全 文 ：豹皮樟总黄酮体外对酒精性脂肪肝大鼠肝细胞脂肪变性的影响
胡成穆，曹 琦，解雪峰，刘洪峰，丁 琦，李 俊
(安徽医科大学药学院 安徽天然药物活性研究省级实验室，安徽 合肥 230032)
摘要:目的 探讨豹皮樟总黄酮( TFLC) 对酒精性脂肪肝( AFL) 大鼠肝细胞脂肪变性的影响。方法
大鼠自由饮用含乙醇饮料，起始浓度为 5%，依次增加为 10%，15%，20%，25%，30%和 35%，每个浓度
持续 1 周，第 8 周 ～第 12 周浓度为 40%的方法制备大鼠 AFL模型，原位二步灌流法分离 AFL大鼠肝细胞，
用细胞角蛋白 18( CK18) 抗体进行肝细胞鉴定。肝细胞培养 16 h 后加入 TFLC 1，10 和 100 mg·L －1或谷
胱甘肽( GSH) 10 mmol·L －1孵育 48 h。MTT 法测定肝细胞存活，用试剂盒方法检测肝细胞丙氨酸转氨酶
( ALT) 和天冬氨酸转氨酶( AST) 活性以及肝细胞内甘油三酯( TG) 含量，免疫组化和逆转录 PCR方法测定
脂肪分化相关蛋白( ADRP) 、过氧化物酶体增殖物激活受体 γ( PPARγ) mRNA 和蛋白表达的变化。结果
TFLC对正常大鼠肝细胞存活无明显影响。TFLC 100 mg·L －1明显增加 AFL 大鼠肝细胞存活( P ＜0． 05) 。
AFL大鼠肝细胞培养液 ALT和 AST活性分别为( 63 ±12)和( 74 ±19) U·L －1，TFLC 10 和 100 mg·L －1分别
将 ALT活性降低到( 42 ±12)和( 44 ±8) U·L －1 ( P ＜0． 05) ，将 AST 活性降低到( 46 ±14) 和( 47 ±8) U·L －1
( P ＜0． 05) 。AFL 大鼠肝细胞内 TG 含量为( 2． 3 ±0． 6) mmol·L －1，TFLC 10 和 100 mg·L －1分别将 AFL
肝细胞内 TG含量降低到( 1． 4 ±0． 3) 和( 1． 5 ±0． 5) mmol·L －1 ( P ＜0．05)。AFL 肝细胞 ADRP和 PPARγ
阳性表达细胞分别为( 41 ±6) %和( 37 ±10) %，TFLC 100 mg·L －1治疗组 ADRP和 PPARγ阳性表达细胞分
别降低为( 26 ±6) % ( P ＜0． 01) 和( 25 ±5) % ( P ＜0． 05) 。结论 TFLC可能通过改善肝细胞活性、减少肝
细胞内 TG生成、抑制 ADRP表达及调控肝细胞 PPARγ的表达，从而改善 AFL大鼠肝细胞的脂肪变性。
关键词:脂肪肝，酒精性; 豹皮樟总黄酮; 肝细胞; 脂肪分化相关蛋白; 过氧化物酶体增殖物激活受体 γ
中图分类号:R285． 5 文献标志码:A 文章编号:1000-3002(2013)02-0193-07
DOI:10． 3867 / j． issn． 1000-3002． 2013． 02． 012
酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver，AFL)是因长
期、大量饮用乙醇类饮料所致的肝细胞内脂质蓄积超
过肝湿重 5%的肝损害性疾病。乙醇本身具有热量，
长期大量摄入，不仅损害脂肪氧化，还可刺激脂肪形
成，引起脂质代谢紊乱。肝由多种细胞组成，肝细胞
在 AFL的形成中起着至关重要的作用，营养过剩或
某种物质缺乏均可导致肝细胞损害［1］，而脂质在肝细
胞内蓄积是所有肝疾病发病的先决条件［2］。
豹皮樟(Litsea coreana Leve) ，又名老鹰茶，
系樟科木姜子属毛豺皮樟的嫩梢和叶片，是我国
南方各民族民间长期饮用的一种植物代用茶，具有
基金项目:国家自然科学基金(30470775) ;安徽省自
然科学基金项目(11040606M197) ;安徽省高校省级优秀
青年人才基金重点项目(2010SQRL068ZD)
作者简介:胡成穆(1969 －) ，女，博士，主要从事酒精
性肝病研究。E-mail:huchengmu0216@yahoo． com． cn;
李 俊(1960 －) ，男，博士，教授，博士生导师，主要从事抗
炎免疫药理和天然药物活性研究。
通讯作者:李 俊，E-mail:ahmu_lijun@yahoo． cn，
Tel: (0551)65161001
清凉止渴和解毒消肿等功效。豹皮樟中含有多种活
性成分，经本院天然药物化学教研室提取分离鉴定，
确定了豹皮樟的有效部位为总黄酮，分别鉴定为槲
皮素-3-O-β-D-半乳糖苷、山柰酚-3-O-β-D-葡萄糖
苷、槲皮素-3-O-β-D-葡萄糖苷和山柰酚-3-O-β-D-
半乳糖苷［3］，含量超过 51． 5%。前期研究表明，豹
皮樟总黄酮 (total flavonoids of L． coreana Leve，
TFLC)对 AFL具有一定的保护作用［4］，为进一步探
讨 TFLC的作用机制，本研究以 AFL 大鼠肝灌流，
分离培养肝细胞，观察 TFLC 对肝细胞脂质生成及
脂肪分化相关蛋白(adipose differentiation-related
protein，ADRP)和过氧化物酶体增殖物激活受体 γ
