全 文 ：书第 41 卷 第 8 期 东 北 林 业 大 学 学 报 Vol． 41 No． 8
2013 年 8 月 JOURNAL OF NORTHEAST FORESTRY UNIVERSITY Aug． 2013
1)全国优秀博士学位论文作者专项基金资助(200973)。
第一作者简介:刘文进，男，1987 年 4 月生，林木遗传育种国家
重点实验室(东北林业大学) ，硕士研究生。
通信作者:王玉成，林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大
学) ，教授。E－mail:wangyucheng1029@ yahoo． com． cn。
收稿日期:2013 年 3 月 3 日。
责任编辑:潘 华。
白花柽柳微小染色体维系蛋白 3(TaMCM3)
特异性识别 W－box元件1)
刘文进 王留强 王玉成
(林木遗传育种国家重点实验室(东北林业大学) ，150040，哈尔滨)
摘 要 真核生物翻译起始因子 5A(eukaryotic translation initiation factor 5A，eIF5A)是一个普遍存在于真核生
物中高度保守的蛋白，参与多种生命活动。通过对已克隆得到的一个柽柳 eIF5A 基因(TaeIF5A1)启动子分析发
现，其－622 ～ －627 bp区域存在 W－box“CTGACT”元件，利用酵母单杂交技术筛选柽柳 cDNA文库获得一个能够识
别W－box的微小染色体维系蛋白 3(minichromosome maintenance 3，MCM3) ，命名为 TaMCM3。进一步利用酵母单
杂交验证发现，将 W－box的核心序列“TGAC”中的“A”突变成“G”或者将“G”突变成“A”，TaMCM 则不能识别这
些序列，说明 TaMCM3 对 W－box的识别具有特异性。TaMCM能够结合含有 W－box元件的 TaeIF5A1 启动子片段，
但当 W－box序列突变后则不能识别，说明 TaMCM是通过与 W－box 相结合来与 TaeIF5A1 启动子相互作用的。研
究表明，TaMCM能够特异性地识别 W－box，并可能具有转录因子的功能。
关键词 柽柳;eIF5A;启动子;W－box;酵母单杂交
分类号 Q943． 2
Analysis on Minichromosome Maintenance 3 Protein from Tamarix androssowii Binding to W-box Element /Liu
Wenjin，Wang Liuqiang，Wang Yucheng(State Key Laboratory of Tree Genetics and Breeding，Northeast Forestry Univer-
sity，Harbin 150040，P． R． China)/ / Journal of Northeast Forestry University． －2013，41(8)． －22 ～ 26
Eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) ，a group of highly conserved proteins，are distributed in eukaryot-
ic cells and involved in a variety of biological processes． A W-box“CTGACT”motif was in －622－－627 bp in the promoter
of an eIF5A gene (TaeIF5A1)from Tamarix androssowii． A mini-chromosome maintenance protein (denoted as TaMCM3)
was found to bind to W-box by screening a cDNA library of T． androssowii with yeast one-hybrid system． TaMCM3 failed
in binding to W-box，when“G”mutated to“A”or“A”mutated to“G”of core“TGAC”sequence． Therefore，the bind-
