全 文 ：李 琴，王 健，赵钟鑫，等． 三色堇花瓣总 RNA 3 种提取方法的比较［J］． 江苏农业科学，2013，41(5) :24 － 26．
三色堇花瓣总 RNA 3 种提取方法的比较
李 琴，王 健，赵钟鑫，尚 啸
(海南大学热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室 /海南大学园艺园林学院，海南海口 570228)
摘要:分别采用 TransZol plant法、改良 Trizol法和改良 CTAB法提取三色堇花瓣的总 RNA，并用琼脂糖凝胶电泳
和紫外光谱对其提取效果进行检测。结果表明，TransZol plant法提取的总 RNA 浓度低，且杂质较多;改良 Trizol 法和
改良 CTAB法提取的总 RNA纯度较高。3 种总 RNA 提取方法中，以改良 Trizol 法提取的总 RNA 浓度和纯度最高，
D260 nm /D280 nm在 1． 83 ～ 2． 03 之间。以改良 Trizol法提取的总 RNA反转录合成的 cDNA 为模板，能扩增出预期长度的
基因片段，说明改良 Trizol法提取的总 RNA质量高，可用于后续的分子生物学试验。
关键词:三色堇;TransZol Plant试剂盒法;改良 Trizol法;改良 CTAB法;RNA提取
中图分类号:S688． 9 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2013)05 － 0024 － 02
收稿日期:2012 － 10 － 28
基金项目:国家自然科学基金(编号:31060265、31260488) ;海南大学
热带作物种质资源保护与开发利用教育部重点实验室项目(编号:
2011hckled － 16)。
作者简介:李 琴(1986—) ，女，海南昌江人，硕士研究生，研究方向
为园林植物资源与遗传改良。Tel: (0898)23304472;E － mail:
liqin20060274052@ 163． com。
通信作者:王 健，博士，副教授，研究方向为园林植物分子生物学。
Tel:(0898)66267150;E － mail:wjhnau@ yahoo． com． cn。
三色堇(Viola tricolor L．)为波兰国花，原产于欧洲，属堇
菜科(Violaceae)堇菜属(Viola) ，别称蝴蝶花、猫儿脸，二年生
草本花卉。我国 20 世纪 20 年代初引进，现全国均有栽培。
它的花型独特，株型矮小，适合作庭院、花坛、景区栽培及盆
栽，深受人们喜爱。此外，三色堇还可全草入药，具有清热解
毒、散瘀、止咳等功效。从植物组织中提取完整性好、纯度高
的总 RNA，这是开展植物分子生物学研究的前提和基础，是
研究基因表达的重要环节。纯度高、完整性好的 RNA是进行
Northern杂交分析、RT － PCR、cDNA 文库构建等研究的前提
条件。目前，已报道过多种植物总 RNA 的提取方法，但三色
堇花瓣总 RNA提取方法的研究还鲜见报道。三色堇花瓣富
含酚类、花色素、多糖等次生代谢产物，对总 RNA的提取的影
响较大。本研究以三色堇花瓣为试验材料，对比 TransZol
Plant试剂盒法、改良 Trizol法和改良 CTAB法的提取效果，以
期找到一种适合三色堇花瓣总 RNA提取的方法，为进行三色
堇的分子生物学研究奠定基础。
1 材料与方法
1． 1 材料
供试的三色堇新鲜花瓣采于海南大学园艺园林学院基
地，采后用液氮冷冻处理，－ 70 ℃保存，备用。
试剂:TranZol Plant 试剂盒购自海南青峰生物科技有限
公司;RNasin购自江苏省南京天为生物科技有限公司;Trizol
购自上海生工生物工程技术服务有限公司;Fermentas反转录
试剂盒购自海南青鸟生物科技有限公司。
器皿处理:试验中所用枪头、PCR 管、离心管等塑料耗材
均用 0． 125% DEPC 水浸泡处理过夜，并于 121 ℃下灭菌
20 min，烘干，备用;用于 RNA提取的玻璃器皿均在 180 ℃下
烘烤 6 ～ 8 h，备用。
1． 2 方法
1． 2． 1 TransZol plant试剂盒法 具体步骤参照试剂盒说明
书，略作改动。(1)称量 0． 10 g样品，迅速转移至用液氮预冷
过的研钵中，用研杵充分研磨直至组织成粉末，每 0． 08 ～