(peroxisome proliferators activated receptor γ，
PPARγ)表达的影响。
1 材料与方法
1． 1 动物、药品、试剂和仪器
Sprague-Dawley (SD)大鼠，雄性，体质量
160 ～200 g，安徽医科大学实验动物中心提供(普
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通级) ，标准颗粒饲料喂养，合格证号:皖医实动准
字第 01 号。TFLC由安徽医科大学药学院提取，使
用时均研细后用无血清 DMEM 溶解后过滤灭菌;
谷胱甘肽(glutathione，GSH) ，上海源聚生物科技
有限公司;DMEM 培养基干粉，美国 Gibco 公司;
Ⅳ型胶原酶和 Trizol，美国 Invitrogen 公司;新生牛
血清，杭州四季青公司;兔抗鼠 ADRP 多抗和鼠抗
PPARγ单抗，美国 Santa Cruz 公司;HRP 标记的
羊抗小鼠 IgG和山羊抗兔 IgG 抗体，北京中杉金桥
公司;丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，
ALT)和天冬氨酸转氨酶(aspartate aminotrans-
ferase，AST)活性测定试剂盒，南京建成公司;甘油
三酯(triglycerides，TG)含量测定试剂盒，北京福瑞
生物工程公司;细胞角蛋白 18(cytokeratin 18，
CK18)抗体，北京博奥森公司;PCR逆转录试剂盒，
美国 Promega 公司。CO2 恒温培养箱，美国
Shellab公司;多功能显微镜，日本 Olympus 公司;
PCR仪 9700，美国 ABI公司。
1． 2 AFL大鼠模型的制备、肝灌流和肝细胞分离
大鼠正常饲养 1 周后，自由饮用乙醇饮料(含
18%蔗糖) ，其乙醇浓度从 5%开始，每个浓度维持
1 周，依次增加为 10%，15%，20%，25%，30%，
35%至 40%，40%持续至第 12 周;正常对照组摄
正常饮食 12 周。造模 12 周体质量为 250 ～300 g
的 AFL大鼠6 只，同期正常大鼠2 只。按照 Seglen
的原位两步灌流法［5］并稍加改动分离肝细胞:大鼠
禁食 16 h，ip 10%水合氯醛麻醉，消毒，剖开腹腔，
分离肝门静脉，插麻醉导管并结扎，分离下腔静脉插
入另一根麻醉导管，灌注预温 37℃不含 Ca2 + 和
Mg2 +的 Hank 液，灌注至下腔静脉流出的液体变清
时，开始灌注 37℃预温消化酶(0． 05%Ⅳ型胶原
酶) ，在位灌流待肝变软呈土黄色，表面呈现龟裂
状，压之凹陷不易恢复，停止灌注。分离肝，移至超
净台内用无菌镊撕开肝表面的包膜，抖落肝细胞，预
冷的D-Hanks培养液制成肝细胞悬液，100 目尼龙
网筛滤去细胞团块及组织纤维，滤液 4℃，34 × g 离
心5 min，3 次，完全 DMEM(含 10%血清)调整细胞
浓度，制成5 ×108 L －1的肝细胞悬液。
1． 3 大鼠肝细胞的鉴定
CK18 是成熟肝细胞的标志，可用于鉴定肝细
胞。取灌流获取的肝细胞 1 ×106 L －1加入 0． 4%锥
虫蓝(终浓度 0． 04%) ，镜下观察，死细胞被染成明
显的蓝色，活细胞拒染呈无色透明状。细胞爬片，肝
细胞培养 48 h，4%多聚甲醛固定，3%H2O2 灭活内
源性过氧化物酶，0． 1%Triton X-100 冰上破膜，血
清封闭，一抗(兔抗大鼠 CK18 多克隆抗体 1∶ 400)
4℃过夜，二抗(HRP 标记山羊抗兔 IgG 抗体 1 ∶
800)37℃湿盒1 h(避光) ，DAB 显色，苏木素复染，
脱水，封片。
1． 4 MTT法测定肝细胞存活
调整肝细胞密度为5 ×108 L －1，接种至96 孔板
培养 16 h后，正常大鼠肝细胞分为正常对照组、正
常 + TFLC 1，10 和 100 mg·L －1组;AFL 大鼠肝细
胞分为 AFL 模型对照组、AFL + TFLC 1，10 和
100 mg·L －1及 AFL + GSH 10 mmol·L －1对照组，
各设 3 个复孔，培养 42 h，于每孔加入 MTT 溶液
(5 g·L －1)20 μl，37℃继续培养 4 h 后终止培养，吸
弃上清，加 DMSO 150 μl，振荡10 min，使甲臜颗粒充
分溶解。空白 DMSO 孔调零，酶联免疫检测仪
570 nm波长处测定每孔吸光度(A)值，求其平均值。
1． 5 肝细胞 ALT和 AST活性测定
AFL细胞分为 AFL 模型组、AFL + TFLC 1，10
和 100 mg·L －1及 AFL + GSH 10 mmol·L －1组，正
常大鼠肝细胞为正常对照组，于 6 孔培养板培养
48 h，收集细胞培养液，参照试剂盒方法测定 ALT
和 AST活性。
1． 6 肝细胞内 TG含量测定
细胞分组同 1． 5。药物作用 48 h的细胞，弃上
清，PBS细胞洗 3 遍，加入胰酶消化，收集细胞悬
液，反复冻融裂解细胞，超声细胞粉碎机裂解细胞
2 min，离心取上清，按试剂盒说明书方法检测上清
