全 文 ：棉苗微生态学研究.正常棉苗内生菌分离
和某些生化特性测定*
赵发清* * 马海燕 (南昌大学生物科学工程系,南昌 330047)
摘要! 从 4 个不同棉花品种体内分离到内生菌 503 株, 鉴定了 102 株, 分别属于假单胞杆菌属、黄单胞杆菌
属、芽胞杆菌属和欧文氏菌属.分 3 个不同生长期测定了 4个品种的可溶性蛋白含量和超氧化物歧化酶( SOD)、
过氧化物酶( POD)活性变化.结果表明, 4个品种棉花 SOD活性在种期( S1)、芽期( S2 )和苗期 ( S3 )呈下降趋势;
不同品种、不同生长期的可溶性蛋白含量、POD活性存在极显著差异, 品种与生长期还存在显著互作效应.
关键词 棉花 微生态学 内生菌 超氧化物歧化酶 过氧化物酶
Microecology of cotton seedlings I. Endophyte isolation and measurement of some biochemical characters of normal
cotton seedling. Zhao Faqing and Ma Haiyan ( Nanchang Univer sity , Nanchang 330047) . Chin . J . A pp l. Ecol. ,
1999, 10( 1) : 71~ 73.
503 strains of endophytic bacter ia were isolated fr om four cotton varieties after a strict surfacesterilization among
which, 102 strains were subordinate to Pseudomonas, Erwinia , Xanthomoas and Bacillus genera. The concentr a
tion of soluble proteins and the activities of superox ide dismutases ( SOD) and perox idases( POD) in the four cotton va
rieties were measured at three different g rowth stages, and the r esults show that the SOD activ ities tended to decr ease
from seeds, sprouts to seedlings. A significant differ ence o f eigher soluble protein concentration or SOD activ ity was
found among differ ent varieties and different growth stages, and there was an interact ion between cotton variety and
grow th stage.
Key words Cotton, M icroecolog y, Endophyte, Super oxide dismutase, Perox idase.
* 国家自然科学基金资助项目( 39360042) .
* * 通讯联系人.
1996- 06- 24收稿, 1996- 09- 10接受.
1 引 言
近年来正常微生物与宿主之间关系的研究受到了
重视,特别是悉生生物学方法的应用更加促进了这一
领域的发展[ 6, 7, 9] . 然而这些研究又都只限于动物, 而
植物不同于动物,它们没有贯穿首尾的消化道,因而在
控制条件下在植物体内成功地接种已知内生菌较为困
难.动物胚胎可视为无菌个体, 植物则不然, 要得到无
菌植物一般需借助组织与细胞培养技术.所以,植物微
生态学研究进展缓慢. 大量的研究表明棉花终生带有
内生菌群[ 3, 8, 11, 12] . 这些内生菌群在棉花生长发育过
程中的重要生理作用尚未见系统报道. 本文以棉花为
试验材料,对正常棉苗内生菌群及某些生化特性进行
了研究,以揭示内生菌群在棉苗特殊的微环境中所处
的功能地位,为棉花微生态学研究提供科学依据.
2 材料与方法
2. 1 材料
供试材料为: XY31( A1 )、泗棉 2 号( A 2)、89A42( A 3)和苏
棉 4 号( A4) .
2. 2 试验方法
2. 2. 1 正常棉苗的培养 挑选不同品种完好饱满棉籽各 30g,
硫酸脱绒,流水冲洗 2~ 4h, 0. 2% L 汞消毒 5min, 在 25 ∀ 光周
期 L D= 16 83 条件下分种期 ( S1 )、芽期( S2 )和苗期( S3 )取
材;种植在 MS 固体培养基上.
2. 2. 2 内生细菌的分离、鉴定和计数 S1、S2、S3 取材, 在严格无
菌条件下加灭菌后的磷酸缓冲液( 0. 05mol pH 7. 8, w/ v 1 3)
碾磨,梯度稀释, 涂布平板, 30 ∀ 培养 24h, 计数, 挑选单个菌落
作进一步纯化并保存.种子去种壳, S3 材料分根、茎、叶进行. 内
生细菌按布坎南等[ 2]和周德庆等[ 4]方法鉴定.
