全 文 ：分析测试 中国食品添加剂ChinaFoodAdditives
不同食品中侧柏酮 、龙蒿脑 、
黄樟素和甲基丁香酚的含量测定
吴婷 1, 2 , 金其璋 2
(1.上海应用技术学院 , 上海 200235;2.上海香料研究所 , 上海 200232)
摘 要:本文建立了不同加香食品中以 1, 4-二溴苯和乙酸苯乙酯为内标测定天然有害物侧柏酮 、 龙蒿
脑 、 黄樟素和甲基丁香酚含量的气相色谱方法 , 保留时间定性 , 内标法定量。前处理方法采用同时蒸馏萃取
方法以二氯甲烷作为提取剂将待测物从各食品基质中分离。结果表明 , 在实验浓度范围内 , 四种待测物与内
标物峰面积比值与浓度比值呈现良好线性关系 , 相关系数为 0.99954 ～ 0.99973;方法检出限分别为侧柏酮
0.16μg/mL、 龙蒿脑 0.2μg/mL、 黄樟素 0.2μg/mL和甲基丁香酚 0.4μg/mL;空白加标回收率为 82.47% ～
98.06%, 相对标准偏差为 1.09% ～ 4.05%, 获得了良好的准确性和精密度;考察了不同基质对待测物回收率
的影响。通过对市场上 5种食品的检测 , 表明该法可实现对样品进行灵敏 、 准确的定性定量分析 , 本方法可
靠 , 能满足实际样品的检测及监控的要求。
关键词:侧柏酮;龙蒿脑;黄樟素;甲基丁香酚;气相色谱法;同时蒸馏萃取
中图分类号:TS202.3 文献标识码:A 文章编号:1006-2513(2010)01-0223-06
Determinationofthujone, estragole,
safroleandmethyleugenolinfood
WUTing1, 2 , JINQi-zhang2
(1.ShanghaiInstituteofTechnology, Shanghai200235;
2.ShanghaiResearchInstituteofFragrance＆FlavorIndustry, Shanghai200232)
Abstract:AGCmethodwasdevelopedforthedeterminationofsomelimitedusedsubstancessuchasthujone, estrago-
le, safrole, andmethyleugenolinvariousfood.Theinternalstandardwas1, 4-dibromobenzeneandphenethylace-
tate.Thesubstanceswereidentifiedbyretentiontimesandquantifiedbyinternalstandard.Thecompoundswereisola-
tedfromfoodmatricesbyemployingsimultaneousdistillationextraction(SDE)techniqueandusingdichloromethaneas
extractionsolvent.Theresultsshowedthatgoodlinearityforalfourcompoundsintheexperimentalconcentration, with
corelationcoefficientsrangingbetween0.99954 and0.99973.Thedetectionlimitswere0.16μg/mL, 0.2μg/mL,
0.2μg/mL, and0.4μg/mLforthujone, estragole, safrole, andmethyleugenol, respectively.Recoveriesrangewas
between82.47 ～ 98.06%, andtherelativestandarddeviationswerewithin1.09% ～ 4.05%.Theeffectsofdiferent
foodmatricesontherecoveriesofthecompoundswerealsoexamined.Thismethodwasfurtherverifiedbyanalyzingthe
realsamplesfromlocalmarket.
