全 文 ：山 地农 业生 物学 报　25(4):297 ～ 301, 2006
Journal o f M oun ta in Agricu lture and B iology
巨柏细胞色素氧化酶同工酶变异分析*
兰小中1 ,王景升 2 ,郑维列 2 ,张明生3**
(1.西藏大学 农牧学院 动物科学技术系 , 西藏 林芝　860000;2.西藏大学农牧学院 高原生态研究所 ,
西藏 林芝　860000;3.贵州大学 生命科学学院 , 贵州 贵阳　550025)
摘　要:为阐明巨柏 Cupressus gigan tea的濒危机理 , 根据聚丙烯酰胺琼脂电泳对巨柏 3个大居群的 36个个体
功能叶片的细胞色素氧化酶的同工酶谱带测定结果进行编码 ,对各酶谱带进行聚类分析;同时结合细胞色素
氧化酶的 3个遗传指标进行分析。结果表明 , 来自同一居群的个体 , 同工酶谱带相似性高 , 遗传杂合度小
(HeA =0. 726, HeB =0. 691, HeC =0. 704),相似性系数大 ,遗传距离小 , 这说明居群内个体遗传分化小;而不同居
群间的个体则恰好相反 ( I
AB
=0. 240, I
AC
=0. 259, I
BC
=0. 401;D
AB
=1. 427, D
AC
=1. 351, D
BC
=0. 914), 这主要是
由青藏高原特殊的气候条件和巨柏的地理分布格局所造成的。
关键词:巨柏;细胞色素氧化酶;同工酶;聚类分析
中图分类号:S791. 410. 1(275);Q946. 5　　文献标识码:A　　文章编号:1008 -0457(2006)04 - 0297 -05
The isoenzym ic variation ana lysis of the cytochrom e oxidase of the Cupressus g igantea
LAN X iao-zhong1 ,WANG J ing-sheng2 , ZHENG Wei-lie2 , ZHANG M ing-sheng3**(1. Departmen t of the Anim al Science
and Technology, Agricu lture and Anima l Husbandry College, T ibet Un iversity, X izang L inzh i 860000, China;2. R esearch
Institute of P lateau E cology, Agriculture and Anim al Husbandry College, T ibet University, X izang L inzhi 860000, China;
3. College of L ife Science, Guizhou University, Gu izhou Guiyang 550025, China)
Abstrac t:To illu stra te the endangerous m echanism o fCupressus gigan tea, the cy tochrom e ox idase (CYT) isoenzym ic
bands o f leaves of 36 p lants from 3 iso lated popu la tion we re de term ined by po lyac ry lam ide gel e lec trophoresis. M eanwh ile
the c luster ana ly sis o f the isoenzym ic bands has beenm ade and 3 gene tic indexes o f CYT w ere ana ly sed. The re su lts indi-
ca te tha t ind iv iduals from the sam e popula tion show highe r sim ilarity in isoenzym ic bands and genetic he terozygo sity is
sm a ll(HeA =0.726, H eB =0.691, HeC =0.704), gene tic identity is big, gene tic distance is sma ll, which illustra te ge-
netic varia tion of inner popula tion is very sm a l.l H ow ever, the results o f the indiv idua ls from diffe rent popu la tion is contra-
ry to that from the sam e population, that is, gene tic iden tity is sma ll and genetic distance is big( IAB =0.240, IAC =
0. 259, IBC =0.401;DAB =1.427, D AC =1. 351, DBC =0. 914). The m ain reason is the specia l clima te condition o f
Q ingha i-T ibe t P la teau and geog raphic distribu tion situation ofCupressus gigantea.
K ey words:Cupressus g igantea;cy tochrom e oxidase;isoenzym e;clu ster ana ly sis
巨柏 Cupressus g igan tea又称雅鲁藏布江柏木 ,乔木 ,高 30 ～ 45m ,胸径 1 ～ 3m ,稀达 6m。巨柏为西藏
特有树种 ,胸径可达 5. 8m ,树龄达 2 000年以上 ,为我国生存柏科树种中树龄最长 、胸径最大的巨树 。巨
柏分布于雅鲁藏布江朗县至米林附近的沿江地段 ,甲格以西分布较多 ,在其支流尼洋河下游林芝以及波密
(易贡)也有分布 。在海拔 3 000 ～ 3 400m江边之间坡 、谷地开阔的半阳坡及有石灰石露头的阶地阳坡中
下部组成疏林 ,或在江边成行生长。
巨柏目前处于濒危状态 ,是国家一级保护植物。关于巨柏濒危机理的研究目前报道很少。王景升等[ 1]
收稿日期:2006 - 03 - 24;修回日期:2006 - 04 - 24
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30260020)
