全 文 ： 第 28 卷第 2 期 河 南 林 业 科 技 Vol.28 No.2
2 0 0 8 年 6 月 Journal of Henan Forestry Science and Technology Jun. 2 0 0 8
收稿日期：2008-04-16

利用体细胞变异培育沉水樟抗寒品种研究
段艳芳
（河南省野生动物救护中心，郑州 450044）
摘 要：沉水樟是亚热带常绿树种，但由于不能忍受低温而死亡，因此选育沉水樟抗寒品种有十分重要的意义，
为此利用生物技术对沉水樟叶片诱导培育幼苗，并在连续低温下处理，获得抗寒植株。结果表明，在10℃光照
培养箱中，每隔12 h温度降低1℃，处理10 d并将温度稳定在-10℃，此时处理所得的愈伤组织活力最强。在 10
℃光照培养箱处理2 d，5 ℃光照培养箱处理2 d，0 ℃光照培养箱处理2 d，-5 ℃光照培养箱处理2 d，-10 ℃
光照培养箱处理2 d时植株细胞的抗逆生理指标（SOD，POD酶的活性增强，MDA的含量大为减少）大为提高。
关键词：沉水樟；抗寒品种；体细胞变异
中图分类号 ： S 792.23 文献标识码：A 文章编号：1003-2630（2008）02-0010-03
樟树是我国亚热带常绿阔叶林中珍贵的深根
长寿树种，树高 30～50 m， 胸径可达 3 m [1]，但
由于不能忍受低温而死亡，因此有必要选择适合北
方生长的品种。抗寒品种的选育主要通过芽变和实
生变异途径获得，但自然突变存在时间长，栽培选
择范围广，变异无方向性等不足，制约了抗寒品种
规模的扩大。体细胞的无性系变异育种的研究是随
着植物细胞的培养技术的产生而发展起来的，它能
够在一定程度上克服常规育种的上述障碍。由于它
比自然突变的频率高，如果加以人工诱变和定向选
择，有望获得沉水樟的变异体，为下一步选出优良
的品种奠定了基础。
1 材料和方法
1.1 试验材料及处理
试验材料选用 15 年生沉水樟树当年生幼嫩茎
段。先将采回的幼嫩枝条用自来水冲洗，然后在超
净工作台上先用 75%的乙醇消毒 30 s，接着用 0.1 %
的 HgCl2 消毒 5 min ，再用无菌水清洗 4 次，用
吸水纸吸干表面的多余的水分后，将其剪成长度约
为 3 cm 的小段接种在不含植物激素的 MS 培养基
上（培养基中附加 2 %的蔗糖和 0.7 %的琼脂粉，聚
乙烯吡络烷酮 1 500 mg/ L），在培养温度为 25 ±2
℃、光照强度为 1 500 Lx、光照时间 16 h/d 的培养
室内培养。40 d 可以获得 8 cm 高的无菌苗,无菌苗
叶片作为植株再生的外植体。
1.2 试验方法
1.2.1 叶片诱导愈伤组织培养基的筛选 将上面获
得的沉水樟无菌苗叶片剪成 2cm2 的小块放在 MS
基本培养基上[2]，附加 0.1~0.3 mg/ L 的 IBA（简写
为 0.1~0.3，下同）、1~7 的 BA（见表 1）。培养基
中蔗糖和琼脂浓度分别为 3.0 %和 0.78 %。每个植物
激素浓度组合 10 瓶，每瓶 3 个外植体。在光照强
度为 1 500 Lx、光照时间 16 h/d 的条件下培养。30
d 时，观察、统计愈伤组织诱导情况。
1.2.2 低温处理愈伤组织 将获得的沉水樟无菌苗
叶片剪成 2 cm2 的小块放入已筛选出的 MS﹢0.2
IBA﹢3 BA 培养基中，每瓶 3 个外植体，处理 100
瓶。分别将它们置于光照培养箱中，培养温度 25 ±
2℃，光照强度 1 500 Lx，15 d 后产生的愈伤组织，
