全 文 ：棉花植株中的单宁测定方法研究 3
武予清 3 3 　郭予元　(中国农业科学院植物保护研究所 ,北京 100094)
【摘要】　通过 3 种方法测定棉花组织中单宁含量比较表明 ,Folin 酚还原法测定的 4 个品种不同组织和不同生
育期顶叶的含量显著高于正丁醇盐酸法 (即花色素反应 ,专门用于缩合单宁的测定) 近 2 倍 ,说明这种方法测定
出的是相对总酚含量 ,用于表达棉花缩合单宁的含量是不合适的 ,而香草醛法测定结果与正丁醇盐酸法差异不
显著 ,可用于棉花组织单宁含量的测定. 在棉花各个组织中 ,花萼、铃皮和叶片缩合单宁含量较高 ,陆地棉中一
般达 5 %～10 % ;花瓣、花柱子房和铃心中含量较低 (2 %左右) . 顶端嫩叶缩合单宁含量从苗期 (1 %以下) 起不断
增加 ,至吐絮期达最高 (10 %左右) ,表明缩合单宁含量与植物组织成熟衰老和木质化程度密切相关.
关键词 　棉花 　合单宁 　测定方法
Determination of tannin in cotton plant. WU Yuqing and GUO Yuyuan ( Institute of Plant Protection , Chinese A2
cademy of A gricultural Sciences , Beijing 100094) . 2Chin. J . A ppl . Ecol . ,2000 ,11 (2) :243～245.
Three methods were used to determine the tannins content in cotton plant tssues. The tannin content in different or2
gans and terminal leaves of four cotton varieties at different growth stages determined by the Folin’s assay was nearly
two folds as much as that determined by acid butanol assay ,indicating that the Folin’s assay only offers the total phe2
nol content ,but is not suitable for determining the content of condensed tannin in cotton. There was no significant dif2
ference between the results of vanillin assay and acid butanol assay ,and hence ,it is feasible to use vanillin assay to test
the tannin content in cotton. Determinations at boll stage showed that the content of condensed tannin in calyx ,boll
shell and leaf was rather high ,generally up to 5～10 % ,while that in petal , stigma ,ovary and inner boll was lower
(about 2 %) . The condensed tannin content in terminal leaf continually increased from seedling ( < 1 %) to boll stage
(10 % or so) ,indicating that the increased tannin content is closely related to the maturity ,decrepitude and lignification
of cotton tissues.
Key words 　Cotton plant , Condensed tannin , Determination methods.
　　3 国家自然科学基金资助项目 (39770498) .
　　3 3 通讯联系人. 现在河南省农业科学院植物保护研究所 ,郑州
450002.
　　1998 - 12 - 29 收稿 ,1999 - 03 - 10 接受.
1 　引 　　言
包括棉花在内的植物单宁的测定 ,常常因为测定
方法与标准选择不当从而导致其生态学和营养学上研
究结论的错误. 生态学家关注单宁在植食者的食物选
择 ;营养学家需要了解单宁影响家畜 (禽)的取食量、生
长率 (体重增加) 和食物利用率 ;农学家研究单宁在作
物上对病害、霉菌、鸟类和前收获期萌发的抗性[9 ] . 在
所有这些领域中 ,主要问题常常是某一特别性状是否
与单宁含量相关. 自从 1978 年 Chan 等[3～5 ]从棉蕾中
分离出缩合单宁并指出它们对玉米穗螟等害虫具有抗
性潜能 ,在我国棉花品种抗病虫机理与选育研究中 ,单
宁测定方法存在对棉花单宁类化合物的化学结构和化
学特性的片面理解. 王朝生等[11 ]较早地注意到了棉花
抗蚜品种 (系)的单宁含量的分析. 由于该文章误认为
棉花单宁就是水解单宁 ,在定量测定方法上就沿用了
我国食品 (饲料) 中单宁测定方法 Folin 酚还原法 ,这
种方法一直为后来的研究者广泛采用[7 ] . 由于 Folin
法只是用于总酚含量的测定 ,它不能区分单宁酚和非
单宁酚 ,也不能区别酚类与其它易被氧化的物质如抗
坏血酸 ,因此 ,这种测定结果大大夸大了棉花单宁的实
际含量 ,对于抗性机理的阐明和抗性品种的选育都十
分不利. 本试验就棉花植株组织的单宁定量分析方法
进行了探讨.