中 TG含量。
1． 7 逆转录 PCR法测定肝细胞 ADRP和 PPARγ
mRNA 表达
细胞分组同1．5。肝细胞与药物作用 48 h，Trizol
一步法提取肝总 RNA。按试剂盒说明书逆转录，
ADRP引物序列，正义:5-CTTGTGTCCTCCGCT-
TATGTCAGT-3;反 义:5-CTGCTCCTTTGGTCT-
TATCCACCA-3，349 bp。PPARγ 引物序列，正义:
5-ATTCTGGCCCACCAACTTCGG-3;反义:5-TG-
GAAGCCTGATGCTTTATCCCCA-3，339 bp。β肌动
蛋白 引 物 序 列，正 义:5-CAGTAACAGTCCGC-
CTAGAA-3;反义:5-GATTACTGCTCTGGCTCCTA-
3，175 bp。引物由上海生物工程技术公司合成。
ADRP和 PPARγ反应条件分别为:57℃复性，37 个循
环和56℃复性，35 个循环。琼脂糖凝胶上电泳，紫外
灯下观察并扫描。凝胶成像系统对拍摄的照片进行密
度扫描，以目的基因条带积分吸光度值对 β肌动蛋白
积分吸光度值的比值表示目的基因 mRNA相对表达
水平。
·491· 中国药理学与毒理学杂志 2013 年 4 月第 27 卷第 2 期 Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 27，No 2，Apr 2013
1． 8 免疫组化方法测定肝细胞 ADRP 和 PPARγ
蛋白表达
细胞分组同 1． 5。肝细胞与药物作用 48 h，4%
多聚甲醛固定，3%H2O2 灭活内源性过氧化物酶，
PBS洗 3 次，(PPARγ 需 0． 1%Triton X-100 冰上
破膜) ，PBS洗 3 次，血清封闭，一抗(兔抗鼠 ADRP
多抗 1 ∶ 300，鼠抗 PPARγ 单抗 1 ∶ 500)4℃过夜，
PBS洗 3 次，二抗(HRP标记山羊抗兔 IgG 和羊抗
小鼠 IgG抗体 1∶ 800)37℃湿盒 1 h(避光) ，DAB
显色，苏木素复染，脱水，封片。随机选取5 个视野，
以胞膜和(或)胞质出现明显的棕黄色和(或)黄棕
色颗粒的细胞为阳性细胞，计数阳性细胞百分数。
1． 9 统计学分析
实验数据结果以x ± s 表示，用 SPSS 11． 5 进行
统计学处理，多组间比较采用单因素方差分析(one-
way ANOVA)。P ＜0．05认为具有显著性差异。
2 结果
2． 1 大鼠肝细胞的鉴定
常规锥虫蓝拒染法鉴定细胞活率在 80 %以
上。光镜下，正常肝细胞为圆形(图 1A) ，细胞核位
于细胞正中，可见到双核的肝细胞。免疫细胞化学
染色显示，CK18 阳性着色部位在胞核和胞浆，呈棕
黄色颗粒(图 1B)。
Fig． 1 Identification of primary cultured rat hepato-
cytes． A:hepatocytes cultured for 4 h(×100) ，Trypan blue stai-
ning;B:hepatocytes immunochemistry stained with cytokeratin 18
(CK18)antibody．
2． 2 TFLC对正常和 AFL大鼠肝细胞存活的影响
表 1 结果显示，TFLC作用 48 h 对正常大鼠肝
细胞存活无明显影响。与正常大鼠肝细胞比较，
AFL模型大鼠肝细胞存活减少(P ＜0． 05) ;与 AFL
模型大鼠肝细胞比较，TFLC 100 mg·L －1作用 48 h
能显著增加 AFL 大鼠肝细胞存活(P ＜ 0． 05) ，与
GSH 10 mmol·L －1作用相当。
Tab． 1 Effect of total flavone of L． coreana (TFLC)on
proliferation of hepatocytes in normal and alcoholic
fatty liver (AFL)model rats
Group Proliferation(A570 nm)
Normal control 0． 36 ±0． 08
Normal + TFLC 1 0． 33 ±0． 12
10 0． 38 ±0． 08
100 0． 35 ±0． 12
AFL model 0． 15 ±0． 05*
AFL + TFLC 1 0． 26 ±0． 06
10 0． 27 ±0． 06
100 0． 28 ±0． 08#
AFL + glutathione 10 0． 29 ±0． 09#
A model of alcoholic fatty liver in rats was established by intaking
different doses of alcohol (concentration from 5% to 40%)over
12 weeks:5% (V /V)for first week，then 10% alcohol for a sec-
ond week，and each week alcohol concentration was increased