Keywords:thujone;estragole;safrole;methyleugenol;GC;SDE
收稿日期:2009-09 -15
作者简介:吴婷 (1984 -), 女 , 硕士 , 研究方向:香精香料分析和法规。
223
中国食品添加剂ChinaFoodAdditives分析测试
人类利用植物中的天然香味物质作为调味剂
加入到食品中已有很长的历史 , 然而植物提取物
成分十分复杂 , 随着人们对食品安全的日益关注
和毒理学的发展 , 发现植物提取物尤其是精油中
一些化合物对人体造成不同性质的伤害[ 1] 。侧柏
酮 、 龙蒿脑 、 黄樟素和甲基丁香酚都属于广泛存
在于多种植物中 , 而且被证实对人体健康具有威
胁的天然有害物质。这些成分由于含量低 , 难以
从天然复合物中分离 , 因而随着食品加工过程不
可避免带入食品中。 FAO/WHO食品添加剂联合
专家委员会 (JECFA)对包括这四种天然有害物
质在内的一些化合物进行了定量危险性评估 , 国
际及各国相关部门如联合国国际食品法典委员会
(CAC)、欧盟食品安全局 (EFSA)、 美国食品药
品管理局 (FDA)等对其在食品中的最大浓度限
量也作出了相应的规定[ 2 ～ 6] , 但目前官方尚未公
布测定食品中这些有害成分的分析方法 。
表 1 欧盟规定四种天然有害物质在不同食品中的最大浓度限量 [ 2]
物质名称 食品名称 限量 (ppm)
侧柏酮 (α-、 β -)
(Thujone)
含醇饮料 (不包括从蒿属植物制得的)
含醇饮料 (从蒿属植物制得的)
软饮料 (从蒿属植物制得的)
10
35
0.5
龙蒿脑
(Estragole)
乳制品
加工水果 、 蔬菜、 坚果和种子
鱼制品
软饮料
50
50
50
10
黄樟素
(Safrole)
肉制品
鱼制品
汤料和酱 (沙司)
软饮料
15
15
25
1
甲基丁香酚
(Methyleugenole)
乳制品
肉制品 (包含禽肉制品)
鱼制品
汤料和酱 (沙司)
即食调料
软饮料
20
15
10
60
20
1
相关期刊报道了一些关于特定食品中这四种
天然有害物质分析方法的研究 , 如 GiuseppeMica-
li等人使用 HPLC测定酒精饮料中的侧柏酮[ 7] ;
AnneteZeler等人通过稳定同位素稀释法测定茴
香茶中龙蒿脑含量 [ 8] ;Youk-MengChoong等人
则用 GC测定软饮料中的黄樟素 [ 9] ;F.Siano等
人曾用 GC/MS分析过多种食品中龙蒿脑 、 黄樟
素和甲基丁香酚的含量 [ 10]等。以上方法有些使用
到特殊仪器 , 有些步骤繁琐 , 成本昂贵且适用的
食品范围非常有限 。为了正确评价和保证食品的
安全性 , 本研究旨在建立一套准确快速 、 经济可
行的分析方法 , 同时测定不同基质食品中这四种
有害物质的含量 。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
市售吐司面包 , 番茄酱 , 广式香肠 , 百事可
乐 , 可口可乐 , 葡萄酒 (酒精度:12%)。按商
224
分析测试 中国食品添加剂ChinaFoodAdditives
用配方自制的不含香料的番茄酱和香肠 。
二氯甲烷 (国药集团 , 分析纯);无水乙醇
(国药集团 , 分析纯);侧柏酮 (SigmaAldrich,
α-70%, β -10%);龙蒿脑 (昆山漂润香料有
限公司 , ≥99.5%);黄樟素 (重庆日用化学研
究所 , ≥95.8%);甲基丁香酚 (SigmaAldrich,
≥99%);1, 4 -二溴苯 (Fluka, ≥97%);乙酸
苯乙酯 (上海香研公司 , ≥99.7%)。
浓度水平为 10mg/mL侧柏酮 、龙蒿脑 、黄樟
素和甲基丁香酚的混合标准储备液 , 10mg/mL1,
4 -二溴苯和 5mg/mL乙酸苯乙酯混合内标溶液 。
1.2 仪器与设备
同时蒸馏萃取装置 , 旋转蒸发仪。安捷伦
6890气相色谱仪 , 配有自动进样器和 FID检测
器 , 纯水仪 (Mili-Q, 美国 Milipore公司)。
1.3 气相色谱分析条件
色谱柱:HP-5 (30m×0.32mm×0.25μm);
