全 文 ：应用 GUS基因研究弗氏中华根瘤
菌的结瘤及效果*
孟颂东 张忠泽 (中国科学院沈阳应用生态研究所, 沈阳 110015)
摘要 应用 GUS(葡萄糖苷酶)基因标记技术将标记基因 GUS 导入受体菌 S . f r edii
8855,标记菌株形成的根瘤可被 GUS 染色缓冲液染成蓝色, 而土著菌形成的根瘤不能着
色.由此即可十分简便地确定土著菌的影响程度. 盆栽试验表明, S . f redii 8855 的结瘤抗
酸碱能力高于土著菌,能在土壤中较大范围内迁移. 当它的根瘤占有率不小于 43%时, 接
种能显著提高大豆产量,大豆产量与根瘤占有率呈正相关( r= 0. 98) , 而与总瘤数关系不
大( r= 0. 13) .土壤 N 素显著抑制其结瘤 ,补加 P 能缓解这种抑制作用.
关键词 GUS 基因标记 结瘤 结瘤竞争
Studies on nodulation and efficiency of S. f redii using GUS gene. Meng Songdong and Zhang
Zhongze ( I nstitute of Applied Ecology , Shenyang 110015) . Chin . J . A pp l . Ecol . , 1997, 8
(6) : 595~ 598.
In this study, GUS gene w as transfered into the donor strain S . f r edii 8855 using GUS (-
glucur onidase) gene marking technique . Nodules occupied by the marked strain turned blue in
the GUS staining buff, w hile others occupied by the indigenous rhizobia didn! t. The effects of
indigenous rhizobia on inoculation could be valuated by the technique easily . Greenhouse experi
ments show ed that the ability of acid and alkaline resistance of S . f r edii 8855 was higher than
that of t he indigenous rhizobia, and it could mig rate in larg e scale in the soil. Ino culation signif
icant ly incr eased the yield of so ybean w hen the nodule occupancy was no less than 43% . The
yield w as positively related to the nodule occupancy ( r= 0. 98) , but unrelated to the total nod
ule number ( r= 0. 13) . Nodulation w as inhibited by soil N and promoted by P applicat ion.
Key words GUS gene marking , Nodulat ion, Nodulating competitiveness.
* 中国科学院重大 B项目和 IAEA( RAS / 5/ 029 )资
助项目.
1997年 1月 3日收稿, 11月 6日接受.
1 引 言
在农业和林业生产中应用人工接种根
瘤菌以提高豆科作物的固氮能力是一项常
规的农业措施. 然而,施用根瘤菌剂并非总
能提高作物产量[ 5] ,接种根瘤菌是否有效
很大程度取决于高效固氮菌种是否能在植
物根系形成根瘤.土壤耕作史、土著根瘤菌
数量及活力[ 4]、接种根瘤菌数量、土壤中
N [ 6]及外界环境因子[ 3, 7]等都能影响接种
根瘤菌在植物根系上的结瘤能力及接种效
果.为了解人工引入的根瘤菌在土壤植物
这一系统中的命运, 需要有一个可靠的根
瘤菌检测手段, 现代分子检测方法为其检
测提供了有利条件, 但迄今为止这些新方
法需要复杂设备和昂贵的化学试剂. GUS
(葡萄糖苷酶)基因标记技术克服了以上诸
多检测方法的不足,检测手段简便快速,而
且可以增加样本的分析量以增加统计学的
可靠性.本文采用 GUS 基因标记技术,通
过盆栽试验,初步研究了土壤 pH 值、土壤
含 N 量和接种量对根瘤菌结瘤能力和接
种效果的影响.
应 用 生 态 学 报 1997 年 12 月 第 8 卷 第 6 期
CH INESE JOURNAL OF APPLIED ECOLOGY , Dec. 1997, 8( 6)∀595~ 598
2 材料与方法
2. 1 GUS 基因标记
供体菌: E . coli S17 - 1/- pir ( CAM110) ,
由国际原子能机构提供.
受体菌: S . f redii 8855, 本所豆科共生固氮
组提供.
基因标记是将供体菌与受体菌混合培养, 通
过细胞接合供体菌将携带有 GUS 基因的质粒导
入受体菌,经进一步选择培养后[ 2]即可分离到含
有 GUS 基因的大豆根瘤菌供试.
2. 2 盆栽土壤土著根瘤菌数量测定
用 5 倍水浸提土壤, 提取液移入种有大豆幼
苗(发芽后 10 d)的琼脂试管中[ 4] , 1 个月后检查
大豆结瘤情况,确定土壤土著根瘤菌最可能数量
( MPN ) .