作者简介:兰小中(1973 -),男 ,四川大竹人 ,西藏大学农牧学院讲师 ,在读硕士研究生 ,从事植物生理学研究。
**通讯作者:　Tel:0851 - 3865937;E-m ai l:m shzhang@163. com.
曾从巨柏种子活力 、种子萌发率等对其进行了濒危机理分析 ,这只是从种群繁殖和扩散的角度出发;兰小中
等 [ 2]从光合作用日进程的角度也曾对其进行了濒危机理研究 ,但这两种方法都无法从化学本质及遗传角度
来解释巨柏的濒危机理。本研究通过对细胞色素氧化酶的同工酶数量分析 ,结合群体遗传分析方法来阐明
造成该物种濒危境地的根本原因 ,旨在为进一步开展巨柏同工酶研究以及保护该物种提供一定的科学理论
依据 [ 3 -4] 。
1　材料与方法
1. 1　取材及样品提取
2004年 5月 1日 ,从朗县 、米林和林芝等分布区内分别采取巨柏的样品 ,每个居群内随机采取 12个
样品 ,一共采集 36株个体的新鲜功能叶片于冰壶中保存 (见表 1)。先用自来水冲洗干净 ,然后再用蒸馏
水冲洗 ,吸水纸吸干后称质量 ,置研钵中 ,加入 2倍于样品的蒸馏水 (1g样品加入 2mL蒸馏水 )作为提取
液 ,粗过滤 ,将滤液在 TGL - 16G高速离心机中 ,以 15 000r m in- 1的速度离心 20 ～ 25m in ,取上清液 ,最后
加入等体积的质量浓度为 400g L -1的蔗糖溶液和 4滴质量浓度为 30g L - 1的溴酚蓝指示剂制成样品液于
冰箱中保存备用 [ 3 - 9] 。
表 1　巨柏各植株采样叶片质量
　　　　　　　　　　Tab. 1　The fresh leaves we ight o f every sam p le from Cupressus g igan tea g
样　品 居　群　质　量朗　县 米　林 林　芝
1 1. 558 1. 518 1. 526
2 1. 498 1. 448 1. 475
3 1. 543 1. 443 1. 529
4 1. 467 1. 437 1. 498
5 1. 512 1. 552 1. 545
6 1. 610 1. 520 1. 602
7 1. 580 1. 570 1. 549
8 1. 546 1. 486 1. 532
9 1. 553 1. 493 1. 523
10 1. 545 1. 445 1. 605
11 1. 498 1. 468 1. 528
12 1. 479 1. 459 1. 519
1. 2　电泳
采用不连续聚丙烯酰胺垂直平板凝胶电泳法 。先制胶 ,分离胶质量浓度为 70g L- 1 ,浓缩胶质量浓度
为 30g L -1;细胞色素氧化酶的分离胶用质量浓度为 20g L- 1的过硫酸铵溶液作聚合剂 ,接着用微量进液
器在每样品槽中加入 60μL样品提取液 ,接通电源 ,开始以 120V电压电泳 30m in,然后待样品跑进分离胶
时把电压升至 400V ,恒压电泳至溴酚蓝带走到距凝胶末端 1cm处为止 。取下胶板 ,用去离子水冲洗干净 ,
然后用二甲基对苯二胺染色(在 37℃的条件下恒温染色 10m in ,直至出现天蓝色谱带为止),冲洗 ,画图 ,
固定 ,记录并计算 R f值。
1. 3　电泳结果处理
根据绘制的酶谱带图 (见图 1),以酶谱带的值依次确定谱带名 ,并根据 0 /1二态编码原则绘制细胞色
素氧化酶的二态矩阵表(表略),以及酶谱带分类表与类型比例表(见表 2、3)。
根据酶是基因的产物及酶谱与基因相对照原理得出基因频率 、遗传杂合度 、遗传相似性系数和遗传距
离 [ 10] ,各指标的计算公式分别为:
He=1 -∑ xi 2 /n
I=∑ xi ×yi /(∑ xi 2 ×∑ yi 2 )1 /2
D =- lnI
298 山 地 农 业 生 物 学 报 　2006年
式中:He为遗传杂合度;I为相似性系数;D为遗传距离;xi、yi分别为 x及 y居群第 i个等位基因频率 。
图 1　巨柏细胞色素氧化酶(CYT)同工酶谱图
F ig. 1　Schem a tic draw ing show ing the cy tochrome ox idase (CYT) isozym ic bands from Cupressus g igantea