0. 10 g组织加入 1 mL TPⅠ溶液。(2)涡旋或用枪头吹吸数
次，12 000 r /min、4 ℃ 离心 5 min。(3)吸取上清 400 ～
500 μL，平分至 2 个新的 1． 5 mL RNase － free离心管中。(4)
向上清中加入等体积的 TPⅡ溶液，颠倒混匀，加入 1 /4 上清
体积的氯仿，混匀，室温孵育 5 min。(5)12 000 r /min、4 ℃离
心 5 min，小心吸取上清，重复步骤(3)。(6)向上清中加入等
体积异丙醇，颠倒混匀，室温孵育 10 min。(7)12 000 r /min、
4 ℃ 离心 10 min，弃上清，加入 1 mL的 75%乙醇，振荡片刻。
(8)10 000 r /min、4 ℃离心 5 min，弃上清，室温晾干沉淀，加
30 μL 灭菌 DEPC水溶解，－ 70 ℃保存。
1． 2． 2 改良 CTAB法 改良 CTAB 法采用赵钟鑫等的 RNA
提取方法［1］。
1． 2． 3 改良 Trizol 法 改良 Trizol 法采用孙德权等的 RNA
提取方法［2］。
1． 2． 4 总 RNA 质量检测 取 4 μL 提取的三色堇花瓣总
RNA溶液于 1． 2%琼脂糖凝胶在 1 × TBE 缓冲液中电泳，检
测 RNA的完整性，并取 1 μL RNA样品，用 TE 缓冲液稀释 50
倍，用紫外分光光度计检测 D260 nm、D280 nm，并计算 D260 nm /
D280 nm，以确定其纯度及得率。
1． 2． 5 RNA 质量的 RT － PCR 检测结果 反转录反应参照
Fermentas反转录试剂盒说明进行。通过 RT － PCR 扩增肌动
蛋白基因，PCR扩增产物在 1%琼脂糖凝胶上电泳检测目的
条带。上游引物为 5 － CAGTGGTCGTACAACTGGTAT － 3;
下游引物为 5 － ATCCTCCAATCCAGACACTGT － 3。PCR 反
应程序:95 ℃预变性 5 min;94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，
72 ℃ 延伸 1 min，35 个循环;72 ℃ 终延伸 10 min，4 ℃
保存。
—42— 江苏农业科学 2013 年第 41 卷第 5 期
DOI:10.15889/j.issn.1002-1302.2013.05.096
2 结果与分析
2． 1 三色堇花瓣总 RNA完整性的检测
图 1 表明，3 种方法提取的三色堇花瓣的总 RNA 的 28S
rRNA 和 18S rRNA条带都比较完整。TransZol plant试剂盒法
提取的总 RNA 在点样孔附近残留的杂质较多，而改良的
CTAB法和改良的 Trizol 法提取的 RNA 点样孔几乎无残留
物，杂质少，说明后 2 种方法提取的 RNA 的质量较高。由于
改良的 Trizol 法提取的 RNA 的 28S rRNA 和 18S rRNA 条带
更清晰，且 28S rRNA条带的亮度约为 18S rRNA 条带亮度的
2 倍，2 条条带之间无弥散现象，说明 RNA 在提取过程中降
解，而改良 CTAB法提取的 RNA 条带有弥散现象，所以改良
Trizol法提取的 RNA质量比改良 CTAB 法更好，这与 RNA 的
纯度及产率测定结果一致。
2． 2 总 RNA的纯度和产率
从表 1 可以看出，TransZol plant 试剂盒法提取的总 RNA
的 D260 nm /D280 nm小于 1． 8，说明蛋白或者其他有机物的污染比
较明显;而改良 CTAB 法和改良 Trizol 法提取的总 RNA 的
D260 nm /D280 nm均大于 1． 8，说明其 RNA 的纯度较高，样品中存
在的多糖、多酚或蛋白等杂质较少。表 1 还表明，改良 Trizol
法提取的总 RNA 产率高于改良 CTAB 法。这是由于改良
CTAB法试验步骤复杂，虽然使得多糖、蛋白等杂质得以沉
淀，但同时也使部分 RNA一同被沉淀下来，因此 RNA的产率
偏低。
表 1 3 种方法提取的三色堇花瓣总 RNA纯度与产率
提取方法
D260 nm /D280 nm 总 RNA产率(μg /g)
重复 1 重复 2 重复 3 重复 1 重复 2 重复 3
TransZol Plant