2 　材料与方法
211 　试验材料
21111 棉花植株组织样品的准备 　棉花在中等肥力试验田中
于 1997 年 4 月 28 日播种 ,品种为中棉 12、中棉 13、池州红叶以
及亚洲棉辽 6. 在棉花生长的 5 个时期 :3 叶期、7 叶期、蕾期、铃
期和吐絮期取植株顶端初展开嫩叶 ,以及铃期植株各个组织
(部位) ,包括全蕾、苞叶、铃皮、铃心和棉蕾的花瓣、花萼、花柱
及子房 ,迅速用冷冻干燥机在 - 70 ℃下 24h 冻干 ,取出粉碎 ,过
80 目筛 ,将冻干粉置于 - 20 ℃下密封保存备用.
21112 样品处理 　准确称取样品冻干粉 50mg ,放入具塞试管
中 ,然后在试管中加入 70 %甲醇 5ml ,封口摇匀 ,在室温下放置
24h ,然后用 5000 转·min - 1离心 10min ,取上清液备测.
212 　测定方法
21211 Folin 酚还原法[6 ] 　碱性溶液中酚类化合物可在以将钨
钼酸还原 ,生成蓝色的化合物. 颜色的深浅与酚含量呈正相关 ,
应 用 生 态 学 报 　2000 年 4 月 　第 11 卷 　第 2 期 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　
CHIN ESE JOURNAL OF APPL IED ECOLO GY ,Apr. 2000 ,11 (2)∶243～245
在 760nm 处有最大吸收峰. 详细测定步骤见文献 [ 11 ] ,标准样
品为单宁酸 ( Fluka) .
21212 正丁醇盐酸法 　花色素反应 ,专门用于缩合单宁的测
定.取 0. 5ml 样品提取液加入刻度为 10ml 具塞试管中 ,然后加
入 5ml 正丁醇盐酸 (95∶5) 溶液 ,封口 ,在 95 ℃的热水中水浴
2h ,在 545nm 下测定吸光度. 缩合单宁标准样品由本课题组分
离制备[9 ] .
21213 香草醛反应 　应专门用于测定缩合单宁及其前体黄烷
醇 (如儿茶素等) ,但是与氧化程度较高的黄酮 (如槲皮素及其
糖苷)不发生反应 ,是从缩合单宁与黄酮类化合物的混合物中
测定缩合单宁含量的较好方法. 将 4 %香草醛的甲醇溶液 3ml、
浓盐酸 1. 5ml 和 0. 5ml 的待测提取液加入以铝箔遮光的试管
中摇匀 ,放入 20 ℃的水浴锅中水浴 20min ,然后在 510nm 处测
定吸光度 ,标准样品为儿茶素 ( Fluka) [9 ] .
3 　结 　　果
311 　测定方法的比较
表 1 和表 2 显示了用 3 种方法测定 4 个品种的不
同组织不同生育期顶端嫩叶单宁含量的成对数据比较
结果 . 香草醛法测得的棉花植株单宁含量与正丁醇盐
酸法测定的结果无显著差异 ,而 Folin 还原法测得的
“单宁”含量相当于正丁醇盐酸法的2倍 ,差异非常显
表 1 　3 种方法测定棉花铃期不同组织单宁含量的成对数据比较差异显著性
Table 1 Comparison among 3 assays for tannin contents in the organization of cotton
品种
Varieties N
正丁醇盐酸法
Acid butanol assay
香草醛法
Vanillin assay
t 测验
t2test Folin 还原法Folin’assay t 测验 3t2test
中棉 12 Zhongmian 12 8 3. 785 3. 768 不显著 No significance 7. 536 0. 01
中棉 13 Zhongmian 13 8 3. 435 5. 121 不显著 No significance 6. 818 0. 05
池州红叶 Chizhou red leaves 8 4. 123 5. 131 不显著 No significance 9. 834 0. 01
辽 6 Liao 6 8 6. 876 9. 75 不显著 No significance 16. 33 0. 013 与正丁醇盐酸法测定的结果相比. 下同.