分成 5 组。第 1 组置于 10℃光照培养箱处理 2 d，5
℃光照培养箱处理 2 d，0 ℃光照培养箱处理 2 d，
-5 ℃光照培养箱处理 2 d，-10℃光照培养箱处理
2 d。第 2 组置于 4℃光照培养箱处理 4 d，-4℃光
照培养箱处理 4 d，-10℃光照培养箱处理 2 d。第
3 组置于 10 ℃光照培养箱，每隔 12 h 温度降低 1
℃，最终将温度稳定在-10 ℃，处理 10 d。第四组
置于 10 ℃光照培养箱处理 5 d，0℃光照培养箱处
理 1 d，-10℃光照培养箱处理 4 d。第五组置于 10
℃光照培养箱处理 5 d，-10℃光照培养箱处理 5 d。
将上面存活的愈伤组织置于 25 ±2℃，光照强度 1
500 Lx 的光照培养箱中。
1.2.3 愈伤组织的细胞活力检测 用 TTC 测定[3]。称
取低温处理愈伤组织 300 mg，放入具有刻度的 10
ml 试管中，加入 5 ml 氯化三苯基四氮唑 (TTC)试
剂，在25℃的恒温箱中静止培养20~24 h。吸取TTC
溶液，用蒸馏水冲洗 3 次，加入 5 ml 95 %乙醇，将
试管放入 75℃水浴中，加热 30 min，提取红色的三
苯基四氮唑。用 721 分光光度计在 485 nm 处测试
三苯基四氮唑的吸收值（25 ±2℃条件下产生的愈
伤组织为对照）。用相对存活率表示愈伤组织或细
胞的活力。
相对存活率=处理愈伤组织（细胞）的 TTC 值
/对照的 TTC 值×100 %
1.2.4 愈伤组织芽诱导培养基的筛选 将存活的愈
伤组织放在WPM培养基[附加0.1~0.3 mg/ L的 IAA
或 IBA（简写为 0.1~0.3 IAA 或 IBA，下同）、1~7
的 BA]上。培养基中蔗糖和琼脂浓度分别为 3.0 %
和 0.78 %。每个植物激素浓度组合 10 瓶，每瓶放入
3 块愈伤组织（每块体积约为 1cm3），30 d 时，观
第2 期 段艳芳：利用体细胞变异培育沉水樟抗寒品种研究 11
察、统计芽诱导结果，诱导出的芽以肉眼清晰可见
为标准。
1.2.5 低温处理幼芽 将愈伤组织（第 3 组）放入已
筛选出的愈伤组织芽诱导培养基中，每瓶放入 3 块
愈块伤组织，处理 100 瓶。分别将它们置于光照培
养箱中，培养温度 25 ±2℃,光照强度 1 500 Lx，40
d 后，可获得 3 cm 左右的不定芽。将它们在常温下
放置 5 d 后，分成五组置于光照培养箱中：第一组
置于 10℃光照培养箱处理 2 d，5℃光照培养箱处理
2 d，0℃光照培养箱处理 2 d，-5℃光照培养箱处
理 2d，-10℃光照培养箱处理 2 d。第 2 组置于 4
℃光照培养箱处理 4 d，-4℃光照培养箱处理 4d，
-10℃光照培养箱处理 2 d。第 3 组置于 10℃光照培
养箱，每隔 12 h 温度降低 1 ℃，最终将温度稳定
在-10℃，处理 10 d。第 4 组置于 10℃光照培养箱
处理 5 d，0℃光照培养箱处理 1 d，-10℃光照培养
箱处理 4 d。然后再将存活的苗子置于室温下培养。
1.2.6 酶活性的检测 超氧化物歧化酶（SOD）活
性测定采用氮蓝四唑（NBT）光还原法[4]，过氧化
物（POD ）酶的活性采用邻甲基苯酚子氧化法[5]。
2 结果与分析
2.1 沉水樟叶片愈伤组织诱导
由 IBA 和 BA 对沉水樟叶片愈伤组织诱导的结
果（表 1）可以看出，沉水樟叶片在 IBA 与 BA 不
同浓度组合培养基上愈伤组织诱导率存在较大的