5% and finally 40% ethanol for another four weeks． Hepatocytes
from AFL or normal rats were treated in medium with TFLC 1，10
and 100 mg·L －1 or glutathione 10 mmol·L －1 for 48 h． The hepa-
tocyte proliferation was determined by MTT assay． x ± s，n = 3．
* P ＜0． 05，compared with normal control group; # P ＜ 0． 05，
compared with AFL model group．
2． 3 TFLC 对 AFL 大鼠肝细胞培养液中 ALT 和
AST活性的影响
如表2结果显示，与正常大鼠肝细胞相比，细胞培
养48 h的AFL模型大鼠肝细胞培养液中ALT和AST
活性均明显升高(P ＜0．05);TFLC 10和 100 mg·L －1
作用48 h 可降低 AFL 大鼠肝细胞培养液中 ALT 和
AST活性(P ＜0．05)，与GSH 10 mmol·L －1作用相当。
Tab． 2 Effect of TFLC on activities of alanine amin-
otransferase (ALT) and aspartate aminotransferase
(AST)in hepatocytes of AFL model rats
Group
ALT /
U·L －1
AST /
U·L －1
Normal control 39 ±9 38 ±8
AFL model 63 ±12* 74 ±19*
AFL + TFLC 1 47 ±10 60 ±12
10 42 ±12# 46 ±14#
100 44 ±8# 47 ±8#
AFL + glutathione 10 43 ±9# 46 ±14#
See Tab． 1 for the cell treatments． x ± s，n = 3． * P ＜ 0． 05，
compared with normal control group;#P ＜ 0． 05，compared with
AFL model group．
·591·中国药理学与毒理学杂志 2013 年 4 月第 27 卷第 2 期 Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 27，No 2，Apr 2013
2． 4 TFLC对 AFL大鼠肝细胞内 TG含量的影响
由表 3 看出，与正常大鼠肝细胞比较，培养48 h
的 AFL 模型大鼠肝细胞内 TG 含量明显增加
(P ＜0． 05) ;TFLC 10 和 100 mg·L －1作用 48 h 可
减少 AFL大鼠肝细胞内 TG 含量(P ＜ 0． 05) ，与
GSH 10 mmol·L －1作用相当。
Tab． 3 Effect of TFLC on content of triglycerides (TG)
in hepatocytes of AFL model rats
Group TG /mmol·L －1
Normal control 1． 2 ±0． 3
AFL model 2． 3 ±0． 6*
AFL + TFLC 1 1． 5 ±0． 6
10 1． 4 ±0． 3#
100 1． 5 ±0． 5#
AFL + glutathione 10 1． 4 ±0． 4#
See Tab． 1 for the cell treatments． x ± s，n = 3． * P ＜ 0． 05，
compared with normal group;# P ＜ 0． 05，compared with AFL
model group．
2． 5 TFLC对 AFL大鼠肝细胞 ADRP mRNA 和蛋
白表达的影响
与正常肝细胞相比，AFL 大鼠肝细胞 ADRP
mRNA表达明显增多(数据略)。如图 2 所示，与
AFL模型大鼠肝细胞相比，TFLC 10 mg·L －1作用
48 h能明显降低 ADRP mRNA 表达(P ＜ 0． 05) ，
与 GSH 10 mmol·L －1作用相当。
Fig． 2 Effect of TFLC on adipose differentiation-relat-
ed protein (ADRP)mRNA expression in hepatocytes
of AFL model rats． See Tab． 1 for cell treatment． A:represent-
ative RT-PCR for ADRP expression． B:RT-PCR quantitative analysis
result of A． IA:integrated absorbance． Lane 1:AFL model;lane 2:
AFL +TFLC 10 mg·L －1;lane 3:AFL +glutathione 10 mmol·L －1． x ± s，