表 2 　3 种方法测定棉花不同生育期顶端嫩叶单宁含量的成对数据比较差异显著性
Table 2 Comparison among 3 assays for tannin contents in terminal leaves of cotton in the different stages
品种
Varieties N
正丁醇盐酸法
Acid butanol assay
香草醛法
Vanillin assay
t 测验
t2test Folin 还原法Folin’assay t 测验 3t2test
中棉 12 Zhongmian 12 5 2. 506 2. 362 不显著 No significance 7. 536 0. 05
中棉 13 Zhongmian 13 5 1. 96 1. 926 不显著 No significance 6. 844 0. 05
池州红叶 Chizhou red leaves 5 3. 924 3. 466 不显著 No significance 8. 938 0. 05
辽 6 Liao 6 5 4. 916 4. 794 不显著 No significance 11. 322 0. 01
图 1 　棉花不同生育期顶端嫩叶及铃期不同组织的单宁及总酚含量
Fig. 1 Contents of tannin and total phenolics in terminal leaves of varied development stages and in varied tissues of the boll - stage.
A :顶叶 Terminal leaf ,B :蕾 Flower bud ,C :苞叶 Bract ,D :花萼 Calyx ,E :花瓣 Petal ,F :花柱子房 Stigma and ovary , G:铃皮 Boll sell ,H :铃心 Inner part of
boll. a)中棉 12 顶叶 Terminal leaf of Zhongmian 12 ,b)中棉 12 各组织 Tissues of Zhongmian ,c)辽 6 顶叶 Terminal leaf of Liao 6 ,d)辽 6 各组织 Tissues of
Liao 6. 1. 生育期 Stages ,2. 3 叶期 32true leaves ,3. 7 叶期 72true leaves ,4. 蕾期 Flower bud ,5. 铃期Boll stage ,6. 吐絮期Batting. Ⅰ. 香草醛法 Vanillin as2
say , Ⅱ. 正丁醇盐酸法 Acid butanol assay , Ⅲ. Folin 还原法 Folin’s assay.
442 应 　用 　生 　态 　学 　报 　　　　　　　　　　　　　　　　　　　11 卷
著.因此 ,Folin 还原法显然过分夸大了棉花植株体内
缩合单宁的含量 ,这种结果不仅包括了缩合单宁和黄
酮的含量 ,也包括了其它非单宁酚 ,如简单酚、带酚羟
基的氨基酸和抗坏血酸等易被氧化的物质 ,因此 ,
Folin还原法只是从总体上大致反映了棉花植株的总
酚含量.
　　与香草醛反应的除缩合单宁外 ,还包括黄烷醇如
儿茶素、　儿茶素等 ,因此它也可能会使缩合单宁的含
量有点夸大. 事实上 ,由于黄烷醇是缩合单宁合成的前
体 ,其化学特性 (活泼的酚羟基氢) 决定了它以游离态
形式在棉株内存在的量很低. 因此 ,这种方法基本上可
以正确反映棉株体内缩合单宁含量. 由于制作工作曲
线所需要的标准样品儿茶素很容易找到 ,省去了从棉
株中提取分离纯化缩合单宁的麻烦 ,所以香草醛法具
有良好的准确性和实用性.