ing of TaMCM3 to W-box is specific． Moreover，the TaMCM3 is binding to the promoter fragment containing W-box，but
the binding is loosed when W-box is mutated． TaMCM3 interacted with promoter of TaeIF5A1 through binding to W-box．
TaMCM3 can specifically recognize W-box and be served as transcription factor．
Keywords Tamarix androssowii;Eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) ;Promoter;W-box;Yeast
one-hybrid system
真核生物翻译起始因子 5A(eIF5A)是一个普
遍存在于真核生物细胞中高度保守的蛋白质。最早
是在兔子的血红细胞中发现的，因其能在体外实验
中促进翻译起始阶段第一个肽键的形成，因而将其
命名为翻译起始因子［1］，翻译起始因子对细胞的持
续性增殖起着关键性的作用。尽管还不清楚 elF5A
在合成蛋白和其他细胞途径中所扮演的确切角色，
但一种被普遍认同的假说认为，elF5A 是辅助核糖
体具有 mRNA特异性的翻译因子［2］，能够激发核糖
体发挥功能［3］。除此之外，还有关于翻译起始因子
参与运输 HIV－mRNA 和 mRNA 的稳定性等功能的
报道［4］。近年来还有研究发现，elF5A 在细胞衰老、
死亡以及一些植物环境胁迫应答方面同样发挥一定
的作用，从而使人们更加关注对 elF5A功能的研究。
我们从柽柳中克隆出了一条 eIF5A 基因，研究发现
其与植物抗逆相关，其过表达能提高转基因植物
的抗逆能力［5］。并克隆出来它的启动子序列，研
究表明，其启动子中含有 W－box(T /C)TGAC(C /
T)序列，说明该基因能够被识别 W－box 的蛋白质
所调控。
为了研究柽柳 eIF5A 基因的上游调控基因，本
研究将 W－box的碱基序列以 3 次重复的形式串联，
并连接到载体 pHIS2 上，利用酵母单杂交系统筛选
与 W－box互作的蛋白。研究发现一个微小染色体
维系蛋白 3(MCM3)能够与 W－box 特异性互作，提
示该蛋白对柽柳 eIF5A基因的表达起调控作用。
1 材料与方法
1． 1 构建重组报告载体 pHIS2－靶 DNA
通过分析 TaeIF5A1 基因的启动子序列发现［6］，
在基因上游－622 ～ －627 bp 区域存在 W－box“CT-
GACT”。将 W－box 元件串连成 3 个重复序列并引
入酶切位点的寡核苷酸片段 R3－5’与 R3－3’，然后
运用 PCR 方法进行靶 DNA 的合成。PCR 反应体
系:10×PCR Buffer 2 μL;R3－5’(100 μmol /L)9 μL;
R3－3’(100 μmol /L)9 μL。反应程序:95 ℃ 30 s，72
℃ 2 min，37 ℃ 2 min，25 ℃ 2 min。
用限制性内切酶 EcoR I和 Sac I 消化 pHIS2 质
粒，并与合成的靶 DNA 连接，热激法转化到大肠杆
菌 DH5α感受态细胞中，于含有卡那霉素(终质量
浓度为 50 mg /L)的 LB平板上进行克隆筛选。对获
得的克隆通过测序检测，获得 3 次 W－box 元件重复
的 pHIS2－报告载体，将重组质粒记为 R3。
1． 2 重组报告载体质粒和柽柳 cDNA 文库共转化
酵母细胞
取－70 ℃保存的 Y187 酵母菌种，划线培养于
YPDA固体培养基获取单菌落，挑取单菌落于 YP-
DA液体培养基进行活化。并制作酵母感受态细
胞，置于冰中备用。
在预冷的 15 mL离心管中加入如下 DNA溶液:
dscDNA(构建好的柽柳 cDNA文库)20 μL;pGADT7－
Rec2(0． 5 g /L)6 μL;pHIS2 －W 5 μg;鲱鱼精 DNA
(10 g /L)20 μL。按照酵母共转化的步骤将 pHIS2－
W与 dscDNA 共转化 Y187，取 81 μL 菌液进行 10
倍、100 倍、1 000 倍和 10 000 倍的稀释，然后分别涂
布于用于检测报告载体转化效率的 SD /－Trp、检测