n =3． * P ＜0． 05，compared with AFL model group．
由图 3 和图 4 看出，正常大鼠的肝细胞有少量
ADRP阳性表达(图 3A) ，AFL 模型组 ADRP 阳性
表达肝细胞明显增多(P ＜ 0． 01) (图 3B) ，AFL +
TFLC 100 mg·L －1组(图 3E)和 AFL +谷胱甘肽
10 mmol·L －1组(图 3F)ADRP 阳性表达细胞明显
减少(P ＜0． 01)。
Fig． 3 Effect of TFLC on ADRP expression in hepato-
cytes of AFL model rats (SP)． See Tab． 1 for cell treat-
ment． A:normal;B:AFL model;C － E:AFL + TFLC 1，10 and
100 mg·L －1;F:AFL + glutathione 10 mmol·L －1 ． Arrows show
ADRP positive cells．
Fig． 4 Effect of TFLC on ADRP protein expression in
hepatocytes of AFL model rats ． See Tab． 1 for cell treat-
ment． x ± s，n =3． ＊＊ P ＜ 0． 01，compared with normal group;
##P ＜0． 01，compared with AFL model group．
2． 6 TFLC对 AFL 大鼠肝细胞 PPARγ mRNA 和
蛋白表达的影响
如图 5 所示，与正常肝细胞相比，AFL 大鼠肝
细胞PPARγ mRNA表达明显增多(数据略)。与
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AFL模型大鼠肝细胞相比，TFLC作用 48 h能明显降
低 AFL大鼠肝细胞 PPARγ mRNA表达(P ＜0．01)。
Fig． 5 Effect of TFLC on peroxisome proliferator-acti-
vated receptorγ(PPARγ)mRNA expression in hepato-
cytes of AFL model rats． See Tab． 1 for cell treatment． The
intensity of PPARγ mRNA bands was normalized to that of
β-actin． B was the semiquantitative result of A． Lane 1:AFL
model;lane 2:AFL + TFLC 10 mg·L －1;lane 3:AFL + glutathione
10 mmol·L －1 ． x ± s，n =3． * P ＜0． 05，＊＊P ＜0． 01，compared
with AFL model group．
如图 6 和图 7 所示，正常组肝细胞可见少数
PPARγ阳性表达细胞，着色较淡(图 6A) ;模型组
可见较多阳性表达细胞，胞核着色较深(图 6B)。
与 AFL 模型组相比，AFL + TFLC 100 mg·L －1组
(图 6E)和 AFL +谷胱甘肽 10 mmol·L －1组(图
6F)PPARγ阳性表达肝细胞明显减少(P ＜0． 05) ，
表达程度降低。
Fig． 7 Effect of TFLC on PPARγ protein expression in
hepatocytes of AFL model rats． See Tab． 1 for cell treat-
ment． x ± s，n = 3． ＊＊ P ＜ 0． 01，compared with normal group;
#P ＜0． 05，compared with AFL model group．
3 讨论
AFL 是酒精性肝病(alcoholic liver disease，
ALD)的早期阶段，发展为肝纤维化和肝硬化的危险
性比单纯性脂肪肝高。本研究以 18%的蔗糖为溶
媒，以浓度递增的方式加入乙醇，让大鼠逐渐适应，
建立 AFL大鼠模型。慢性乙醇摄入可导致实验动
物血脂水平增加，肝脂肪沉积［6］。
肝细胞具有丰富的酶系及多种特异性功能，体外
培养用于药理学研究具有许多优点，在一定时间内离
体培养细胞具有体内肝功能［7］。胶原酶二步灌流法［8］
是目前原代肝细胞分离的常用方法，本研究经适当改
进后成功分离大鼠原代肝细胞。慢性乙醇摄入导致
AFL大鼠肝细胞内脂肪沉积，TG有不同程度增加。肝
细胞损伤，增殖反应下降，ALT和 AST水平升高。
Fig． 6 Effect of TFLC on PPARγ protein expression in hepatocytes of AFL model rats (SP)． See Tab． 1 for cell treat-