差异。当 IBA 浓度为 0.1 时，随 BA 浓度的升高，
愈伤组织诱导率从由 10.0 %升高到 33.3 %；当 IBA
浓度为 0.3 时，随 BA 浓度的升高，愈伤组织的诱
导率逐渐增大，最大的愈伤组织诱导率为 83.3 %；
当 IBA 浓度为 0.2 时，愈伤组织诱导率呈现先上升
再下降的趋势，在此激素浓度组合中，愈伤组织最
大诱导率可达 100 %。比较以上结果，选择 MS﹢0.2
IBA﹢3 BA为沉水樟叶片诱导愈伤组织的最适培养
基。
表1 IBA与BA浓度组合对沉水樟叶片愈伤组织诱导的影响
IBA 浓度
/（mg/ L）
IBA 浓度
/（mg/ L）
外植体数
/（个/组合）
诱导出愈伤组织的
外植体/（个/组合） 愈伤组织诱导率/%
0.1 1 30 3 10.0
0.1 3 30 4 13.3
0.1 5 30 6 20.0
0.1 7 30 10 33.3
0.2 1 30 18 60.0
0.2 3 30 30 100.0
0.2 5 30 20 66.7
0.2 7 30 19 63.3
0.3 1 30 15 50.0
0.3 3 30 21 70.0
0.3 5 30 24 80.0
0.3 7 30 25 83.3
2.2 低温处理对愈伤组织活力的影响
低温处理沉水樟叶片愈伤组织后，用 TTC 法测
定[3] 低温对愈伤组织活力的影响。结果表明，第 5
组的 TTC 值最低，相对存活率也最低，可能是降温
幅度过大，细胞内水分来不及排除，而形成大的冰
晶对细胞内部的结构产生伤害；第 3 组的 TTC 值最
高，相对存活率也最高，说明缓慢降温的过程实际
上就是细胞内水分连续不断地被排除到细胞外的
过程。从表中可以看出愈伤组织的存活率与 TTC 值
（即细胞的活力）呈正相关。由此可以看出将愈伤
组织置于 10℃光照培养箱中，每隔 12 h 降低 1℃，
最终稳定在-10℃，处理 10 d 的方法，使愈伤组织
的相对存活率最高。
2.3 芽诱导培养基的筛选
2.3.1 IAA 和 BA 植物激素组合对低温处理愈伤组织
诱导芽的影响
由 IAA 和 BA 对低温处理愈伤组织诱导芽的结
果可以看出，在增殖培养基上低温处理沉水樟叶片
产生的愈伤组织均没有诱导出芽，即芽的诱导率为
0。这说明 IAA 和 BA 对沉水樟叶片诱导芽不敏感。
2.3.2 低温处理对 IBA 和 BA 植物激素组合愈伤组
织诱导芽的影响
表 2 低温对愈伤组织诱导的影响
编号 对照的 TTC 值 处理的 TTC 值 相对存活率/%
1 1.78 0.72 40.4
2 1.78 1.06 59.6
3 1.78 1.29 72.4
4 1.78 0.85 47.8
5 1.78 0.58 32.6
由 IBA 和 BA 对低温处理愈伤组织诱导芽的结
果可以看出，在 IBA 与 BA 不同浓度组合培养基
上愈伤组织诱导率存在较大的差异。当 IBA 为 0.1
和 0.2 时随着 BA 浓度的增加，芽诱导率逐渐增加，
最大诱导率为 60 %。当 IBA 为 0.3 时，芽诱导率均
为0。从诱导率的高低来看可以选择WPM+0.2 IBA+
7 BA 来作为芽的诱导培养基。
2.4 抗寒沉水樟 SOD酶活性和 POD酶活性检测
SOD 可以清除体内的自由基，从而减轻膜脂过
氧化的程度，避免了新陈代谢紊乱，经过低温处理
的沉水樟抗寒性明显提高了。尤其第 1 组的 SOD
酶活性最高，这是最佳的选择处理温度，第 2 组的
