全 文 ：可再生资源利用
固定化脂肪酶催化制备香叶树籽生物柴油研究
蒋建新 ,王卫刚 ,吴　昱 ,蒲志鹏 ,朱莉伟
(北京林业大学化学工程系 ,北京 100083)
摘要:研究了Novozym 435和Lipozyme TLIM混合脂肪酶催化香叶树籽油制备生物柴油 ,2种酶按 1∶3质量比混合使用时, 既
可提高反应转化率 ,又可降低酶的使用成本。应用响应面优化法确定了固定化酶催化香叶树籽生物柴油的最优工艺参数 ,采用
叔丁醇作为反应体系的溶剂 ,最优反应条件为反应温度 38.5℃、甲醇与油摩尔比 4∶1 、叔丁醇与油体积比 1∶1.5 、酶用量为油质
量的 4%,此时反应转化率达 90.09%。分析表明香叶树籽油的甘油三酯主要由短链脂肪酸甘油酯组成 , 生物柴油中原油的甘
油三酯已完全转变成脂肪酸甲酯。
关键词:生物柴油;香叶树籽油脂;固定化脂肪酶;催化
中图分类号:TQ91　 文献标识码:A　 文章编号:0253-4320(2009)S1-0289-04
Study on transesterification of Lindera communis oil to produce biodiesel
by immobilized lipase
JIANGJian-xin , WANG Wei-gang , WU Yu , PU Zhi-peng , ZHU Li-wei
(Department of Chemical Engineering , Beijing Forestry University , Beijing 100083 , China)
Abstract:Lindera communis seed oil is used to producing biodiesel catalyzed by blend lipase of Novozym 435 and
Lipozyme TLIM at the optimized rate of 1∶3 , which can reduce the cost of lipase and improve the conversive rate.With response
surface methodology the optimized parameters are obtained as follows:with tert-butanol adopted as a reaction medium for lipase-
catalyzed methanoly sis of oils , the biodiesel with best conversive rate of 90.09% can be produced at 38.5℃with 4∶1 of the
molar ratio of methanol to oil , 1∶1 of the volume ratio of tert-butanol to oil , and 4% of the lipase catalyst concentration.The
triacylglycerols from Lindera communis oil are composed of low hydrocarbon fatty acid triacylglycerols , which had been
completely converted into fatty acid methyl esters by immobilized lipase.
Key words:biodiesel;Lindera communis oil;immobilized lipase;catalysis
　收稿日期:2009-07-17
　基金项目:中国博士后基金资助项目(20060400401)
　作者简介:蒋建新(1969-),男 ,博士 ,教授 ,主要从事林产化工及生物质能源方面的研究 , 010-62338152 , jiangjx@bjfu.edu.cn。