312 　棉花不同生育期顶端嫩叶、不同组织的单宁
由图 1 可以看出 ,在测试的 4 个品种中 ,3 个陆地
棉品种 (如中棉 12) 的顶端嫩叶单宁含量从 3 叶期到
蕾期变化不大 ,从蕾期开始迅速增长 ,到吐絮期达到高
峰 ;亚洲棉辽 6 从 7 叶期就开始迅速增长 ,这种物候性
变化与 Zummo [12 ]和 Guinn 等[8 ]的报道相似. 同时 ,这
个结果也显示了单宁含量的增加伴随着植株成熟到衰
老的过程. 总酚含量的变化趋势在起始阶段与单宁相
似 ,但一般在铃期达到高峰以后就不再有明显的变化.
对于棉株不同组织单宁含量 ,陆地棉 (中棉 12 ,中
棉 13 和池州红叶)的棉蕾中 ,花萼 > 花柱子房 > 花瓣 ,
对于棉铃则铃皮 > 铃心 ,这基本反映出棉花繁殖器官
各组织的木质化程度及其作为棉铃虫取食对象的食物
质量的差异 ,从而在一定程度上反映了棉铃虫取食习
性形成的重要方面.
　　3 个陆地棉不同组织总酚含量的高低次序与缩合
单宁不一致. 在棉蕾中 ,中棉 12 与中棉 13 表现为花瓣
> 花萼 > 花柱子房 ,而池州红叶为花柱子房 > 花萼 >
花瓣. 说明总酚含量不能反映缩合单宁的含量. 亚洲棉
辽 6 棉株各个组织缩合单宁和总酚含量比较相近 (图
1) ,特别是铃心高于铃皮 ,对于棉铃虫等钻蛀性害虫来
说更具有抗性潜能.
4 　讨 　　论
迄今为止 ,所有研究者在对棉花组织中的植物多
酚化学分析中均表明是以缩合单宁为主 ,并未发现单
宁酸. 棉花植株组织中的缩合单宁在棉花2有害生物的
相互作用中有着非常重要的意义. 除棉铃虫类害虫之
外 ,它还有助于减少红铃虫对棉花种子的为害和抗棉
花叶螨的作用[10 ] 和抵抗一些病原微生物的侵
袭[1 ,2 ,7 ] . 由于我国缺乏对棉花单宁类化合物化学特性
研究以及对单宁概念上的理解不当 ,不仅在棉花单宁
定量分析上一直沿用不适当的方法 ,而且还用这种不
适当的分析方法得出的结论来阐明棉花对害虫的抗性
机理和指导棉花品种的选育. 这给我们以后的工作带
来了极大困难. Folin 酚还原法所测得的结果不能作为
单宁含量 ,但还是可以作为总酚含量.应该指出的是 ,用
Folin 酚还原法测定总酚含量时 ,应选取适当的标准样品 ,
比如我国常用的单宁酸 ,由于单宁酸是由一系列分子量
不同的葡萄糖酰　酸酯组成的化合物 ,不同厂家的产品
中　酸含量差异较大[9] ,因此 ,不同研究者之间的结果可
比性存在一些问题 ,不如直接使用　酸(没食子酸) .
本研究采用的正丁醇盐酸法和香草醛法测定棉花
单宁是国际通用的测定高等植物中缩合单宁含量的常
用方法 ,比较客观地反映了棉花植株中缩合单宁含量
的实际状况 ,并可以与国外的研究结论与应用统一起
来 ,为棉花高单宁品种的选育提供了切实可行的测定
方法.
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作者简介 　武予清 ,男 ,1965 年 3 月生 ,博士 ,副研究员 ,一直从
事农业害虫及寄主植物与昆虫关系研究 ,发表论文 10 余篇 ,获
得省部级成果 6 项. E2mail :yuqingwu @public2. zz. ha. cn
5422 期 　　　　　　　　　　　　　　　　武予青等 :棉花植株中的单宁测定方法研究