅酶Ａ结合位点
Ｆｉｇ．６　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＶｗＣＨＳ　ｗｉｔｈ　ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｏｔｈｅｒ　ｓｐｅｃｉｅｓ
Ｐｏｐｕｌｕｓ．Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ．Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ；Ｖｉｔｉｓ．Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ；Ｄｉａｎｔｈｕｓ．Ｄｉａｎｔｈｕｓ　ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ；
Ｓｏｌｉｄ　ｌｉｎｅ　ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｉｔｅ　ｏｆ　ｃｈａｌｃｏｎｅ　ｓｙｎｔｈａｓｅ；“★”ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｔｈａｔ　ｃｏｎｎｅｃｔ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｉｔｅ　ａｎｄ　ｍａｌｏｎｙｌ－ＣｏＡ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｉｔｅ
　　利用Ｅｘｐａｓｙ在线分析软件预测蛋白质的基本
理化性质，结果发现 ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ、ＶｗＦ３Ｈ 的
蛋白分子量分别为９．９１，５．３７，４．１ｋｕ，等电点分别
为５．０２，５．１６，５．４４。
通过ＴＭＨＭＭ　Ｓｅｒｖｅｒ　ｖ．２．０在线分析软件，
对ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ和ＶｗＦ３Ｈ的蛋白质进行跨膜
结构预测，结果表明三色堇中这３个蛋白质整条肽
链都位于细胞膜外，说明它们都不存在跨膜结构。
利用ｓｉｇｎａｌｐ　４．１ｓｅｒｖｅｒ软件分析 ＶｗＣＨＳ、
ＶｗＣＨＩ和 ＶｗＦ３Ｈ 的蛋白质序列，发现它们的
ｍｅａｎ－ｓ分值分别为０．１１１，０．１０３和０．１４７，均小于
０．５，说明不存在信号肽序列。
（２）蛋白质二级结构预测。通过ＳＯＰＭＡ在线
软件对蛋白质的二级结构进行预测，获得了三色堇
ＣＨＳ、ＣＨＩ和Ｆ３Ｈ蛋白质二级结构的α螺旋、β转
角、延伸链以及无规则卷曲的组成（表５）。
２．３．３　ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ和ＶｗＦ３　Ｈ 基因编码氨
基酸序列的聚类分析　经过聚类分析发现，三色堇
花瓣中的ＶｗＣＨＳ、ＶｗＣＨＩ和ＶｗＦ３Ｈ蛋白都分别
归属于各自的聚类簇，并且ＶｗＣＨＳ与康乃馨（Ｄｉ－
ａｎｔｈｕｓ　ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ）的ＤｃＣＨＳ蛋白质亲缘关系较
近，ＶｗＣＨＩ与毛果杨（Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ）的ＰｔＣＨＩ
蛋白质亲缘关系较近，ＶｗＦ３Ｈ与陆地棉（Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ
ｈｉｒｓｕｔｕｍ）的ＧｈＦ３Ｈ蛋白质亲缘关系较近（图８）。
８３１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷
图７　三色堇ＣＨＩ蛋白（Ａ）和Ｆ３Ｈ蛋白（Ｂ）与其他植物相关氨基酸的多重比对
Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ．陆地棉；Ｐｏｐｕｌｕｓ．毛果杨；Ｖｉｔｉｓ．葡萄；Ｄｉａｎｔｈｕｓ．康乃馨；Ｇｌｙｃｉｎｅ．大豆；横线为２－氧化戊二酸依赖型加氧酶结合位点；
“★”为氨基酸活化位点；“●”为Ａｓｐ和 Ｈｉｓ与铁离子结合位点；“▼”为Ａｒｇ和Ｓｅｒ与２－酮戊二酸结合位点
Ｆｉｇ．７　Ｍｕｌｔｉｐｌｅ　ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ　ｏｆ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ＶｗＣＨＩ（Ａ）ａｎｄ　ＶｗＦ３Ｈ（Ｂ）ｗｉｔｈ
ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｏｆ　ｏｔｈｅｒ　ｓｐｅｃｉｅｓ
Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ．Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ；Ｐｏｐｕｌｕｓ．Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；Ｖｉｔｉｓ．Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ；Ｄｉａｎｔｈｕｓ．Ｄｉａｎｔｈｕｓ　ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ；
Ｇｌｙｃｉｎｅ．Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ；Ｌｉｎｅｓ　ｉｎｄｉｃａｔｅ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　ｉｎ　２－ｏｘｏｇｌｕｔａｒａｔｅ－ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ　ｄｉｏｘｙｇｅｎａｓｅ　ｆａｍｉｌｙ；
“★”ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ａｃｔｉｖｅ　ｓｉｔｅ；“●”ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　ｃｏｎｓｅｒｖｅｄ　Ａｓｐ　ａｎｄ　Ｈｉｓ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｆｏｒ　ｆｅｒｒｏｕｓ－ｉｒｏｎ　ｃｏｏｒｄｉｎａｔｉｏｎ；“▼”ｉｎｄｉｃａｔｅｓ　Ａｒｇ　ａｎｄ
Ｓｅｒ　ｒｅｓｉｄｕｅｓ　ｏｆ　ｐｕｔａｔｉｖｅ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｓｉｔｅ　ｆｏｒ　２－ｋｅｔｏｇｌｕｔａｒａｔｅ
９３１第７期 龚　胜，等：三色堇花色素合成途径中部分结构基因的克隆及生物信息学分析
表５　三色堇ＣＨＳ、ＣＨＩ和Ｆ３Ｈ蛋白质二级结构预测
Ｔａｂｌｅ　５　Ｓｅｃｏｎｄａｒｙ　ｓｔｒｕｃｔｕｒｅｓ　ｏｆ　ＣＨＳ，ＣＨＩ　ａｎｄ　Ｆ３Ｈｐｒｏｔｅｉｎｓ　ｉｎ　ｐａｎｓｙ
蛋白质
Ｐｒｏｔｅｉｎ
α螺旋／％
αｈｅｌｉｘ
β转角／％
βｔｕｒｎ
延伸链／％
Ｅｘｔｅｎｄｅｄ　ｓｔｒａｎｄ
无规则卷曲／％
Ｒａｎｄｏｍ　ｃｏｉｌ
ＣＨＳ　 ４３．３９　 ６．２６　 １５．０８　 ３５．２７
ＣＨＩ　 ４１．８９　 ５．８６　 ２２．０７　 ３０．１８
Ｆ３Ｈ ３８．９０　 ４．１８　 １４．６２　 ４２．３０
图８　ＣＨＩ、ＣＨＳ和Ｆ３Ｈ氨基酸序列与其他植物氨基酸序列的聚类结果
Ｖｗ．三色堇；Ｐｔ．毛果杨；Ａｔ．拟南芥；Ｇｍ．大豆；Ｇｈ．陆地棉；Ｄｃ．康乃馨；Ｖｖ．葡萄；Ｚｍ．玉米；Ｉｐ．圆叶牵牛