ment． A:normal;B:AFL model;C －E:AFL + TFLC 1，10 and 100 mg·L －1;F:AFL +glutathione 10 mmol·L －1 ． ↑:PPARγ positive cells．
·791·中国药理学与毒理学杂志 2013 年 4 月第 27 卷第 2 期 Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 27，No 2，Apr 2013
ADRP，又名亲脂素(adipophilin) ，相对分子质
量为48 ku，是脂肪细胞早期分化及脂质积聚的标
志。ADRP具有调节脂质代谢的作用，可作为载体
协助脂肪酸进入细胞，浓度和时间依赖性地促进长
链脂肪酸的摄取。ADRP高表达可促进细胞胞浆内
游离脂肪酸增多，增加肝 TG的沉积，可使细胞内的
脂滴数目增多，体积增大。抑制 ADRP 的表达能增
加脂肪酸的 β氧化。ADRP反义寡核苷酸可减少肝
的 TG和甘油二酯水平，增强胰岛素的作用［9］。免
疫组化方法比油红 O染色技术对实验者要求更少，
同时 ADRP免疫组化方法比 HE 染色或油红 O 染
色更易发现微小脂滴，ADRP 阳性表达可作为 AFL
形成的标志［10］。
PPARγ是主要表达于脂肪、肝和骨骼肌等组
织的核转录因子，其目标基因直接参与脂肪细胞的
分化成熟，并影响体内脂肪的合成及蓄积。PPARγ
可刺激前脂肪细胞分化为脂肪细胞，诱导肝细胞脂
肪酸重新合成引起脂质蓄积［11］，增加肝细胞的脂肪
合成，并参与葡萄糖稳态的调节［12］。ADRP作为
PPARγ的目标基因，表达增高可促进 PPARγ的表
达和肝脂肪变性［13］。
本研究采用两步灌流法获取大鼠原代肝细胞，
MTT方法检测肝细胞活性。TFLC对正常肝细胞增
殖反应无明显影响，但能增强 AFL模型大鼠肝细胞
增殖反应，抑制 AFL大鼠肝细胞 ALT和 AST活性，
降低 AFL 大鼠肝细胞内 TG 的含量。本研究结果
发现，AFL 大鼠肝细胞 ADRP 和 PPARγ 阳性表达
细胞数增多，程度加重，TFLC 干预后肝细胞 ADRP
和 PPARγ阳性表达的细胞数和表达量均明显减
少。TFLC 可减少肝细胞内 TG 的沉积，对 AFL 大
鼠肝细胞脂肪变性有抑制作用，可能与其改善肝细
胞活性、调控肝细胞 ADRP和 PPARγ的表达、降低
肝细胞 TG的积聚有关。
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·891· 中国药理学与毒理学杂志 2013 年 4 月第 27 卷第 2 期 Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 27，No 2，Apr 2013
Effect of total flavonoids from Litsea coreana Leve on steatotic
hepatocytes in rats with alcoholic fatty liver in vitro
HU Cheng-mu，CAO Qi，XIE Xue-feng，LIU Hong-feng，DING Qi，LI Jun
(Anhui Key Laboratory of Bioactivity of Natural Products，College of Pharmacy，Anhui Medical
University，Hefei 230032，China)
Abstract:OBJECTIVE To evaluate the effect of total flavonoid from Litsea coreana Leve (TFLC)
on steatotic hepatocytes in rats with alcoholic fatty liver (AFL)． METHODS A model of AFL in rats was
established by intaking different doses of alcohol (concentration from 5% to 40%)over 12 weeks:5%
(V /V)for first week，then 10% alcohol for another week，and each week the alcohol concentration
increased by 5% and finally 40% ethanol for four more weeks． Hepatocytes were isolated from rats by a
modified two-step collagenase perfusion technique in situ and identified by cytokeratin 18 antibody． After
16 h of incubation，TFLC 1，10 and 100 mg·L －1 or glutathione (GSH )10 mmol·L －1 were added into