　　发展生物质能源是解决未来能源危机 、改善生
态环境 、实现能源可持续发展的重要途径之一 。生
物柴油是由各种动植物油与醇类(主要为甲醇)反应
得到的脂肪酸酯 ,具有低黏度 、低硫 、高燃烧值 、高十
六烷值等特点 ,是一种理想的生物质液体燃料[ 1-4] 。
食油 90%以上都是从草本油料作物中取得的 ,而木
本生物柴油开发以山地资源为对象 ,不与粮争地 ,不
需要每年种植 ,节省劳力 。香叶树(Lindera communis
Hemsl)又称香油果 、红果 、千斤树等 ,在我国东西部
均有分布 ,尤以云南 、贵州分布最为广泛 ,大多为野
生状态 ,在贵州成为石灰岩阔叶林的重要建群种[ 5] 。
香叶树果实(果皮)可提取芳香油 , 果实含油
47.2%,种仁含油率 56%以上 ,果皮及枝叶中也含有
相当比例的芳香油 ,是野生油料植物的优势树种之
一 ,具有很高的经济价值 。
当前化学法生产生物柴油主要是用植物油脂同
甲醇或乙醇在酸性或碱性催化剂和一定温度下进行
酯交换反应 ,生成脂肪酸甲酯或乙酯 ,再经分离 、洗
涤和干燥得到生物柴油。化学法生产生物柴油特点
是反应时间短 、生产成本较低 , 但存在工艺流程过
长 、废液排放大 、能耗高 、产物回收困难等缺点[ 6] 。
以脂肪酶催化转酯化的酶法生产生物柴油 ,具有反
应条件温和 、醇用量小 、甘油易回收等优点;但存在
着酶使用成本较高 ,酶分离和循环使用很困难[ 7] 。
笔者采用Novozym4 35和 Lipozyme TLIM 混合固定化
酶催化改性香叶树籽油制备生物柴油 ,并通过应用
响应面法进行工艺参数优化 ,以期为酶法生产生物
柴油工业化和木本油脂的高效利用提供依据 。
1　材料与方法
1.1　主要原料与仪器
香叶树籽为北京林业大学生物学院从云南采
·289·
第 29卷增刊(1) 现代化工 Sep.2009
2009年 9月 Modern Chemical Industry
DOI :10.16606/j.cnki.issn0253-4320.2009.s1.069
集 ,将种子风干密闭封存。固定化脂肪酶 Novozym
435 ,一种由 Candida antarctica 得到的脂肪酶 , 用一
种经过基因改性的米曲霉(Aspergillus oryzae)微生物
进行深层发酵并吸附在一种大孔性树脂上制成的;
固定化脂肪酶 Lipozyme TLIM ,从 Thermomyces lanugi-
nosus得到的 、用一种改性米曲霉(Aspergillus oryzae)
微生物经过深层发酵生产的 ,固定于颗粒硅胶上 ,均
购于诺维信公司 。其他试剂均为分析纯 。色谱仪为
法国吉尔森H201高效液相色谱仪。
1.2　香叶树籽油提取及混合酶用量优化试验
将香叶树籽磨碎通过 80目筛制备成种子全粉 ,
用石油醚(30 ～ 60℃)于索氏提取器中提取 18 h ,回
收石油醚后油脂按GB5530—1995进行酸值测定 ,提
取的香叶树籽油用于酶法改性制备生物柴油 。
由于 Novozym 435 的价格明显高于 Lipozyme
TLIM酶 ,笔者将 2种酶按照不同比例混合 ,用于催
化香叶树籽油制备生物柴油 ,检测不同混合比例下
生物柴油的转化率情况 ,寻找较优的配比。
1.3　酶法催化生物柴油分步加入甲醇试验
一次性加入甲醇会对脂肪酶活性产生影响 ,尤
其是在无溶剂系统中 ,为了检验甲醇加入方法对脂
肪酶的影响 ,通过分 3步加入甲醇测定即时反应转
化率的方法来检验甲醇对脂肪酶的影响 ,设计反应
时间 12 h ,每隔 4 h 加入 1/3量的甲醇 ,每隔 2 h 取
样检测。
1.4　溶剂对酶法催化香叶树籽生物柴油的影响
采用不同溶剂作为反应介质 ,选择正己烷 、石油
醚 、叔丁醇 、丙酮作为溶剂。反应温度为 40℃,溶剂
与油脂的体积比为 1∶1 ,酶用量为 3%,反应时间为
12 h ,进行反应转化率测定。