2. 3 盆栽实验
土壤采自中国科学院沈阳应用生态所城郊
生态站, 土壤 pH 5. 8, 全 N 含量 0. 08% . 小盆装
土 1. 5 kg#盆- 1, 种 3 株大豆, 大盆装土 3 kg#
盆- 1,种 6 株大豆, 实验大豆品种为绥农 8 号. 实
验设计如下 : ( 1) 调土壤 pH 至 pH5、6、7、8、9 等
5 种类型; ( 2) 施肥: 施加尿素量 0. 6% ( 120 kgN
#hm- 2) ; 施尿素量 0. 6%和 K 2PO4 0. 03% ( 7 kgP
#hm- 2) ; ( 3) 接种菌剂: 斜面上挑取一环 GUS 基
因标记的根瘤菌 S . f redii 8855 接种于盛有 100
ml YM 培养基的三角瓶中, 培养至菌浓度 2. 2 ∃
1010 ,直接将菌液施于种植10 d 的大豆幼苗根部,
接种量为 2. 2∃ 1010#株- 1, 对照施加等量的无菌
培养液; ( 4)接种量试验: 接种量 (菌数/植株)分
别为正常接种量 ( 2. 2 ∃ 1010#株- 1 ) 的 5 倍、1/ 5
和1/ 25; ( 5)置未接种的植株距接种植株距离分
别为 15、30和 45 cm.
2. 4 早期收获
待大豆盛花期将植株从盆中小心取出, 地上
部分干燥称重,将根系小心用水洗净, 用含有 X-
g lu 的染液染色[ 1] , 接种根瘤菌形成的根瘤将变
蓝,土著菌形成的根瘤不能被染色, 分别计出每
个植株总根瘤数和染色的根瘤数, 然后将根干燥
称重.
2. 5 晚期收获
大豆成熟后收获测产.
3 结 果
3. 1 GUS基因受体标记及检测
通过 DNA 重组得到带有 GUS 基因
的 S . f redii 8855, 在含有 X- glu 的平皿
上菌落变蓝. 盆载土壤土著根瘤菌数量为
1. 56 ∃ 105#g- 1土壤.盛花期的大豆根系用
含有 X- glu的染液染色, 接种根瘤菌形成
的根瘤变蓝, 其结瘤部位大都在主根和侧
根基部.
3. 2 土壤 pH 对根瘤菌结瘤的影响
土壤 pH 对植株结瘤影响颇大, 在土
壤中土著菌和接种菌显示了不同的最适结
瘤 pH(图 1) .
从图 1可以看出, 植株在土壤微酸性
或中性条件下结瘤总数最多,而接种的根
瘤菌在偏酸、碱性条件下根瘤占有率较高,
说明接种的根瘤菌对酸碱的抗逆性高于土
著菌.
图 1 土壤 pH 对根瘤菌 8855结瘤的影响
Fig. 1 Ef fect of soil pH on nodulation of rhizobia 8855.
% .总瘤数 (平均值 ) (个) Average total nodule number,
& .根瘤占有率 Rat io of nodule occupancy.
3. 3 接种 S . f r edi i 8855 对结瘤及产量
的影响
菌株 S . f redii 8855接种和接种条件
对植株结瘤和作物产量影响显著.接种可
提高接瘤数(表 1) , 人工接种能使大豆根
瘤数增加 18% .土壤 N 素能强烈抑制土著
596 应 用 生 态 学 报 8 卷
菌和接种菌的结瘤, 使结瘤率分别降低
59%和 71%, 这种抑制作用随着土壤中 P
素的增加而缓解, P 素尤其能促进接种根
瘤菌的结瘤,施加 0. 05% ( g#g- 1 )的 P 能
使结瘤率提高 60%.
表 1 施用尿素和磷肥对根瘤菌 8855结瘤的影响
Tab 1 Effect of urea and K2HPO4 application on nodule
occupancy of rhizobia 8855
处理
T reatment
接种
Inoculate
施 N
Appl
ied N
施 P
Appl
ied P
总瘤数*
Total
nodule
number
接种形成的根瘤*
Nodules from inoculum
数目
Num
ber
根瘤占有率
Ratio of
occupancy
CI* *
- - - 34 0 0
+ - - 40 17 0. 43 0. 39~ 0. 47
- + - 14 0 0
+ + - 17 5 0. 29 0. 26~ 0. 32
- + + 13 0 0
+ + + 20 9 0. 45 0. 42~ 0. 48
* 3 盆大豆根瘤平均值 ( 3 株# 盆- 1 ) Average nodule
number of 3 pots ( 3 plants#pot- 1)
* * CI= 95%置信区间 95% con fidence interval.
从图 2可看出, 施氮肥的大豆产量高
于接种的产量,施氮肥同时接种根瘤菌并
不能进一步提高产量, 但施氮肥和磷肥的
同时接种根瘤菌能进一步提高其产量.