表 2　巨柏细胞色素氧化酶谱带分类
Tab. 2　The CYT isozym ic bans d istr ibu tion patte rns from Cupressus gigan tea
居 群 R f值
0. 08 0. 10 0. 12 0. 19 0. 22 0. 29 0. 30 0. 32 0. 45 0. 46 0. 48 0. 60 0. 62 0. 68 0. 72 0. 73 0. 78 0. 80 0. 82 0. 90 0. 92 0. 94
A -　 + +’ +’ +’ +’ +’ +’ +’ +’ -　 +’ +’ +’ +’ -　 -　 +’ +’ -　 -　 +’
B +’ - +　 +’ -　 -　 -　 +　 +’ +’ +’ -　 +’ -　 +’ +’ +’ +　 +’ -　 +’ -　
C +’ - +’ +　 +’ -　 +　 +’ +’ -　 +’ +’ +’ -　 +’ +’ +’ -　 -　 +’ +’ -　
归 类 Ⅰ Ⅱ Ⅲ Ⅲ Ⅰ Ⅳ Ⅴ Ⅲ Ⅵ Ⅰ Ⅰ Ⅰ Ⅵ Ⅳ Ⅵ Ⅰ Ⅰ Ⅴ Ⅰ Ⅳ Ⅰ Ⅳ
注:+表示居群内所有个体均有该谱带;+’表示居群内部分个体具有该谱带;-表示居群内个体都不具有该谱带。
表 3　巨柏细胞色素氧化酶谱带类型比例
Tab. 3　The propo rtion o f CYT isozym ic bands types from Cupressu s gigan tea
酶 谱类 型 居　群　　A 　　B 　　C 酶　谱　带　 R f　值
所 占总 谱带 百 分比
(%)
　 - 　 +’ 　 +’ 0. 08 0. 48 0. 73 0. 78 0. 92
Ⅰ 　 +’ 　 +’ 　 - 0. 46 0. 82 0. 68 45
　 +’ 　 - 　 +’ 0. 22 0. 60
Ⅱ 　 + 　 - 　 - 0. 10 5
Ⅲ 　 +’ 　 +’ 　 +’ 0. 12 0. 32　 +’ 　 +’ 　 + 0. 19 14
Ⅳ 　 +’ 　 - 　 - 0. 29 0. 68 0. 94　 - 　 - 　 +’ 0. 90 18
Ⅴ 　 +’ 　 - 　 + 0. 30　 + 　 + 　 - 0. 80 9
Ⅵ 　 +’ 　 +’ 　 +’ 0. 45 0. 62 9
　　根据细胞色素氧化酶的基因频率 (表 4)计算得出:HeA =0. 726, HeB =0. 691, HeC =0.704;IAB =
0.240, IAC =0.259, IBC =0. 401;DAB =1. 427, DAC =1. 351, D BC =0. 914。
将原始数据矩阵 ,通过 SPSS软件利用 Jaccard结合系数加权平均法 (WPGMA)和组平均法 (UPGMA)
进行聚类[ 11 -12] ,得出树状聚类图 (见图 2、3)。
299第 4期　 兰小中 ,等:巨柏细胞色素氧化酶同工酶变异分析
表 4　巨柏细胞色素氧化酶的基因频率
Tab. 4　Rf of CYT from Cupressu s gigan tea
居 群 R f值
0. 08 0. 10 0. 12 0. 19 0. 22 0. 29 0. 30 0. 32 0. 45 0. 46 0. 48 0. 60 0. 62 0. 68 0. 72 0. 73 0. 78 0. 80 0. 82 0. 90 0. 92 0. 94
A 0. 00 1. 00 0. 25 0. 83 0. 33 0. 08 0. 75 0. 17 0. 75 0. 17 0. 00 0. 83 0. 25 0. 25 0. 83 0. 00 0. 00 0. 75 0. 25 0. 00 0. 00 0. 92
B 0. 08 0. 00 1. 00 0. 83 0. 00 0. 00 0. 00 1. 00 0. 25 0. 75 0. 25 0. 00 0. 92 0. 00 0. 83 0. 00 0. 08 1. 00 0. 17 0. 00 0. 92 0. 00