1.5　响应面优化设计法
针对摇床转速 、反应时间 、反应温度 、酶用量 、甲
醇用量 、叔丁醇用量等因素进行实验 ,先找出影响较
大的因素 ,再设计不同的反应水平 ,利用响应面优化
设计法寻找最佳的反应条件。根据单因素实验选取
甲醇与油摩尔质量比 、反应温度 、脂肪酶与油脂质量
比 、油/叔丁醇体积比 4个影响显著的因素为响应面
试验的 4个因素 ,采用四因素五水平的响应面分析
方法对脂肪酶催化香叶树油酯交换反应进行优化 。
1.6　分析方法
高压液相色谱检测脂肪酸甲酯的转化效率。流
动相为甲醇(A)、正己烷和异丙醇(二者体积比为 4∶
5)(B)混合液 ,开始流动相A 为 100%、B 为 0 ,进样
15 min ,流动相改为 A 、B各 50%, 210 nm紫外检测 。
脂肪酸甲酯转化率为液相色谱检测结果应用标准品
标准曲线计算得到的实际转化脂肪酸甲酯的质量与
油脂完全转化为脂肪酸甲酯的理论值的比值 。
2　结果与讨论
2.1　混合酶用量对油脂甲酯化的影响
香叶树籽油的脂肪酸由癸酸 、月桂酸 、棕榈酸和
油酸等组成 ,以低碳链脂肪酸为主 ,本实验测得的香
叶树籽油酸值 1.14 ,为低酸值油脂 ,与文献报道基
本一致[ 8] 。用于酯交换的生物催化剂脂肪酶的种类
不同 ,其催化作用也不同 ,根据其催化特异性可分 3
大类:非特异性脂肪酶 、1 ,3 位特异性脂肪酶 、脂肪
酸特异性脂肪酶 。Lipozyme TLIM是一种 1 ,3位特异
性脂肪酶 ,具有定向催化特性 ,使酯交换的酰基转移
限制在甘三酯结构的 1 , 3位置上 ,并使 1 ,3 位交换
上所需要的脂肪酸酰基 , 甲酯最高理论得率为
67%。Novozym 435是一种非特异性脂肪酶 ,与化学
催化剂类似 ,催化随机酯交换 ,并对甘油酯作用的位
置无特异性 ,作为一种无定位专用性的脂肪酶 ,且有
更高的催化活性 。采用 1%(质量分数 , 下同)的
Novozym 435 反应 24 h 的甲酯得率可达 90%。但
Novozym 435的价格比Lipozyme TLIM昂贵很多 ,从甲
酯得率和酶的成本 2方面考虑 ,本实验将 Lipozyme
TLIM和 Novozym 435混合在一起使用 ,结果如表 1
所示。采用 3%的 Lipozyme TLIM 和 1%的 Novozym
435 反应 12 h 的甲酯得率能达到 90.8%;由于
Novozym 435的价格昂贵 ,生产成本大大增加 ,从经
济角度考虑 , 3%的 Lipozyme TLIM 和 1%的 Novozym
435转化效果较好 。
表 1　混合酶用量对油脂甲酯化的影响
混合酶用量 1%TL IM+1%435 2%TL IM+1%435
转化率/ % 84.6 85.0
混合酶用量 3%TL IM+1%435 1%TL IM+2%435
转化率/ % 90.8 85.6
2.2　酶法催化生物柴油分步加入甲醇试验结果
过量的甲醇可造成酶的失活 ,笔者研究了分段
添加甲醇的方法对转化率的影响。在较优配比的反
应体系下 ,香叶树籽油 10 mL 、固定化酶的用量为质
量分数 3%、叔丁醇和油体积比为 1∶1 、反应时间
12 h ,摇床转速 200 r/min ,温度为 37℃。反应间隔 4
h分 3次添加相同量的甲醇 ,即分别在 0 、4 、8 h加入
等量甲醇 。分别测各阶段的转化率结果如图 1。分
段添加甲醇 ,最主要的是为了减轻甲醇对脂肪酶的
·290· 现代化工 第 29卷增刊(1)
毒性 ,延长脂肪酶的使用寿命 ,充分发挥脂肪酶的活
性 ,降低酶的使用成本 ,提高转化效率。结果表明三
步加入甲醇转化率能达到较高的程度 ,转化分为明
显的 3个阶段。但为了考证脂肪酶在有机溶剂存在
下对一次加入甲醇的耐受性 ,后续实验不采用分步
加入甲醇的方法 。
图 1　12 h三步加入甲醇反应进程
2.3　不同溶剂对油脂甲酯化的影响
在无溶剂系统中 ,由于油脂黏度大 ,影响了酶的