降温幅度比较大，自由基破坏了细胞膜系统导致了
植物的抗寒性明显下降。因此，我们选择第 1 组的
12 河 南 林 业 科 技 第 28 卷
条件来处理沉水樟的幼苗，可提高植物的抗寒性。
表3 IAA与BA浓度组合对沉水樟叶片愈伤组织诱导的影响
IBA 浓度
/（mg/ L）
IBA 浓度
/（mg/ L）
外植体数
/（个/组合）
诱导出愈伤组织的
外植体/（个/组合） 诱导率/%
0.1 1 30 0 0
0.1 3 30 0 0
0.1 5 30 0 0
0.1 7 30 0 0
0.2 1 30 0 0
0.2 3 30 0 0
0.2 5 30 0 0
0.2 7 30 0 0
0.3 1 30 0 0
0.3 3 30 0 0
0.3 5 30 0 0
0.3 7 30 0 0
表4 IBA与 BA浓度组合对沉水樟叶片愈伤组织诱导的影响
IBA 浓度
/（mg/ L）
IBA 浓度
/（mg/ L）
外植体数
/（个/组合）
诱导出愈伤组织的
外植体/（个/组合） 诱导率/%
0.1 1 30 0 0
0.1 3 30 3 10.0
0.1 5 30 5 16.7
0.1 7 30 12 40.0
0.2 1 30 3 10.0
0.2 3 30 10 33.3
0.2 5 30 15 50.0
0.2 7 30 18 60.0
0.3 1 30 0 0
0.3 3 30 0 0
0.3 5 30 0 0
0.3 7 30 0 0
沉水樟体内的 POD 能够及时的清除 SOD 产生
的 H2O2，从而减轻细胞受到伤害，也降低了膜得透
性，使植物的抗寒性明显增强。在第 1 组的连续低
温处理下 POD 酶的活性最大，沉水樟体内的 POD
酶可以清除过多的 H2O2。
3 讨论
南方常绿树种引种到北方时，由于不能忍受北
方冬季低温而常常死亡。这主要是由于南方林木的
遗传特性所决定。如要改变其生境，必然会导致体
内基因表达的变化，随之产生抵御逆境的生理生化
变化，当这些变化与生境变化相适应时，生物就能
够存活，否则，就会导致生物的死亡。细胞是构成
生物的最小活体单位，包含生物的全部遗传信息。
低温处理可以引起林木细胞 DNA 发生突变，将长
期在低温条件下能够存活细胞突变体经过诱导分
化出芽，并生长发育为完整的植株就可在低温条件
下生长。 因此，在本实验中，我们首先采用低温
对细胞（愈伤组织）进行低温处理，使细胞的遗传
物质发生适应低温的变化，去除死亡的愈伤组织，
保留基因发生突变的细胞系，并从中筛选出在低温
条件下能够生长的突变体，进一步使其再生为完整
的植株。这些植株再经过抗寒锻炼，最终能够适应
北方冬季寒冷的气温条件。已有的樟树引种驯化主
要是对樟树种子萌发前进行为期 70 d 的层积处理
（也就是沙埋的方法），以提高樟树的萌发率和出
苗率，随后在幼苗的生长发育过程中给予良好的
水、肥管理及防寒越冬措施，通过这些栽培技术的
改善使樟树逐步适应低温环境。这种方法所用时间
很长，管理过程和措施繁杂，最重要的是无法得到
具有抗寒遗传特性的樟树。而我们的实验是利用体
细胞变异和低温筛选的方法，能够在较短的时间内
得到具有抗寒遗传特性的沉水樟，通过抗寒生理检
测，已确定这些抗寒品种具有良好的抗寒生理指
标。因此，我们的方法不仅大大缩短了育种时间，
简化了育种程序和过程，而且使沉水樟的抗寒遗传
特性得到巩固和提高。

参考文献：
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（责任编辑：王团荣）