C 0. 92 0. 00 0. 17 1. 00 0. 17 0. 00 0. 17 1. 00 0. 83 0. 00 0. 08 0. 42 0. 92 0. 00 0. 92 0. 08 0. 92 0. 00 0. 00 0. 33 0. 25 0. 00
2　结果与讨论
2. 1　遗传指标分析
由细胞色素氧化酶(CYT)电泳结果及各遗传指标可知 ,细胞色素氧化酶在居群 A、B、C内的遗传杂合
度分别为 0. 726、0. 691和 0. 704。这说明巨柏在居群内存在一定的遗传分化 ,其分化及遗传多样性大小
顺序为 A >C >B。
居群 A与 B的遗传相似性系数为 0. 240 ,遗传距离为 1. 427;居群 A与 C的遗传相似性系数为 0. 259,
遗传距离为 1. 351;居群 B与 C的遗传相似性系数为 0. 401,遗传距离为 0. 914。表明该物种居群间存在着
相当大的遗传分化和一定的遗传距离(3居群遗传距离的远近关系为 DAB >DAC >DBC),其中 , DAB和 DAC的
值特别大 ,接近 1. 500。细胞色素氧化酶同工酶的遗传变异在 A与 B、A与 C居群间表现得尤为突出 ,这
说明 A与 B、A与 C居群在特定的地理隔离 、种子生活力低 、恶劣的气候条件影响下 ,相似性系数也特别小
( IAB =0. 240、 IAC =0. 259),发生了相当大的变异。
300 山 地 农 业 生 物 学 报 　2006年
2. 2　同工酶谱带分析
由巨柏细胞色素氧化酶同工酶谱示意图(图 1)可知 ,在居群内的个体植株间同工酶谱有很大的相似
性 ,而在居群间又表现出同工酶的一定变异性 。在居群 A中 , R f值为 0. 10和 0. 94时 ,基因频率为 1或接
近 1 , R f值为 0. 19、0. 30、0. 60、0. 72、0. 80时 ,基因频率均大于 0. 70;在 B居群中 , R f值为 0. 12、0. 32、
0.62、0. 80、0. 92时 ,基因频率为 1或接近 1, R f值为 0. 19、0. 46、0. 72时 ,基因频率均大于 0. 70;在 C居群
中 , R f值为 0. 19、0. 32时 ,基因频率为 1, R f值为 0. 08、0. 62、0. 72、0. 78时 ,基因频率均大于 0. 90。这些
数据充分表明 ,在巨柏居群内部的细胞色素氧化酶同工酶存在较大程度的遗传相似性 ,遗传分化小 。然
而 ,从居群间来看 ,在 R f值为 0. 10、0. 94时 , A居群中基因频率均大于 0. 90,而在居群 B与 C中 ,此时的基
因频率均为 0;在 R f值为 0. 12、0. 32、0. 92时 , A居群中的基因频率最大的只有 0. 25,而在 B居群中的基
因频率都接近 1 ,在 C居群中只有在 R f值为 0. 32时 ,基因频率为 1,其余的最大值也只有 0. 25。表明 B居
群与 C居群的相似性大于 A与 B和 A与 C ,这与前面计算的结果完全一致 。由此可见 ,巨柏的细胞色素
氧化酶同工酶在居群内有较大的相似性 ,在居群间却发生了很大程度的遗传分化 [ 13] 。
2. 3　3个居群聚类分析
从巨柏细胞色素氧化酶的聚类图可知 ,以 Jaccard结合系数加权平均法 (JAC -WPGMA)聚类的树状
图 [ 12] ,在 JAC - 0. 65处可划分为 A 、`B 、`C 3`个表征群 ,其全部由来自 3个居群各自的 12个个体构成 。在
JAC - 0. 57处可划分为 a、b、c、d、e 5个亚表征群 , A表`征群包括 a、b、c - JAC - 0. 57这 3个亚表征群;B表`
征群包括 d - JAC - 0. 57这 1个亚表征群;C表`征群包括 e - JAC - 0. 57这 1个亚表征群 。在同一个居群
中的个体表现出汇聚性的同时 ,也表现出一定的趋异性。同样 , A居群的个体也并不完全相同 ,这说明居
群内的个别个体已经出现了明显的遗传分化。在巨柏细胞色素氧化酶的 Jaccard结合系数的组平均法
(UPGMA)聚类图中 ,可在 JAC - 0. 60处划分为 A 、`B 、`C 、`D 4`个表征群。 A表`征群全部由来自 A居群的 10
个个体构成;B表`征群全部由来自 A居群的 2个个体构成;C表`征群全部由来自 B居群的 12个个体构成;