催化作用 ,造成转化率低 ,酶分离回收困难 ,因此本
研究使用溶剂作为介质 ,用以促进反应进行 ,选择常
用毒性较低的常用的溶剂包括石油醚 、正己烷 、丙
酮 、叔丁醇作为反应介质 ,分别检测油脂转化率。其
中石油醚同反应底物甲醇的极性差别很大 ,而叔丁
醇是一种常见溶剂 ,是不同于直链醇类的具有较大
空间位阻的醇 ,在甲醇存在的情况下不会对酯化反
应产生影响 。从图 2中可看到 ,选用正己烷和石油
醚作为溶剂的情况下 ,基本没有脂肪酸甲酯生成 ,对
比丙酮 、叔丁醇为溶剂的情况 ,以叔丁醇为溶剂能得
到较高的转化率 ,这是因为在亲水性强的有机介质
如丙酮中 ,脂肪酶的活性受到一定的影响;在疏水性
有机介质如正己烷中 ,甲醇和甘油不能在疏水性溶
剂中充分溶解 ,反应几乎不进行 。叔丁醇是一种相
对亲水的溶剂 ,并且甲醇和甘油能够很好的溶解其
中 ,通过无甲醇存在的条件下 ,将油脂同酶在叔丁醇
的溶剂体系中反应对照得知 ,叔丁醇的存在不会影
响油脂的转酯化反应[ 9] 。叔丁醇与生物柴油的沸点
差异较大 ,叔丁醇可以通过蒸发分离回收。
图2　4种溶剂对转化率的影响
2.4　响应面法优化实验
响应面实验安排及结果以表 2 , A 、B 、C 、D为自
变量 ,以酯交换率为响应值 。实验号 1 ～ 16 为析因
实验 ,17 ～ 21为 5个中心实验 ,用以估计实验误差。
表 2　响应面实验方案及实验结果
批次 A(温度)
B
(酶用量)
C(叔丁醇
用量)
D(甲醇
用量)
转化率/
%
1 1 1 1 -1 86.27
2 1 1 -1 -1 79.72
3 1 -1 1 1 82.72
4 -1 1 -1 1 74.82
5 1 -1 -1 1 77.07
6 -1 -1 1 -1 72.63
7 -1 1 1 1 80.28
8 -1 -1 -1 -1 69.22
9 -1.682 0 0 0 81.27
10 1.682 0 0 0 67.55
11 0 -1.682 0 0 70.01
12 0 1.682 0 0 88.98
13 0 0 -1.682 0 75.41
14 0 0 1.682 0 85.80
15 0 0 0 -1.682 76.45
16 0 0 0 1.682 84.69
17 0 0 0 0 83.43
18 0 0 0 0 83.68
19 0 0 0 0 82.65
20 0 0 0 0 83.24
21 0 0 0 0 84.15
由表 3中全模型的方差分析可知 , A 、B 、C 、D 、
AB 、AD 、BD 、A2、B2 、C2 、D2 对响应值的影响显著 ,说
明反应温度 、加酶量 、叔丁醇用量 、甲醇用量是酶催
化反应的重要控制因素 ,其中反应温度和酶用量有
交互作用 ,交互作用显著;反应温度和甲醇用量 、加
酶量和甲醇用量有交互作用 ,且交互作用极显著 ,说
明反应温度和甲醇用量 、加酶量和甲醇用量是酶转
化中的关键控制因素 。失拟项的 p=0.0787 , 没有
显著性意义 ,说明数据中没有异常点 ,不需要引入更
高次数的项 ,模型适当。
为了得到更精简的模型 ,对全模型方差分析中
影响不显著的项进行剔除 ,然后再进行方差分析 ,从
精简模型的方差分析得到 A 、B 、C 、D 、AD 、BD 、A2 、
B2、C2 、D2对响应值的影响极显著 ,AB对响应值的影
响显著 ,失拟项的 p =0.1115 ,没有显著性意义 ,说
明数据中没有异常点 ,不需要引入更高次数的项 ,说
·291·2009年 9月 蒋建新等:固定化脂肪酶催化制备香叶树籽生物柴油研究
明精简模型适当 。根据精简模型可建立回归方程
为:R1 =83.23-4.08A +5.64B+2.82C +2.45D+
1.57AB +3.21AD -7.68BD -2.97A2 -1.17B2 -
0.77C2-0.79D2 。
表 3　方差分析
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 Prob>F