试剂盒法
1． 58 1． 65 1． 72 61． 50 69． 00 63． 20
改良 CTAB法 1． 82 1． 87 1． 96 82． 50 140． 00 58． 00
改良 Trizol法 1． 96 1． 84 2． 03 320． 40 321． 00 345． 00
2． 3 RT － PCR扩增结果
对改良 Trizol法提取的三色堇花瓣的总 RNA 反转录后，
通过 RT － PCR扩增肌动蛋白基因，获得 599 bp的特异目的条
带(图 2) ，与预期目的基因片段大小一致，条带明亮清晰，说明
改良 Trizol法提取的总 RNA能用于后期的分子生物学试验。
3 结论与讨论
在植物总 RNA提取过程中能否有效地去除多糖、酚类物
质和蛋白质一直是提取高质量RNA的关键。许多植物富含
多糖或酚类化合物，如果不能有效地分离纯化其组织中的
RNA，就会阻碍了其分子生物学方面研究的进展。
多糖的污染是影响 RNA提取质量的重要因素之一，因多
糖的许多理化性质与 RNA 相似，所以在提取 RNA 的过程中
很难将它与 RNA分开，去除多糖的同时 RNA也会被除去，从
而导致 RNA产量减少。目前，去除多糖的方法主要有醋酸钠
沉淀法、LiCl沉淀 RNA法、高浓度 Na +或 K +沉淀 RNA法、低
浓度乙醇沉淀法等［3 － 7］。三色堇花瓣富含多糖，本研究中的
改良 CTAB法是先利用 LiCl 沉淀 RNA 使多糖留在上清液中
而去除大部分多糖，再结合使用乙醇和 3 mol /L 醋酸钠(pH
值为 5． 3)有效去除多糖［8］。改良 Trizol 法则是在 RNA 提取
过程加入 5mol /L NaCl，使氯仿在高浓度 Na +条件下抽提过程
能除去多糖，并且改良 Trizol 法使用异丙醇在室温下进行沉
淀，能更有效地解决多糖污染的问题。
三色堇花瓣经磨样处理后，其中的酚类物质会释放出来，
易氧化褐变，被氧化后的酚类物质与 RNA结合，使 RNA 丧失
活性。目前，去除酚类物质的方法主要是加入络合物抑制和
加入强还原剂防止酚类氧化。在改良的 Trizol 法和改良的
CTAB法中都加入强还原剂 β －巯基乙醇，有效抑制酚类物质
被氧化，同时还加入了络合物 PVP(聚乙烯吡咯烷酮)使其与
酚类物质形成螯合物，从而能有效去除酚类物质［9］。
蛋白质也是污染 RNA 样品的重要因素。由于多酚氧化
酶和 RNase均为蛋白质，因此要获得高质量的 RNA就必须有
效地去除蛋白质。本研究中 TransZol plant 试剂盒法和改良
CTAB法使用的 RNase抑制剂都是 CTAB，CTAB 不仅能有效
地分离蛋白质，还对植物细胞有较好的裂解作用［10］，改良的
Trizol法则是通过强蛋白变性剂异硫氰酸胍盐和 β －巯基乙
醇抑制 RNase的活性。在改良 Trizol 法和改良 CTAB 法提取
过程中，均增加了氯仿抽提次数和使用水平衡酚进行抽提，氯
仿可使蛋白质变性，有助于液相与有机相的分离，而水平衡酚
能分离 RNA，经过多次的离心，使 RNA 存在水相中而被分离
出来。在改良 CTAB法中还加入了 SDS(十二烷基硫酸钠) ，
它与蛋白质螯合形成稳定化合物而除去蛋白质［5］。
综上所述，TransZol plant 试剂盒法和改良的 Trizol 法都
具有简单、方便、用时短的特点。但 TransZol plant 法的整个
试验过程中，步骤简单，只用氯仿抽提 1 次，离心时间短，使得
多糖、蛋白质等杂质难以去除干净。改良CTAB法虽然能有
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櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄
效地去除多糖、分类和蛋白质等物质，但是该方法步骤繁琐，
需 12 ～ 15 h，长时间的提取过程容易造成 RNA降解。改良的
Trizol法提取过程仅需 2 ～ 3 h，操作简便，多次抽提和离心能
有效去除杂质，在短时间内获得纯度高、完整性好的 RNA，且
能够进一步满足分子生物学的试验要求，是提取三色堇花瓣
总 RNA 的理想方法。同时，该方法也对其他植物花瓣总
RNA的提取提供了一定的借鉴。