Ｆｉｇ．８　Ｐｈｙｌｏｇｅｎｉｃ　ａｎａｌｙｓｉｓ　ｏｆ　ＣＨＩ，ＣＨＳ　ａｎｄ　Ｆ３Ｈｆｒｏｍ　ｖａｒｉｏｕｓ　ｐｌａｎｔｓ　ｂａｓｅｄ　ｏｎ　ａｍｉｎｏ　ａｃｉｄｓ　ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ
Ｖｗ．Ｖｉｏｌａ×ｗｉｔｔｒｏｃｋｉａｎａ；Ｐｔ．Ｐｏｐｕｌｕｓ　ｔｒｉｃｈｏｃａｒｐａ；Ａｔ．Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ；Ｇｍ．Ｇｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ；Ｇｈ．Ｇｏｓｓｙｐｉｕｍ　ｈｉｒｓｕｔｕｍ；
Ｄｃ．Ｄｉａｎｔｈｕｓ　ｃａｒｙｏｐｈｙｌｌｕｓ；Ｖｖ．Ｖｉｔｉｓ　ｖｉｎｉｆｅｒａ；Ｚｍ．Ｚｅａ　ｍａｙｓ；Ｉｐ．Ｉｐｏｍｏｅａ　ｐｕｒｐｕｒｅａ
３　结论与讨论
ＣＨＳ是Ⅲ型聚酮合成酶中的一种，是植物类黄
酮生物合成途径中第一个关键酶，其在调控类黄酮
的生物合成以及类黄酮的成分方面具有决定性作
用［１８］。在植物中，查尔酮合成酶基因是多基因家
族，并且在基因结构上非常保守［１９］。在三色堇ＣＨＳ
氨基酸序列与其他植物相关氨基酸的多重序列比对
中可以看出，它们的一致性在６５％～９０％，而且构
成三色堇查尔酮合成酶蛋白催化中心的信号序列
（Ｇ３７８ＦＧＰＧ）也是保守的［２０］。这些都在一定程度
上体现了查尔酮合成酶结构上的保守性。查尔酮合
成酶基因是类黄酮生物合成途径中下游基因表达的
限速因子，它对于花色的形成有着重要的影响，而且
查尔酮合成酶基因的表达具有很强的时空特异
性［２１］。因此，为了制定三色堇花色育种策略，就需
要对三色堇查尔酮合成酶基因的表达特异性和分子
调控机制进行研究，以期为三色堇的花色育种提供
一定的理论依据。
ＣＨＩ是植物类黄酮生物合成途径中的关键酶
之一，也是第一个被认识的黄酮类化合物合成相关
酶。ＣＨＩ基因一般分为两类，即ＣＨＩⅠ和ＣＨＩⅡ
基因，其中ＣＨＩⅠ基因编码的蛋白一般为２１０～２４０
个氨基酸，蛋白间的同源性为５０％～８０％，ＣＨＩⅡ
基因的典型结构一般是由４个外显子和３个内含子
组成［１６］。本研究从三色堇中克隆得到的ＣＨＩ基因
编码的蛋白有２１６个氨基酸，且其与其他相关蛋白
的同源性为６２％～７７％，因此推断从三色堇中克隆
得到的ＣＨＩ基因可能属于ＣＨＩⅠ型基因。对苜蓿
ＣＨＩ的三维结构及突变分析表明，在ＣＨＩ催化反应
中，Ｔｈｒ４８、Ｔｙｒ１０６、Ａｓｎ１１３和Ｔｈｒ１９０等４个氨基酸残基
共同构成了ＣＨＩ的活性中心，其中Ｔｈｒ４８、Ｔｙｒ１０６和
Ａｓｎ１１３在大多数物种中都是保守的，但是Ｔｈｒ１９０只有
在豆科植物中是保守的，在非豆科植物中第１９０位
是丝氨酸（Ｓｅｒ），但是底物没有变化［２２］。而从三色
堇中得到的ＣＨＩ蛋白，其中Ｔｈｒ５０、Ｔｙｒ１０８、Ａｓｎ１１５和
Ｓｅｒ１９２为ＣＨＩ必需的活性位点，与苜蓿ＣＨＩ蛋白活
性位点相比，三色堇的ＣＨＩ蛋白质活性位点后移了
０４１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷
２个氨基酸位点。由于ＣＨＩ基因是花色素生物合
成途径第２阶段的关键酶之一，因此它在植物中表
达量的多少直接影响花色素在植物中的积累。但是
目前都是通过间接的手段来验证ＣＨＩ基因的变化
对花色的影响，如通过荧光定量ＰＣＲ对银杏叶片进
行分析发现，查尔酮合成酶活性以及ＣＨＩ基因的转
录水平与叶片中黄酮类物质的积累相关［２３］；洋葱查
尔酮合成酶的失活使其花色变为金色等［２４］，而通过
直接改变ＣＨＩ基因来改变花色的研究还较少。因
此，为了更好地了解三色堇花色形成机理，在今后的
研究中可通过直接改变ＣＨＩ基因来探究它的表达
调控模式，这不仅可以丰富花色形成机理，还可以为
三色堇花色育种提供理论体系支持。
Ｆ３Ｈ是植物黄酮类化合物代谢途径上的关键
酶，属于依赖型２－酮戊二酸的双加氧酶家族，其反应
需要２－酮戊二酸、分子氧、铁和抗坏血酸作为辅助因
子［２５］。本研究结果表明，ＶｗＦ３Ｈ 蛋白有２个铁离