模型 730.403 14 52.17164 71.49898 <0.0001
A-A温度 94.09039 1 94.09039 128.9468 <0.0001
B-B酶 180.0063 1 180.0063 246.6909 <0.0001
C-C叔丁醇 108.9649 1 108.9649 149.3317 <0.0001
D-D甲醇 33.93315 1 33.93315 46.50391 0.0005
AB 8.152379 1 8.152379 11.17248 0.0156
AC 1.389444 1 1.389444 1.904174 0.2168
AD 34.15391 1 34.15391 46.80646 0.0005
BC 1.084128 1 1.084128 1.485751 0.2686
BD 195.5348 1 195.5348 267.972 <0.0001
CD 0.162108 1 0.162108 0.222162 0.6540
A2 131.4207 1 131.4207 180.1065 <0.0001
B2 20.36038 1 20.36038 27.90302 0.0019
C2 8.956621 1 8.956621 12.27466 0.0128
D2 9.266025 1 9.266025 12.69869 0.0119
误差 4.378102 6 0.729684 　 　
失拟项 3.149763 2 1.574882 5.128494 0.0787
纯误差 1.228338 4 0.307085 　 　
所有项 734.7811 20 　 　 　
　　注:Pr>F 的值小于 0.05为影响显著;Pr>F 的值小于 0.01为
影响极显著。
根据Design Expert 7.0软件分析得到最优反应
条件分别为:酶用量为 4%,甲醇/油摩尔比为 4∶1 ,
叔丁醇/油体积比 1∶1.5 ,反应温度为 38.5℃。推测
转化率能达到 92.78%,可靠度为 0.79。按照最优
反应条件的要求进行实验 ,平行进行3组实验 ,转化
率分 别为 89.65%、 90.56%、 90.05%, 平 均 值
90.09%。与预测值的误差为 2.89%。脂肪酶催化
油脂和甲醇发生酯交换反应 ,生成相应的脂肪酸甲
酯 ,这种方法与化学法相比 ,具有反应条件温和 、醇
用量少 、产物精制工艺简单 、甘油易回收和无废弃物
产生等优点。本实验由于采用 1 ,3位特异性和非特
异性混合脂肪酶催化 ,可使酶使用成本大幅度下降 。
2.5　高效液相色谱分析
图3是香叶树籽原油和在最优工艺下酶法催化
生物柴油的液相色谱图 ,可以看出香叶树籽油的甘
油三酯主要由短链脂肪酸甘油酯组成 ,出峰位置集
中在保留时间 15 min处 ,而在保留时间 5 min 处的
游离脂肪酸含量极少;在最优工艺酶催化下甘油三
酯峰消失 ,已转变成脂肪酸甲酯 ,转化完全。
(a)香叶树籽油
(b)香叶树籽生物柴油
图 3　香叶树籽油与生物柴油液相色谱图
3　结语
Novozym 435是一种非特异性脂肪酶 , Lipozyme
TLIM是一种 1 , 3位特异性脂肪酶 ,2种酶按 1∶3质
量比混合催化香叶树籽油制备生物柴油 ,既可提高
反应转化率 ,又可降低酶的使用成本。分段添加甲
醇 ,可减轻甲醇对脂肪酶的毒性 ,延长脂肪酶的使用
寿命 ,提高反应转化效率;三步加入甲醇转化率能达
到较高的程度 ,转化分为明显的 3个阶段。以叔丁
醇为溶剂 ,可降低反应系统中油脂的黏度 ,促进催化
反应 ,生物柴油转化率高 ,而叔丁醇的存在不会影响
油脂的转酯化反应。响应面法优化试验得到最优反
应工艺为:酶用量 4%、甲醇/油摩尔比为 4∶1 、叔丁
醇/油体积比 1∶1.5 、反应温度 38.5℃, 转化率
90.09%。脂肪酶催化油脂和低碳醇发生酯交换反