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刘 艺，朱 杰，苑 平，等． 农杆菌介导的猕猴桃 ACO反义基因遗传转化［J］． 江苏农业科学，2013，41(5) :26 － 27．
农杆菌介导的猕猴桃 ACO反义基因遗传转化
刘 艺，朱 杰，苑 平，田宏现
(吉首大学，湖南吉首 416000)
摘要:以猕猴桃米良 1号的当年生嫩枝及叶片为外植体，构建了双右边界双元载体 pCAMBIA1300 － actin － term －2，通
过根癌农杆菌 EHA105 菌株介导，将 ACO 反义基因导入猕猴桃植株基因组。结果表明，愈伤组织预培养 20 d，农杆菌
侵染 30 min，EHA105 菌液浓度 D = 0． 6，共培养 5 d，经 PCR法检测证明 ACO 反义基因已转入转化植株基因组中。
关键词:猕猴桃;ACO反义基因;遗传转化;双 T － DNA载体
中图分类号:Q785 文献标志码:A 文章编号:1002 － 1302(2013)05 － 0026 － 02
收稿日期:2013 － 01 － 07
基金项目:湖南省科技计划(专项计划)项目(编号:2008JT3008) ;湖
南省高校产学研合作示范基地开放项目(编号:2011jsjk003)。
作者简介:刘 艺(1989—) ，男，湖南邵阳人，硕士研究生，主要从事
植物分子生物学方面的研究。E － mail:autolucifer@ foxmail． com。
通信作者:田宏现，教授，博士生，硕士生导师，主要从事微生物学和
林业生物技术方面的研究。E － mail:jstianhx@ 163． com。
猕猴桃是典型的呼吸跃变型果实［1］，因为其果实在幼果
期时有着很高的呼吸速率，当果实不断增大时减弱呼吸作用，
伴随着呼吸速率的急剧升高和大量乙烯的释放这一个跃变过
程，果实成熟，因此称为呼吸跃变型果实［2］。乙烯(ethylene)
是最早发现的植物气体激素之一，它主要作用于组织和器官
的成熟和衰亡，由 2 个碳原子和 4 个氢原子组成［3］。Lieber-
man等［4］于 1964 年率先发现乙烯的前体 S －腺苷甲硫氨酸，
1934 年 Gane等首先证明乙烯能由植物自身合成，次年，Croc-
ker证明乙烯在促进果实成熟的过程中同时会对果实的生长
有抑制作用［3］。在乙烯生物合成的过程中，有 3 个酶起着相
当重要的作用，分别为:腺苷蛋氨酸合成酶(SAM synthetase)、
ACC合成酶(ACC synthase)、ACC 氧化酶(ACC oxidase) ，其
中 ACC氧化酶和 ACC合成酶起到了关键作用［5 － 6］。通过调
控 SAMS、ACS和 ACO 3 个基因的表达，便能较好地控制内源
乙烯在果实内的合成，即可达到延长果实贮藏时间的目
的［7］。采用反义技术去调控 ACO基因在植物体内的表达，从
而达到控制乙烯生物合成已经在现代基因工程研究中获得成
功［8 － 9］。1990 年，Hamilton等［10］成功在转基因番茄果实中实
现了通过反义 RNA技术抑制乙烯的合成和延长果实的贮藏
时间，这是世界上首次得到了控制乙烯合成的转基因植
株［11］。而采用反义 RNA 技术抑制 ACO 活性的研究在猕猴
桃转化的研究尚未见报道。
1 材料与方法
1． 1 材料
本试验采用米良 1 号猕猴桃优良单株上无病虫害的当年
生嫩枝及叶片为外植体材料。根癌农杆菌菌株为 EHA105，
表达载体为 pCAMBIA1300 － actin － term － 2，均为中国科学院
亚热带农业生态研究所提供。该质粒结构如图 1，其中含有
潮霉素磷酸转移酶基因(hpt)。主要试剂:连接酶，试剂盒，限
制性内切酶，聚合酶均采购于 TaKaRa 公司;乙酰丁香酮，抗
生素等主要生化试剂都采购于上海生物工程有限公司;引物
由华大基因合成，其他试剂均采用国产分析纯。
1． 2 方法
1． 2． 1 培养基 共培养基:MS +0． 35 mg /L 6 － BA + 2 mg /L
TDZ + 25 g /L蔗糖 + 0． 1 mmol /L乙酰丁香酮 + 7． 2 g /L琼脂，
pH值5． 6;筛选培养基:MS +0． 5 mg /L 6 － BA +2 mg /L NAA +
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