2. 2. 3 酶液的制备 取 S1、S2 和 S3 材料, 每克鲜重加 3ml磷酸
缓冲液 ( SOD PBS 0. 05mol pH7. 8; POD PBS 0. 02mol pH
5. 8) 冰浴下研磨, 在 4∀ 、13000g 下离心 20min, 上清分别为
SOD 和 POD 粗提液.
2. 2. 4 可溶性蛋白测定 测定 SOD 和 POD粗提液中可溶性蛋
白;用 Fo lin 酚法,重复 3次, 得 6 个平均观察值.
2. 2. 5 SOD活性测定 主要根据 Giannoplot is 等方法[ 13]利用
SOD 抑制氯化硝基四氮唑蓝( NBT )在荧光下的还原反应进行.
3ml反应液中含: 1. 3mol 核黄素、13mol 甲硫氨酸、63mol
NBT 和 0. 05mol pH7. 8 的磷酸缓冲液, 加入适量的酶液于
25 ∀ 、4000lx 条件下光照 20min,并在 560nm 下测定光密度, 以
缓冲液代替酶液作对照.酶的活性单位采用 3Beauchamp3 等的
定义,即抑制 NBT 光化还原 50%为一个活性单位[ 10] .
应 用 生 态 学 报 1999 年 2 月 第 10 卷 第 1 期
CHINESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY, Feb. 1999, 10( 1)#71~ 73
2. 2. 6 POD活性测定 参照唐锡华等[ 5]方法, 3ml反应液中含
0. 1ml0. 18mol 愈创木酚、0. 2 ml0. 03mol 过氧化氢和 2. 7ml
0. 02molpH5. 8 磷酸缓冲液, 加适量的酶液,于不同时间分别测
定在 460nm 下的光密度,并且定义 POD活性单位为: 25∀ 导致
每分钟光密度变化等于 0. 01 所需的酶量, 重复 3 次.
3 结果与讨论
3. 1 内生细菌种属和分布
经严格表面消毒从 4个不同棉花品种体内分离到
内生菌 503 株, 鉴定了 102株, 分别属于假单胞杆菌
属、黄单胞杆菌属、芽胞杆菌属和欧文氏菌属.用马铃
薯琼脂培养基分离真菌,高氏 1号培养基分离放线菌
均得负结果.种子及幼苗根、茎、叶内生菌分布结果见
表 1.
表 1 棉花种子、幼苗内生细菌分布(活菌数∃g- 1鲜重) *
Table 1 Distribution of endophytic bacteria from cotton seeds and seedl ings
( NLB∃g- 1FW)
品种
Varieties
种子
Seeds
棉苗 Cot ton seedling
根 Root 茎 S tem 叶 Leaf
A 1 1. 2% 103 2. 7% 107 5. 8% 106 4. 2% 107
A 2 1. 1% 103 1. 9% 107 6. 7% 106 3. 3% 107
A 3 1. 8% 103 1. 1% 107 6. 6% 106 3. 7% 107
A 4 1. 3% 103 2. 8% 107 5. 9% 106 3. 1% 107
* 活苗数 NLB: The number of living bacteria; FW: Fresh w eight .
3. 2 过氧化物酶活性
取不同棉花品种、不同生长期的材料,分析了过氧
化物酶活性的变化(表 2)并对结果进行了统计分析.
经方差分析测得: 品种 F = 15 > F0. 01; 生长期 F =
42. 69> F0. 01;品种% 生长期 F= 1463. 69> F0. 01.结果
表明,品种与生长期的互作,不同品种以及不同生长期
棉花过氧化物酶活性都存在极显著差异.
品种% 生长期的互作显著, 说明处理组合的效应
不是各单因素效应的简单相加, 需进一步比较各处理
组合的平均数. 在此用新复极差测验, 求得 SE =
0. 147.根据 = 60,算得 LSR0. 05和 LSR0. 01的值.以平
均数的 LSR值的显著尺度测验各平均数的差异显著
性列于表 3.