D表`征群全部由来自 C居群的 12个个体构成 。在 JAC -0. 50处可划分为 a、b、c、d、e 5个亚表征群。无论
是 4个表征群 ,还是 5个亚表征群 ,均得到与图 2相同的结论。
然而 ,从图 2、3还可以看出 , A居群中的 1、6、10号个体 , B居群中的 14、20、23、24号个体和 C居群中
的 28、36号个体均具有高度的汇聚性 ,根据采样时的记录看 ,这些个体相互之间的空间距离很短 ,所以 ,出
现这样的结论和巨柏在开花授粉时的相互交流是分不开的 。这种情况在巨柏的真实地理分布中并不多
见 ,朗县境内的巨柏主要是沿着雅鲁藏布江呈疏散的带状分布 ,而米林和林芝境内的巨柏则是呈块状的疏
散分布 ,最终导致巨柏相互之间无法进行遗传信息的交流 ,这也是导致巨柏濒危的原因之一。
从巨柏的细胞色素氧化酶谱带分类和谱带类型比例可以看出 , R f值为 0. 12、0. 19、0. 32、0. 45、0. 72的谱
带虽为 3个居群所共有(类型Ⅲ、Ⅵ ),但出现有一定的差异;而类型Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ、Ⅴ则为 1个或 2个居群所有的带
型。有 23%的细胞色素氧化酶谱带在个体水平上是恒定的(类型Ⅲ、Ⅵ ),其余 77%(Ⅰ+Ⅱ+Ⅳ+Ⅴ)的谱带在
个体或居群水平上或多或少有变异现象 。
3　结　论
无论是对巨柏细胞色素氧化酶同工酶谱的分析 ,还是对其进行 Jaccard结合系数的加权平均法和组平
均法的分析 ,都可得到同样的结论:来自朗县 、米林 、林芝的巨柏大居群 (面积约 1 000km2)的个体植株的
酶谱均存在一定的相似性 ,表现出个体间存在一定的遗传同质性 ,而且又不难看到在图 2、3中表征群内的
3个小居群都或多或少的发生了一定的趋异性 ,这说明 3个居群具有一定的亲缘关系。从这些数据的分
析来看 ,在早期(至少在 2 000年前 ,因为林芝的巨柏树龄高达 2 500年左右 ),巨柏在朗县 、米林 、林芝的
分布应当是连续的 ,且生长状况良好 ,只是在后来的漫长进化过程中 ,由于雅鲁藏布江的侵蚀作用和人类
的活动 ,才导致如今的分布格局 ,并且这种分布范围正不断缩小。
巨柏的濒危状态不是单纯与同工酶变异及遗传分化有直接关系 ,还与青藏高原这种特殊的生态环境
(下转第 306页 )
301第 4期　 兰小中 ,等:巨柏细胞色素氧化酶同工酶变异分析
在林隙发育的各个阶段均有大量个体存在 ,均能在林隙发育过程中得到更新与恢复 ,这也许是这两类树种
在喀斯特森林中长期共存 ,并维持茂兰喀斯特森林常绿落叶阔叶林群落性质和稳定性的奥秘。
致谢　朱守谦教授和喻理飞博士对本研究给予热情帮助;野外调查中得到茂兰保护区管理局的大力支持;地理与生物科学学院 2000
级毕业生韦峥嵘 、刘欣 、高兰和龙明鼎等参加野外调查 ,特此致谢 
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(上接第 301页 )
以及巨柏较低的光合速率有极大关系 [ 2] 。巨柏多生长在干旱或半干旱地区 ,正值种子成熟时 ,高温少雨
的恶劣气候致使巨柏的天然更新困难 。造成巨柏目前的濒危状况 ,还与当地农民每年的乱砍滥伐有极大
关系。当然 ,巨柏目前的分布格局不利于巨柏相互之间进行遗传交流 ,也是导致巨柏濒危的主要原因之
一;此外 ,巨柏的种子活力较低 ,种子萌发时对环境条件要求较高 ,从而引起更新困难 ,最终导致巨柏居群
内个体较少 ,这也是导致巨柏濒危的原因之一 。随着全球气候变暖 ,环境继续恶化 ,人们淡薄的环保意识
若再得不到改变 ,巨柏的濒危状态将更加令人担忧 。
综上所述 ,巨柏居群内个体存在较大的遗传同质性 ,居群间个体存在不同程度的遗传分化 ,这些都是
濒危植物巨柏在特殊和特定的生态环境中长期演化的结果 。同时 ,濒危植物巨柏的濒危状况确实令人担
忧 ,当务之急是有关部门应当采取有效措施对其进行保护。
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306 山 地 农 业 生 物 学 报 　2006年