程序升温:初始稳定 60℃, 保留 5min, 以 3℃/
min升至 150℃, 再以 15℃/min升至 280℃, 保
留 10min, 全部程序时间为 53.67min;进样口温
度:250℃;进样方式:10 ∶1分流进样;进样
量:1μL;载气:高纯氮气 (99.99%);流速:
1mL/min;FID检测器温度:250℃;数据处理:
AgilentChemstation。
1.4 测定步骤
同时蒸馏萃取装置两个蒸馏瓶内分别加入:
A瓶 (500mL), 待测食品和约 200mL蒸馏水;B
瓶 (100mL), 40mL二氯甲烷。开冷凝水 , 两蒸
馏瓶加热温度需保持在能使瓶内溶液沸腾的最低
温度 , 整个过程约 90min。蒸馏结束后 , 含有提
取物的二氯甲烷溶液用适量无水硫酸钠干燥 , 转
移到 24/29口 100mL蒸馏瓶内 , 用旋转蒸发仪于
50℃下浓缩至 1 ～ 2mL, 再转移到 10mL容量瓶 ,
加入 0.2mL内标溶液 , 用无水乙醇定容。取 1mL
进行气相色谱分析 。
1.5 空白加标实验
分别在纯水中加入一定量的混合标准储备
液 , 制成低 、 中 、 高三个不同浓度水平 (10ppm、
30ppm、 60ppm)的加标样品 , 按照 1.4测定步骤
进行样品处理并检测 , 以测得量和添加量之比计
算回收率 。每个加标浓度制备三个平行样品 , 根
据回收率结果的平均值得到平均回收率及精密
度 。
1.6 基质影响实验
按以下配方制备不加香食品基质:①番茄
酱:番茄 200g, 糖 40g, 盐 5g, 油 5g, 醋 15mL;
②香肠:猪肉 500g, 糖 29g, 盐 29g, 白酒 35g,
味精 1.5g。在当地市场购买无加香酒类和面包。
准确称取以上食品基质每份 100g(含醇样品
视酒精含量而称取相应的样品量 , 原则为前处理
后的乙醇体积不应超过 10mL定容体积。)于
500mL蒸馏瓶中 , 固体食品如香肠 、 面包需切碎
切细 , 加入纯水至烧瓶体积约 1 /2处 , 搅拌均匀。
加入一定量的混合标准储备液 , 制成低 、 中 、 高
三个不同浓度水平 (10ppm、 30ppm、 60ppm)的
加标样品 (含醇样品另附加制备 1ppm浓度样
品), 按照 1.4测定步骤进行样品处理并检测 ,
以测得量和添加量之比计算回收率 。
1.7 食品样品实验
准确称取食品样品 100g(葡萄酒为 50g)于
500mL蒸馏瓶中 , 固体食品如香肠 、 面包需切碎
切细 , 加入纯水至烧瓶体积约 1 /2处 , 搅拌均匀。
按照 1.4测定步骤进行样品处理并检测 , 每种食
品制备 2个平行样。
2 结果与分析
2.1 内标物的选择
内标物的选择是内标法的关键 。内标物应是
原样品中不存在的纯物质 , 性质与预测组分相
近 , 不与被测样品起化学反应 , 色谱峰尽可能位
于几个预测组分中间且不重叠 [ 11] 。考虑到食品中
干扰组分较多 , 本实验使用两种内标物以提高定
量准确性。如标准溶液色谱图所示 , 1 , 4 -二溴
苯与乙酸苯乙酯是良好的内标物 。考虑到文章篇
幅 , 在样品组分无干扰的情况下本文仅列出以 1,
4-二溴苯为内标进行计算而获得的数据 。
2.2 前处理方法的选择
2.2.1 同时蒸馏萃取时间的选择
为了确定最佳的同时蒸馏萃取时间 , 对比在
三种 SDE时间下四种物质的回收率 , 得到同时蒸
馏萃取时间与回收率的关系图如下:
225
中国食品添加剂ChinaFoodAdditives分析测试
(1.α+β -侧柏酮 , 保留时间: 18.121 ±0.007min;2.1, 4-二溴苯 , 保留时间:21.943±0.006min;
3.龙蒿脑 , 保留时间:22.435 ±0.01min;4.乙酸苯乙酯 , 保留时间: 25.056±0.005min;
5.黄樟素, 保留时间: 26.478±0.009min;6.甲基丁香酚 , 保留时间:31.385±0.013min)
图 1 标准品和内标混合溶液色谱图
图 2 同时蒸馏萃取时间与回收率的关系
根据实验结果可知 , 过短的时间导致提取不
完全 , 过长的时间则目标物容易损失 , 同时蒸馏
萃取 90min左右有最高的回收率 , 因此选 90min