不同时期的 F 测验极显著. 求得不同时期平均数
的标准误 SE= 0. 085,经不同时期平均数的 L SR 值计
表 2 棉花不同时期过氧化物酶活性变化
Table 2 POD activities of cotton at different growth stages( 1000 units∃
ml- 1)
生长期
Grow th stage
品种 Varieties
A1 A 2 A 3 A 4
S 1 0. 00 0. 00 0. 00 0. 00
0. 00 0. 00 0. 00 0. 00
0. 00 0. 00 0. 00 0. 00
0. 00 0. 00 0. 00 0. 00
0. 00 0. 00 0. 00 0. 00
0. 00 0. 00 0. 00 0. 00
S 2 0. 61 2. 61 2. 26 0. 67
0. 66 2. 73 2. 29 0. 66
0. 69 2. 66 2. 34 0. 70
0. 69 2. 63 2. 24 0. 71
0. 70 2. 82 2. 30 0. 92
0. 67 2. 80 2. 34 0. 77
S 3 5. 13 5. 81 5. 90 4. 35
4. 58 5. 88 5. 25 5. 46
4. 72 6. 16 5. 92 5. 51
5. 28 5. 16 6. 53 4. 87
5. 09 5. 39 8. 01 4. 56
5. 23 5. 67 6. 51 4. 47
表 3 各处理组平均数的新复极差测验
Table 3 LSR of the averages of treatment groups based on the data of table
2
处理组
T reatment
groups
平均数
Average
( 1000 unit s∃ml- 1)
差异显著性
Significance of dif ference
0. 05 0. 01
A 3S3 6. 36 a A
A 2S3 5. 68 b B
A 1S3 5. 0 1 c C
A 4S3 4. 87 c C
A 2S2 2. 71 d D
A 3S2 2. 30 d D
A 4S2 0. 74 e E
A 1S2 0. 67 e E
A 1S1 0. 00 f F
A 2S1 0. 00 f F
A 3S1 0. 00 f F
A 4S1 0. 00 f F
算及显著性测验, 泗棉 2 号和 89A42, 苏棉 4 号和
XY31过氧化物酶活性不存在差异,而 XY31 与泗棉
2号、89A42;苏棉 4号与泗棉 2号、89A42的过氧化
物酶活性存在显著差异.
3. 3 超氧化物歧化酶活性变化
按照 2. 6 方法加入酶量分别为 3、6、9、12、15、
18l,以加入酶量( x )为横坐标,对照光密度与加酶样
品光密度之比( y)为纵坐标作图, 两者呈线性相关, 方
程为:
种 期( S1) 芽期( S2) 苗期( S3)
XY31: y= 1. 0220+ 0. 3767x ; y = 0. 6333+ 0. 2000x ; y= 0. 3116+ 0. 1841x ;
r= 0. 99; r= 0. 99; r= 0. 99;
泗棉 2号: y= 1. 0370+ 0. 3218x ; y = 0. 8406+ 0. 1391x ; y= 0. 8720+ 0. 1163x ;
r= 0. 99; r= 0. 99; r= 0. 986;
89A42: y= 0. 9673+ 0. 3257x ; y = 0. 6267+ 0. 2276x ; y= 0. 5129+ 0. 1623x ;
r= 0. 99; r= 0. 978; r= 0. 934;
苏棉 4号: y= 0. 9193+ 0. 2312x ; y = 0. 9417+ 0. 1917x ; y= 1. 0833+ 0. 1611x ;
r= 0. 976; r= 0. 999; r= 0. 999;
72 应 用 生 态 学 报 10卷
根据以上方程求得棉花 SOD活性单位(即: 当 y
= 2时的 x 值)和每ml上清所含的活性单位数(表 4) .
由表 4可见,种期、芽期、苗期 SOD活性呈下降趋势.