文库转化效率的 SD /－Leu 和检测克隆数的 SD /－
Leu /－Trp固体培养基上，将其余的菌液涂布到含有
60 mmol /L 3－AT 的 SD /－His / －Leu /－Trp 互作筛选
培养基上，每个平板上涂 200 ～ 300 μL，30 ℃倒置培
养 3 ～ 7 d，直到有克隆出现。
1． 3 分析阳性克隆及上游调控因子的确定
将上述步骤获得的阳性克隆(直径大于 2 mm)
重新接种培养，在高于第一次 3－AT 筛选浓度的培
养基上进行再次筛选。挑取阳性克隆于 SD /－His / －
Leu /－Trp液体培养基中，在 30 ℃摇床中震荡(250
r /min)培养 1 ～ 2 d，进行酵母质粒的提取。
以载体 pGADT7 － Rec2 上的引物 M5’AD 和
M3’AD，对酵母文库 /AD质粒进行 PCR，检测文库 /
AD质粒中插入片段的长度。利用热激法将 PCR
检测结果为阳性的酵母文库 /AD 质粒转化到大肠
杆菌 DH5α 感受态细胞中，在含有氨苄霉素(终质
量浓度 50 mg /L)的 LB 平板上进行筛选。对筛选
得到的单克隆进行菌液 PCR，电泳检测到有特异
条带的记为单一文库 /AD 质粒，保存对应菌种并
送交公司测序分析，根据测序结果确定上游调控
因子。
1． 4 互作特异性的单杂验证
为了验证筛选得到的上游调控因子与 W－box
互作的特异性，对 W－box 的核心序列“TGAC”进行
碱基突变，突变为“TGGC”、“TAAC”和“TTTT”。按
照与 1． 1 相同的方法将其连接到 pHIS2 中，分别标
记重组质粒为 R4、R5 和 R6，将这 3 个突变与之前
构建好的 R3 作为报告载体。同时为进一步研究含
有 W－box元件的启动子片段能否被 TaeIF5A1 基因
上游调控因子识别，通过克隆获得含有 W－box 元件
的长度分别为 461 bp(－456 ～ －916)、165 bp(－591 ～
－755)的启动子片段，并且将 165 bp(－591 ～ －755)启
动子片段中的 W － box 元件核心序列突变成
“TTTT”，分别将 3 个片段与酶切好的 pHIS2 载体连
接，构成报告载体 R1、R2 和 mR2。
将获得的上游调控因子与 pGADT7－Rec2 载体
连接，构建 GAL4 的效应表达载体 AD －TaMCM3。
将报告载体质粒和效应载体质粒共转化 Y187。同
时，以 p53HIS2 与效应载体共转化酵母作为阴性对
照，p53HIS2 与 pGADT7 －Rec2 －53 作为阳性对照。
取 81 μL 含有酵母菌细胞的转化液，稀释 10 倍和
100 倍后分别涂布于 SD/－His / －Leu /－Trp和含有 3－
AT的 SD /－His / －Leu /－Trp 固体培养基上。待平板
上长出酵母克隆后，挑取单克隆于 SD /－His / －Leu /－
Trp液体培养基中，30 ℃摇床振荡培养 1 ～ 2 d，对培
养物进行 OD600 值得测量，调整浓度使其最后均为
2，并依次稀释 10 倍、100 倍和 1 000 倍。吸取 2 μL
未稀释和稀释过的菌液点于含有更高浓度 3－AT的
SD/－His / －Leu /－Trp /X/A平板上，30 ℃倒置培养 2 ～
3 d，观察生长情况。
1． 5 蛋白与启动子片段互作的验证
通将克隆含有 W－box 长度分别为 461 bp 和
165 bp 的启动子片段以单拷贝形式分别构建到
pHIS2 中，形成的报告载体命名为 R1，R2。将 165
bp的启动子片段中是 W－box突变，并构建到 pHIS2
中，将该载体命名为 R3。将上述 3 个载体分别与获
得的含有阳性克隆 pGADT7 －Rec2 共转化到酵母
Y187 中，菌液涂布于 SD /－His / －Leu /－Trp +3 －AT
(50 mmol /L)互作筛选培养基上，对它们的互作进
行进一步研究。
2 结果与分析
2． 1 重组报告载体与文库的互作筛选
将重组报告载体质粒的 PCR 检测结果如图 1
所示，根据片段长度初步认为靶 DNA 与报告载体
pHIS2 连接成功，以 pHIS2 载体酶切位点两端引物
pHIS2－F和 pHIS2－R对重组载体进行测序，测序结
果验证了报告载体构建成功。
将重组后的 pHIS2－靶 DNA 质粒、酶切线性化