作为实验条件 。
2.2.2 旋转蒸发水浴温度的选择
四种天然有害物都属于易挥发物质 , 在浓缩
过程中不可避免有一定损失。浓缩过程时间不宜
过长 , 温度不宜过高。二氯甲烷的沸点为 40℃,
室温环境下水浴温度为 50℃和 60℃时浓缩时间分
别为 60min和 10min。比较两种温度下旋转蒸发
回收液中目标物含量 , 可以看出 50℃时目标物损
失明显减少 , 若水浴温度低于 50℃则浓缩周期将
大大延长。因此 , 宜采用 50℃水浴温度。
2.3 标准曲线的建立
分别准确吸取 10mg/mL混合标准储备液 1、
0.5、 0.2、 0.1、 0.05、 0.02、 0.01mL于 10mL
容量瓶中 , 各加入 0.2mL10mg/mL混合内标溶
液 , 用无水乙醇定容 , 按浓度从低到高的顺序依
次进行三次平行气相色谱分析。以保留时间定
性 , 取三次测得标准品与内标物峰面积之比平均
值为纵坐标 , 标准物与内标物的浓度之比为横坐
标分别绘制标准曲线 。
表 2 四种天然有害物质的线性关系
线性回归方程 相关系数 线性范围
侧柏酮 Y=1.98516X-0.04849 0.99969 8～ 800μg/mL
龙蒿脑 Y=2.41841X-0.07578 0.99973
黄樟素 Y=1.99837X-0.07349 0.99963 10～ 1000μg/mL
甲基丁香酚 Y=2.11504X-0.12349 0.99954
226
分析测试 中国食品添加剂ChinaFoodAdditives
图 3 不同水浴温度下回收溶剂的气相色谱图 (上:60℃, 下:50℃)
2.4 方法的检出限和定量限
以 3倍信噪比考察四种天然有害物的检出限 ,
结果分别为:侧柏酮 0.16μg/mL、 龙蒿脑 0.2μg/
mL、 黄樟素 0.2μg/mL和甲基丁香酚 0.4μg/mL。
以 10倍信噪比考察四种天然有害物的测定
限 , 结果分别为:侧柏酮 0.5μg/mL、 龙蒿脑
0.7μg/mL、 黄樟素 0.8μg/mL和甲基丁香酚 1μg/
mL。
2.5 方法的准确度和精密度
空白加标回收实验结果见下表。四种天然有
害物质的回收率范围分别为 85.68% ～ 90.26%、
82.47% ～ 89.54%、 89.49% ～ 92.86%、 96.31%
～ 98.06%, 相 对 标 准 偏 差 分 别 为 2.4%、
4.05%、 1.77%、 1.09%, 满足检测方法准确性
和重复性的要求 。
表 3 四种天然有害物质加标回收率和相对标准偏差
待测物 添加水平 (ppm) 测定值 (ppm) 平均回收率 (%) 相对标准偏差 (%)
8.1128 6.9997 6.9364 6.917 85.68
侧柏酮 24.3384 21.649 21.5687 21.8559 89.12 2.4
48.6768 43.6144 44.072 44.1158 90.26
10.01567 8.2629 8.2499 8.2689 82.47
龙蒿脑 30.04701 26.8831 26.835 26.9522 89.49 4.05
60.09402 53.5618 53.7601 54.1087 89.54
9.657598 8.5508 8.6609 8.7169 89.49
黄樟素 28.972794 26.7767 26.5217 26.7274 92.07 1.77
57.945588 53.6982 54.1096 53.6228 92.86
9.97623 9.62108 9.5842 9.6181 96.31
甲基丁香酚 29.92869 29.4109 29.369 28.8094 97.55 1.09
59.85738 58.355 58.4328 59.2947 98.06
227
中国食品添加剂ChinaFoodAdditives分析测试
2.6 基质影响
下表为各不加香食品基质中四种有待测物不
同浓度水平下的平均回收率 。
表 4 不加香食品基质加标回收率 (%)
侧柏酮 龙蒿脑 黄樟素 甲基丁香酚
番茄酱 89.08 88.6 90.56 95.83
香肠 83.52 68.18 61.34 58.41