应 ,生成相应的脂肪酸酯 ,与化学法相比 ,具有反应
条件温和 、醇用量少 、产物精制工艺简单 、甘油易回
收和无废弃物产生等优点 。
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　　 (下转第 294页)
·292· 现代化工 第 29卷增刊(1)
过程中催化剂分离比较难 、存在废液多 、副反应多和
乳化现象等严重问题 ,特别对于那些脂肪酸含量高
的不能食用的油料作物以及餐饮废油 ,固体酸催化
能酯化酯交换一步完成 ,不用预处理原料油 ,这样大
大简化了工艺 ,节约了成本 ,而且其反应条件温和 ,
催化剂容易分离 ,可重复使用 ,容易采用自动化连续
生产 ,对设备无腐蚀 ,对环境无污染 。目前采用固体
酸催化剂催化油脂酯交换反应成为研究的热点。笔
者以固体酸SO2-4 /SnO2-SiO2 为催化剂 ,研究了它对
大豆油与甲醇酯交换合成生物柴油的催化作用。
1　实验部分
1.1　主要原料
大豆油 ,市售;无水甲醇 ,分析纯;白炭黑 ,市售;
SnCl4·5H2O ,分析纯 ,北京化工厂;氨水(28%),天津
市大茂化学试剂厂;油酸 ,市售 ,分装;二十烷 ,分析
纯 ,Alfa Aesar;正己烷 ,分析纯 ,天津市科密欧化学试
剂有限公司;硫酸(95%～ 98%),太原化工农药厂。
1.2　催化剂的制备
称取一定量的SnCl4·5H2O溶于去离子水中 ,快
速搅拌下加入一定量白炭黑 ,搅拌 1 h后 ,边搅拌边
滴加氨水溶液 ,至溶液的 pH=9左右 ,得到 Sn(OH)4
沉淀 ,陈化 24 h后 ,过滤沉淀 ,洗涤 ,然后将所得沉
淀干燥 。将干燥后的沉淀以 15 mL/g 的比例 , 用
1 mol/L的硫酸溶液浸渍 30 min , 再过滤除去浸渍
液 ,干燥后在 450℃焙烧 5 h ,得到 SO2-4 /SnO2-SiO2
催化剂 。吡啶红外测试在日本岛津 FTIR8400 上进
行。NH3-TPD 测试是在美国 Quantachrome 公司
CHEMBET-3000化学吸附仪上进行。
1.3　酯交换反应
将一定摩尔比的大豆油 、甲醇和催化剂 ,放入
100 mL 的带聚四氟乙烯内衬的不锈钢反应釜中 ,放
入转子 ,然后将反应釜放入带温度控制和搅拌功能
的油浴锅中 ,在一定温度下反应一定时间后 ,将反应
产物冷却 ,离心分离催化剂 ,静置分层 ,用正己烷萃
取出脂肪酸甲酯(ME)。采用 GC-920气相色谱仪
(上海计算技术研究所)分析产品中脂肪酸甲酯的
含量 。
2　结果与讨论
2.1　催化剂酸性的表征
图1　SO2-4 /SnO2-SiO2的吡啶吸附红外谱图
图1为 SO2-4 /SnO2-SiO2的吡啶红外光谱图 ,从
图中可以看出催化剂既具有较强的 Lewis酸性中心
(1 445 cm-1和 1 597 cm-1附近), 也具有较强的
Bronsted酸中心(1 488 cm-1及 1 540 cm-1附近)。
1—SnO2-SiO 2;2—SO 2-4 /SnO 2-SiO2;3—NH3 解吸温度
图 2　SnO2-SiO2 及SO2-4 /SnO2-SiO2 的
NH3-TPD曲线
图2为SnO2-SiO2 及SO2-4 /SnO2-SiO2的NH3 程
序升温脱附曲线 。SnO2-SiO2 在大约 345℃和 558℃
出现 2个脱附峰 ,这分别是由于 NH3在催化剂中强
酸位和强酸位上的化学吸附 。经过硫酸改性的
SO2-4 /SnO2-SiO2 在 426℃和大于 650℃出现 2 个脱
附峰 ,这分别是由于 NH3 在样品强酸位和超强酸位
上的化学吸附 。结合反应数据 , 在本实验温度
(100 ～ 120℃)催化剂SnO2-SiO2不催化反应 ,而SO2-4 /
　　(上接第 292页)
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·294· 现代化工 第 29卷增刊(1)