32第 8 期 刘文进等:白花柽柳微小染色体维系蛋白 3(TaMCM3)特异性识别 W－box元件
的 pGADT7－Rec2 和 dscDNA共转化到酵母 Y187 细
胞中，将转化后的菌液涂布于含有 3－AT(60 mmol /
L)的 SD /－His / －Leu /－Trp的培养基中，30 ℃倒置培
养 4 ～ 5 d后，培养基上开始出现大小差异明显的菌
落，用 pHIS2 －W 元件筛选文库总共获得 104 个菌
落。为了降低假阳性的可能，提高筛选效率，挑取菌
落直径大于 2 mm的克隆于含更高浓度的 3－AT(比
第一次筛选增加 10 mmol /L)SD /－His / －Leu /－Trp
培养基中筛选，获得 34 个克隆。
2． 2 上游调控基因的确定
挑取两次筛选获得的阳性克隆于 SD /－His / －
Leu /－Trp液体培养基中进行培养，培养后提取酵母
质粒，并将质粒转化到大肠杆菌中进行进一步扩增，
提取质粒，进行测序，测序结果显示获得了一种与
W－box(CTGACT)互作的基因，将该基因进行 Blast
比较分析发现其与豌豆中的微小染色体维系蛋白 3
(minichromosome maintenance 3，MCM3)具有较高的
一致性(68%) ，比对结果如表 1。将获得的蛋白命
名为 TaMCM3，基因序列如图 2。
M． DNA Marker DL2000;R1－R6．报告载体。
图 1 报告载体(pHIS2－靶 DNA)PCR检测
表 1 筛选得到的与 W－box互作的蛋白
克隆编号 互作蛋白 Blastx比对结果 GenBank登录号 一致性 匹配物种
W1 mini－chromosome maintenance protein MCM3 AAN73053 219 /322(68%) ［Pisum sativum］
图 2 测序得到的 TaMCM3 基因序列
2． 3 基因与上游调控基因的互作特异性
为了验证筛选得到的基因与 TaeIF5A1 启动子
中的 W－box 互作的特异性，分别将 W－box 元件的
核心序列“TGAC”突变为“TGGC”、“TAAC”和
“TTTT”，以 3 次重复的形式串联，并插入到 pHIS2
载体中构建报告载体 R4－R6(图 3A) ，利用酵母单
杂交技术研究这些载体与 TaMCM3 的互作。结果
表明，在不含 3－AT 的 SD /－His / －Leu /－Trp 培养基
上，所有类型的转化子都能生长;在含有 50 mmol /L
3－AT 的培养基中，阴性对照和突变的 W－box 与
TaMCM3 互作的转化子均不能生长，只有阳性对照
和目标转化子(pHIS2－W－box+AD－MCM)能正常生
长(图 3B)。
为了进一步研究 TaMCM3 对含有 W－box 元件
的 eIF5A启动子的识别情况，克隆得到 TaeIF5A1 基
因上游的－456 ～ －916、－591 ～ －755 启动子区段，并
且将－591 ～ －755 启动子区段的 W－box 核心元件突
变成“TTTT”，然后将获得的所有片段与 pHIS2 载体
连接获得报告载体 R1、R2 和 mR2(图 3A)。将 R1、
R2 和 mR2 分别与 TaMCM3 的 GAL4 效应表达载体
42 东 北 林 业 大 学 学 报 第 41 卷
AD－TaMCM3 共同转化入酵母细胞 Y187 中。结果
表明，在不含 3－AT 的 SD /－His / －Leu /－Trp 培养基
上，所有类型的转化子都能生长;在含有 30 mmol /L
3－AT的培养基中，阴性对照以及 TaMCM3 与 mR2
的互作转化子就不能在 SD /－His / －Leu /－Trp 培养
基上生长，但是目的转化子均能正常生长(图 3C)。
以上 结 果 表 明 TaMCM3 能 够 通 过 识 别
TaeIF5A1 基因启动子上的 W－box 来与 TaeIF5A1 基
因的启动子进行互作。
A．报告载体和效应载体示意图。报告载体 R1、R2 分别为包含W－box的长度为 461 bp和 165 bp的启动子片段，mR2 为包含核心序列突变的长
度为 165 bp的启动子片段;报告载体 R3－R6 分别包含正常 W－box以及碱基突变的 W－box;效应载体 E1:pGADT7－Rec2－TaMCM3;B． TaMCM3