图 2 接种根瘤菌 8855和施用尿素对大豆生长的影响
Fig. 2 Ef fect of rhizobial inoculat ion and urea applicat ion on
soybean grow th .% .产量 Yield( g) ,为 9株大豆平均值 Average yield of 9
soybean seedlings, & .植株干重 Dry w eight of plant ( g) ,
为盛花期 3株植物平均值 Average dry weight of 9 plants
during full blooming,处理相对于对照差异均显著( P<
0. 05 ) , S ignif icant response due to all t reatments ( P <
0. 05) ; 1.未接种,未施肥 Uninoculat ion, 2. 接种,未施肥
Inoculat ion , 1a.未接种,施 N Uninoculation w ith N, 2a.接
种, 施N Inoculat ion w ith N, 1b.未接种,施 N+ P Uninoc
ulat ion w ith N+ P, 2b. 接种,施 N+ P Inoculat ion w ith N
+ P.
3. 4 接种量对大豆结瘤及产量的影响
接种量决定结瘤数量(表 2) . 当接种
量∋2. 2 ∃ 1010#株- 1时, 能使其根瘤占有
率达 43%以上, 并显著增加作物产量, 其
根瘤占有率与作物产量有很好的相关性( r
= 0. 98) ; 而当接种量< 4. 4 ∃ 109#株- 1
时, 根瘤占有率降至 30%以下, 增产效果
不显著. 作物产量与总结瘤数关系不大( r
= 0. 13) .
表 2 接种量对大豆结瘤及产量的影响
Table 2 Effects of inoculation number on soybean nodula
tion and yield
接种量
(个#株- 1)
Inoculat ion
number
( cfu#plant- 1)
作物
产量*
Yield
( g)
总瘤
数* *
Total
nodule
number
接种形成的根瘤* *
Nodules f rom inoculum
数目
Num
ber
根瘤占有率
Rat io of
occpancy
CI* * *
1. 1∃ 1011 1. 747a 43 25 0. 58 0. 54~ 0. 63
2. 2∃ 1010 1. 511a 40 17 0. 43 0. 39~ 0. 47
4. 4∃ 109 1. 253 39 11 0. 28 0. 23~ 0. 33
8. 8∃ 108 1. 279 36 2 0. 06 0. 04~ 0. 08
0 1. 273 34 0 0
a)处理相对于对照差异显著 Sign ificant response due to
t reatment , * 为 9株大豆产量平均值 Average yield of 9
soybean plant , * * 为 3盆大豆根瘤平均值 ( 3株#盆- 1)
Average number of 3 pots ( 3 plants#pot- 1) , * * * CI=
95%置信区间 95% confidence interval.
3. 5 S . f redii 在土壤中的迁移能力
根瘤菌 S . f redi i 8855在所试条件下
的土壤中可作迁移. 从表 3可以看出, 根
瘤菌 8855能在相邻植株根系间迁移,放大
迁移距离约为 30 cm.
表 3 根瘤菌 8855在大豆根系间的迁移
Table 3 Migration of rhizobia 8855 in soybean roots
距离 Distance( cm)
0 15 30 45
总瘤数 39 38 34 30
Total nodule number
接种形成的根瘤数 17 8 1 0
Nodules f rom inoculum
4 讨 论
根瘤菌 GU S基因标记技术操作简便、
快速,试管苗和盆栽实验表明标记菌遗传
特性稳定,对植物根系上的根瘤可直接进
行染色以鉴别接种根瘤菌形成的根瘤,直
接清楚地观察到接种菌在植物根系的结瘤
特性.盆栽实验分析样本量大,增加了统计
上的可靠性.因此,此技术可广泛用于对豆
科根瘤菌进行基因标记, 以研究其在植物
5976 期 孟颂东等:应用 GUS 基因研究弗氏中华根瘤菌的结瘤及效果
根系的存活、迁移及结瘤情况.
根瘤菌 S . f redii 8855对土壤酸碱有
较强的抗逆性,在土壤土著根瘤菌数量较
高的条件下能在土壤中一定范围内迁移,
并在大豆根系有效结瘤, 显著促进其生长,
说明它具有较高的结瘤竞争能力和固氮活
性.
土壤中 N 素或土著菌的固氮量不能
满足作物生长时, 人工接种才会有效果,
单施氮肥和人工接种的大豆产量显著高于
对照证明了这一点, 施加氮肥作物产量明
显高于人工接种的产量, 表明本试验中根
瘤菌剂 S . f r edi i 8855 的接种手段、固氮
活性及共生效率有待进一步改进.
试验结果表明, 当接种根瘤菌根瘤占
有率为43%时即能显著提高大豆产量, 这
和文献报导[ 5]的 66%有一定差距, 原因
可能有二, 一是文献上接种用的根瘤菌剂
为慢生型根瘤菌, 而本文用的 S . f redii
8855为快生型根瘤菌;二是盆栽土壤中虽
然土著根瘤菌相对较多, 但缺乏高效固氮
的菌株.大豆产量与接种根瘤菌形成的根
瘤数量有很大的相关性, 而与总根瘤数相
关性不大,说明土著根瘤菌形成的根瘤不
能有效固氮.
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598 应 用 生 态 学 报 8 卷