子结合位点（Ａｓｐ２１８、Ｈｉｓ２５３）和３个２－酮戊二酸结合
位点（Ａｒｇ２１５、Ａｒｇ２８４、Ｓｅｒ２８６）。而分析苦荞 ＦｔＦ３Ｈ
蛋白三维结构得出３个铁离子结合位点（Ｈｉｓ２２１、
Ａｓｐ２２３、Ｈｉｓ２７９）和２个２－酮戊二酸结合位点（Ａｒｇ２８９、
Ｓｅｒ２９１），这些位点主要参与和调节蛋白质的代谢、翻
译后的修饰和加工，对蛋白质活性非常重要［１６］。
Ｆ３　Ｈ 基因是花色素合成途径第２阶段的第３个关
键酶，它的表达情况直接影响花色素在植物中的积
累。目前关于三色堇中Ｆ３　Ｈ 基因的具体表达调控
模式以及酶的底物选择性还有待进一步研究，这些
不仅可以健全三色堇花色形成相关体系，还能够为
其他植物的花斑研究提供依据。
在花青素的生物合成途径中，ＣＨＳ、ＣＨＩ和
Ｆ３Ｈ属于第２阶段反应的关键酶，ＣＨＳ、ＣＨＩ和
Ｆ３　Ｈ３个基因的表达与否直接影响花青素的生物
合成。近年来，关于ＣＨＳ、ＣＨＩ和Ｆ３　Ｈ 基因的研
究主要集中于草本植物的花色代谢调控方面，如利
用 ＲＮＡ干扰技术，使夏堇（Ｔｏｒｅｎｉａ　ｈｙｂｒｉｄａ）中的
ＣＨＳ基因沉默，干扰了花色苷合成，从而将蓝色花
变为白色和灰白色花［２６］；矮牵牛中ＣＨＩ基因突变
后使得查尔酮积累，从而使花粉呈黄色或绿色［２７］；
通过ＲＮＡ干扰技术处理蓝紫色夏堇Ｆ３　Ｈ 基因，获
得白色花［２８］。当然人为调控花色代谢的手段还包
括：导入外源基因或增加调节基因、改变环境因素
等，这些也可以达到调控花色的目的，但是如果需要
定向调控花色还是困难重重。本研究通过对三色堇
花青素生物合成途径中ＣＨＳ、ＣＨＩ和Ｆ３　Ｈ 基因的
克隆与生物信息学分析，不仅获得了它们的全长序
列，还对这些基因的结构和功能进行了研究，在丰富
基因信息的同时还为健全花青素合成体系提供了一
定理论支持。当然，植物次生代谢调控是极其复杂
的过程，并非靠个别酶就能完成，对于花青素生物合
成途径中其他结构基因以及调控基因的研究也十分
重要，因此在以后的三色堇花色形成机理研究中可
以结合其他的影响因子综合考虑。
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ｅｒ　ｐｉｇｍｅｎｔａｔｉｏｎ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，１９８８，３３３：８６６－８６９．
［１０］　Ｎｉｓｈｉｈａｒａ　Ｍ，Ｎａｋａｔｓｕｋａ　Ｔ，Ｙａｍａｍｕｒａ　Ｓ．Ｆｌａｖｏｎｏｉｄ　ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ
ａｎｄ　ｆｌｏｗｅｒ　ｃｏｌｏｒ　ｃｈａｎｇｅ　ｉｎ　ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ　ｔｏｂａｃｃｏ　ｐｌａｎｔｓ　ｂｙ　ｓｕｐ－
ｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｃｈａｌｃｏｎｅ　ｉｓｏｍｅｒａｓｅ　ｇｅｎｅ［Ｊ］．ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔ，２００５，５７９
（２７）：６０７４－６０７８．
［１１］　Ｚｕｋｅｒ　Ａ，Ｔｚｆｉｒａ　Ｔ，Ｂｅｎ－Ｍｅｉｒ　Ｈ，ｅｔ　ａｌ．Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　ｆｌｏｗｅｒ
ｃｏｌｏｒ　ａｎｄ　ｆｒａｇｒａｎｃｅ　ｂｙ　ａｎｔｉｓｅｎｓｅ　ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎ　ｏｆ　ｔｈｅ　ｆｌａｖａｎｏｎｅ
１４１第７期 龚　胜，等：三色堇花色素合成途径中部分结构基因的克隆及生物信息学分析
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２４１ 西北农林科技大学学报（自然科学版） 第４３卷