葡萄酒 95.41 92.05 92.11 91.59
面包 90.45 90.23 91.56 95.68
实验结果说明:
(1)纤维素类和淀粉类基质对四种待测物的
影响不明显 , 肉制品类基质影响较大。
(2)沸点高的待测物比沸点低的待测物受基
质影响更大。
2.7 食品检测
为考察本方法的适用性 , 按上述实验方法对
市售五种食品进行了检测 。结果显示 , 除可乐
外 , 其它四种食品中均未检测出四种天然有害
物。而可乐样品中 , 黄樟素浓度低于方法测定
限。
表 5 市售食品样品结果
食品 香肠 面包 番茄酱 可乐 葡萄酒
检测份数 2 3 2 2 2
测得浓度 ND ND ND
(1)由于食品基质比较复杂 , 分离难度很
大 , 除肉制品基质中四种待测物的提取不十分理
想外 , 对于大多数食品 , 同时蒸馏萃取的前处理
方法能很好地解决待测物与干扰组分的分离问
题 。
(2)实验数据表明 , 本方法简便 、 快速 、 高
效 , 具有较高的准确度和精密度 , 待测物线性关
系良好 , 是一种可行的分析方法。
参考文献:
[ 1 ] F. Bakkalietal., BiologicaleffectsofEssentialoils,
Food＆ChemicalToxicology46 (2008) 446-475.
[ 2] Regulation(EC)NO1334/2008, oficialJournaloftheEurope-
anUnion2008.12. 31.
[ 3] Thujone(SCF, December2002):htp://ec.europa.eu/
food/fs/sc/scf/out162 en.pdf.
[ 4] 1-Allyl-4-methoxybenzene(estragole)(SCF, September2001):
htp://ec.europa.eu/food/fs/sc/scf/out104 en.pdf.
[ 5 ] 1-Alyl-3, 4-methylene dioxy benzene(safrole) (SCF,
December2001):htp://ec.europa.eu/food/fs/sc/scf/out116
en.pdf.
[ 6] 4-Alyl-1, 2-dimethoxybenzene(methyleugenol)(SCF, September
2001):htp://ec.europa.eu/food/fs/sc/scf/out102 en.pdf.
[ 7] GiuseppeMicali, FrancescoLanuzza, HPLCdeterminationofα
-andβ -thujone, potentialytoxiccomponentsofnaturalfla-
vourings, inalcoholicbeverages.FlavourandFragranceJour-
nal10 (1995) 329-333.
[ 8] AnneteZeler, MichaelRychlik, Quantitationofestragoleby
stableisotopedilutionassays.LWT-FoodScienceandTech-
nology42 (2009) 717 -722.
[ 9] Youk-MengChoong, Hsiu-JungLin, Arapidandsimplegas
chromatographicmethodfordirectdeterminationofsafroleinsoft
drinks.JournalofFoodandDrugAnalysis, Vol. 9, No. 1
(2001) 27 -32.
[ 10] F.Siano, C.Ghizzoni, Determinationofestragole, safrole
andeugenolmethyletherinfoodproducts.FoodChemistry81
(2003) 469-475.
[ 11] 汪正范.色谱定性与定量 , 北京:化学工业出版社 , 2007
年 10月 , 第 2版.
《中国食品添加剂 》 杂志—双核心期刊 , 欢迎投稿 !
228