the culture supernatant，respectively． The cell survival was determined with MTT assay． The activity of
alanine aminotransferase (ALT)and aspartate aminotransferase (AST)in the culture supernatant and
contents of triglycerides (TG)in hepatocytes were measured using the kits． The expression of adipose
differentiation-related protein (ADRP)and peroxisome proliferator-activated receptor γ(PPARγ)was
determined by immunochemistry and RT-PCR， respectively． RESULTS TFLC could significantly
improve the survival of AFL rat hepatocytes (P ＜0． 05) ，but had no effect on the survival of normal hep-
atocytes． The activity of ALT and AST in AFL hepatocytes culture supernatant was (63 ±12)and (74 ±
19)U·L －1，and TFLC 10 and 100 mg·L －1 treatment markedly reduced the activity of ALT to 42 ±12 and
(44 ±8)U·L －1(P ＜0． 05) ，and AST to 46 ±14 and (47 ±8)U·L －1(P ＜0． 05) ，respectively． The con-
tent of TG in AFL rat hepatocytes was (2． 3 ±0． 6)mmol·L －1 and decreased to 1． 4 ±0． 3 and (1． 5 ±
0． 5)mmol·L －1(P ＜0． 05)in TFLC 10 and 100 mg·L －1 treated groups． Furthermore，the expression of
ADRP and PPARγ mRNA was significantly decreased in TFLC treated groups． The percentage of ADRP
and PPARγ positive cells was (41 ±6)% and (37 ±10)% in AFL model group，which was also signifi-
cantly decreased in TFLC 100 mg·L －1 treated groups to (26 ± 6)% (P ＜ 0． 01)and(25 ± 5)%(P ＜
0． 05) ，respectively． CONCLUSION TFLC has a protective effect on steatotic hepatocytes from AFL
rats． The mechanism may involve the inhibition of synthesis of TG by regulating the expression of ADRP
and PPARγ．
Key words:fatty liver，alcoholic;total flavonoids from Litsea coreana L．;hepatocytes;adipose
differentiation-related protein;peroxisome proliferator-activated receptorγ
Foundation item:The project supported by National Natural Science Foundation of China (30470775) ;and partially
supported by Provincial Natural Science Study in Anhui Province (11040606M197) ;and Outstanding Youth Teacher Fund
in College of Anhui Province(2010SQRL068ZD)
Corresponding author:LI Jun，E-mail:ahmu_lijun@yahoo． cn，Tel: (0551)65161001
(收稿日期:2012-06-14 接受日期:2012-12-04)
(本文编辑:齐春会)
·991·中国药理学与毒理学杂志 2013 年 4 月第 27 卷第 2 期 Chin J Pharmacol Toxicol，Vol 27，No 2，Apr 2013