与 W－box以及 mW－box的互作;C． TaMCM3 与含有 W－box的启动子片段的互作。阴性对照:N1，p53HIS2+E1(AD－TaMCM3)。
图 3 酵母单杂交分析上游调控因子与 W－box的结合
3 结论与讨论
至今，eIF5A 的研究还是主要集中在人和酵母
细胞，其在植物中作用的研究很少，根据目前已经得
到的研究结果，eIF5A能够参与多种生命活动，如细
胞增殖［7］、蛋白质翻译［8］、mRNA 的转运和降
解［9－10］、细胞周期 G1 /S 转化［11］以及细胞的凋亡和
衰老［12］等。柽柳作为抗逆能力优良的林木，对其抗
逆基因 eIF5A的研究显得很重要，通过对本实验室
已经克隆得到的 TaeIF5A1 基因进行启动子分析后
发现，其上游－622 ～ －627 bp 区域存在唯一的对盐
胁迫响应的正向调控元件 W－box“CTGACT”，所以
确定能够识别 W－box 元件的上游调控因子就能明
确 TaeIF5A1 在植物抵抗逆境中所扮演的角色。
本文通过重组报告载体与文库的互作筛选的方
法，得到了与 W－box元件互作的与微小染色体维系
蛋白 3(minichromosome maintenance 3，MCM3)相似
性较高的蛋白，MCMs家族是一组普遍存在的、高度
保守的蛋白。首先于酵母微小染色体缺失突变体中
被鉴定，其功能与 DNA 复制起始有关［13］，MCM3 是
MCMs家族中重要的一员，研究发现［14－15］，MCM3 与
细胞周期调控有关，可以作为直接反映细胞的增殖
状态的标记物，指示细胞周期调节失常等［16］。利用
酵母单杂交技术研究柽柳中 TaMCM3 对于 W－box
元件的识别特异性，结果表明，TaMCM3 能特异性的
结合 TaeIF5A1 启动子中的“CTGACT”，但却不能结
合其核心序列“TGAC”中的“A”突变成“G”或者
“G”突变成“A”后的突变体。在研究 TaMCM3 对含
有 W－box元件的启动子片段的研究中也发现，TaM-
CM3 能够通过识别含有正常 W－box 元件的启动子
片段启动目标基因的表达，但是不能识别突变了的
启动子片段。综上所述，TaMCM3 能特异性地识别
W－ box 序列，并能够通过识别 W － box 原件与
TaeIF5A1 基因的启动子相互作用。以上研究提示，
除了以往报导的 MCMs与 DNA复制起始相关外，它
可能还具有转录因子的特性，值得进一步研究。
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(上接 12 页)提高了脂松的抗寒性。主要考虑遮荫
后苗木避免了冬季强光和雪的反射等导致的低温光
氧化伤害，秋季涝渍处理导致土壤和苗木含水量较
高，木质化不充分，苗木中可溶性糖含量积累量较
少。从而导致越冬期间细胞膜受伤害程度大，抗寒
性差。秋季变温处理越冬伤害和苗木死亡率最大，
该处理针叶经历了融－冻－融－冻的冻融胁迫循环，
细胞也经历了结冰体积增大，解冻细胞体积减小的
反复伸缩作用，细胞膜结构遭到破坏，所以细胞膜透
性较对照高。在细胞膜伸缩过程中氧自由基的积累
既可引起细胞膜脂过氧化，导致膜脂过氧化产物
(MDA)增多，又能激活抗氧化酶系统和促使脯氨酸
积累，它们一起分解氧自由基，防止膜脂过氧化。我
国北方地处北温带，黑龙江省属于大陆性季风气候，
有典型的四季交替，在 9 月下旬至 10 月份反常气候
频繁出现，导致一些树木极易受到冻害，苗木常常因
遭受秋霜冻害，致使枯梢或死亡，这也是一个生产中
长期困扰林业生产和园林绿化的一个重要问题。
越冬期间由于生理过程的复杂性、环境条件的
易变性和综合性，形成了植物适应逆境方式的多样
性和复杂性。构成植物对多重胁迫的响应往往不是
各胁迫响应的累加作用，胁迫间往往存在交互作
用［22－23］，各种逆境因子交织在一起构成极其复杂的
环境。脂松具有较强的抗低温胁迫能力，在整个自
然越冬过程中能够快速应对环境温度变化，通过调
整生理代谢使针叶中快速积累渗透调节物质，抑制
膜脂过氧化，保护细胞膜的完整性。其越冬伤害受
水分、温度、光照等多种因素影响，秋末冬初的骤然
变温或秋季土壤水分过量均会导致脂松苗木在自然
越冬过程中发生越冬伤害，而冬季适当遮荫有利于
脂松安全越冬。
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62 东 北 林 业 大 学 学 报 第 41 卷