表 4 不同时期棉花 SOD 活性比较
Table 4 Comparison of cotton SOD activi ty at di fferent growth stages ( u
nits∃ml- 1)
品种
Varieties
S 1
Seed
S2
Bud
S3
Seedling
A 1 358 147 109
A 2 333 120 103
A 3 313 167 110
A 4 213 182 175
3. 4 可溶性蛋白变化
表 5 棉花不同时期可溶性蛋白变化
Table 5 Changes of soluble protein concentration at different growth stages
( mg∃ml- 1)
生长期
Grow th stage
品种 Varieties
A1 A 2 A 3 A 4
S 1 13. 9 15. 0 14. 8 11. 2
13. 3 14. 8 14. 4 10. 5
14. 1 15. 0 14. 3 11. 4
3. 4 14. 8 14. 3 11. 3
13. 9 15. 1 14. 5 10. 7
14. 3 15. 0 14. 7 10. 6
S 2 3. 7 3. 3 3. 9 3. 6
3. 6 3. 2 3. 9 4. 0
3. 9 3. 1 4. 0 4. 0
3. 5 3. 4 3. 9 3. 7
3. 5 3. 3 3. 7 3. 9
3. 6 3. 2 3. 9 3. 8
S 3 1. 9 1. 4 1. 3 2. 0
2. 0 1. 4 1. 5 2. 1
1. 9 1. 1 1. 4 1. 9
1. 8 1. 4 1. 3 1. 8
1. 9 1. 2 1. 5 2. 0
2. 0 1. 4 1. 5 2. 0
从表 5可知,棉花不同时期可溶性蛋白的变化情
况.统计分析表明, 不同品种可溶性蛋白 F= 206. 8>
F 0. 01;不同时期 F= 100. 5> F0. 01; 品种 % 时期 F =
24368. 8> F0. 01. 所以,品种与时期的互作,不同品种及
不同时期棉花可溶性蛋白含量都存在极显著差异.
品种 %时期的互作显著说明各处理组合的效应不
是各单因素的简单相加, 需作进一步比较各处理组合
的平均数.用新复极差测验,求得 SE= 0. 082,根据=
60,算得 LSR0. 05和 LSR0. 01的值. 以平均数的 LSR 值
的显著尺度测验各平均数的差异显著性列于表 6. 不
同时期的 F 测验极显著. 求得不同时期平均数的标准
误 SE= 0. 041,不同品种平均数 SE= 0. 047.经不同生
长期和不同品种平均数的 LSR值计算, 显著性测验结
果显示: 泗棉 2号、89A42、XY31可溶性蛋白含量在
0. 01水平与苏棉 4号有显著差异.
从研究结果看, 4种棉花中均存在大量的内生菌,
如此大量内生菌群对棉花的生长发育无疑有它自身存
表 6 各处理组平均数的新复极差测验
Table 6 LSR of the averages of treatment groups based on the data of table
5
处理组
T reatment
groups
平均数
Average
( 1000 unit s∃ml- 1)
差异显著性
Significance of dif ference
0. 05 0. 01
A 2S1 14. 95 a A
A 3S1 14. 50 b B
A 1S1 13. 82 c C
A 4S1 10. 95 d D
A 3S2 3. 88 e E
A 4S2 3. 83 ef E
A 1S2 3. 63 f E
A 2S2 3. 25 g F
A 4S3 1. 97 h G
A 1S3 1. 92 h G
A 3S3 1. 42 i H
A 2S3 1. 32 i I
在的价值.不同品种、不同生长期各项生化指标的显著
差异是否和内生菌的存在相联系有待下一步用悉生生
物学方法证明. 超氧化物歧化酶和过氧化物酶在植物
体内广泛存在并有着重要的生理作用[ 1] , 内生细菌可
能直接或间接影响到超氧化物歧化酶和过氧化物酶的
活性.
致谢 李日文协助统计分析.
参考文献
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作者简介 赵发清,男, 36 岁,博士, 副教授,主要从事分子生态
学研究,发表学术论文 10 余篇.
731 期 赵发清等:棉苗微生态学研究 .正常棉苗内生菌分离和某些生化特性测定