全 文 ：过山枫总黄酮抗氧化作用研究
丁宗保 1 ,李　强1 ,佟　丽 2 ,潘秀婷 1 ,吴卓敏1 ,谢　扬 1＊
(南方医科大学 1.药学院;2.中医药学院 ,广东 广州 510515)
　　摘要　目的:探讨过山枫总黄酮的体外抗氧化活性。方法:分别采用 DPPH·法 、ABTS+法和 Fenton体系法 ,以
抗坏血酸(VitC)作阳性对照 ,测定了过山枫总黄酮对 DPPH· 自由基 、ABTS+自由基 、· OH自由基的清除或抑制
能力。结果:过山枫总黄酮对 DPPH·自由基 、ABTS+自由基 、· OH自由基均具较强的清除或抑制效果。在供试浓
度范围内 , 过山枫总黄酮对上述 3种自由基的清除或抑制效率与总黄酮浓度间呈现一定量效关系 , 当过山枫总黄
酮浓度达 18.15、 11、18.15 μg/mL时 ,其对 DPPH· 、ABTS+与· OH的清除或抑制率分别达到 87.43%、 85.84%与
92.56%, 均高于同浓度下 VitC的清除或抑制率。结论:过山枫总黄酮具有较强的抗氧化的作用。
关键词　南蛇藤;过山枫;总黄酮;抗氧化;DPPH· ;ABTS+;· OH
中图分类号:R285.5　　文献标识码:A　　文章编号:1001-4454(2011)03-0435-03
收稿日期:2010-05-07基金项目:广州市科技局应用基础研究项目(2007J1-C0081)＊通讯作者:谢扬 , Tel:020-61648593, E-mail:tonyxie1963@126.com。
　　过山枫(CelastrusaculeatusMer.)是我国民间
久用的一种植物药 ,属于卫矛科南蛇藤属植物 ,其药
用部位是根及藤茎。 Kupchan等 〔1〕曾对南蛇藤属植
物的化学成分 、生物合成 、药理学进行了综述。据报
道 ,南蛇藤属具有抗炎 、抗菌 、抗病毒 、抗肿瘤 、免疫
抑制 、昆虫拒食及毒杀等活性〔2〕。 Sassa等 〔3〕发现南
蛇藤素可通过直接清除氧自由基而有效抑制线粒体
内外的氧化反应 ,并可通过增加表面负电荷来避免
对线粒体内膜造成损伤。
抗氧化活性是黄酮类化合物的基本性质 ,近年
来对黄酮抗氧化作用的研究备受关注 。过山枫所含
黄酮也具有抗氧化作用 ,但清除自由基的能力如何 ,
需要进一步探讨。为此 ,本实验分别采用 DPPH·
法 、ABTS+法和 Fenton体系法测定过山枫总黄酮对
DPPH·自由基 、ABTS+自由基 、· OH自由的清除
能力 ,探讨过山枫总黄酮的体外抗氧化活性 ,为过山
枫总黄酮的药理活性研究及天然食品抗氧化剂开发
利用提供理论依据。
1　材料与仪器
1.1　试剂　1, 1-二苯基-2-苦味肼基(DPPH· ),亚
硝酸钠 ,三氯化铝 ,氢氧化钠 , ABTS+(sigma公司生
产), 过硫酸钾 , 番红花红 T, 30%双氧水 , EDTA-
Na2 ,七水硫酸亚铁 (FeSO4 · 7H2O),磷酸氢二钠
(Na2HPO4),二水磷酸二氢钠 (NaH2PO4 · 2H2O),
抗坏血酸 ,甲醇 、无水乙醇及 95%乙醇均为分析纯 ,
实验用水为二次蒸馏水 ,芦丁标准品 (中国药品生
物制品检定所)。
1.2　主要仪器　紫外 -可见分光光度计(上海美普
达仪器有限公司),恒温水浴锅(巩义市予华仪器有
限公司);旋转蒸发仪(巩义市予华仪器有限公司);
ppendof手动可调程单道移液器(德国艾本德股份
公司);赛多利斯电子天平(德国 Sartorius)。
2　方法
2.1　过山枫中总黄酮的提取　称取粉碎后的过山
枫粉末 20 g,按 1∶10(g/mL)料液比加入 70%乙醇
溶液 ,冷凝回流提取 2h,过滤 ,滤渣按上述操作重复
提取 2次(各 1 h),合并滤液 ,用 95%乙醇定容至一
定体积。
2.2　芦丁标准曲线的制备　准确称取 0.00500 g
芦丁标准品 ,用甲醇溶解 ,定容至 25.00 mL得 200
μg/mL的储备液 。分别取此储备液 0.00、 1.00、
1.50、2.00、2.50、3.00mL置于 10 mL容量瓶中 ,各
加入蒸馏水 1.5mL、5%亚硝酸钠溶液 0.4mL,摇匀
放置 6 min,加 10%三氯化铝溶液 0.4mL,摇匀放置
6min,再加 1 mol/L氢氧化钠溶液 4 mL,用蒸馏水
定容后摇匀放置 15 min,以相应试剂为空白 ,测 500
nm处光密度 D(λ)值。以光密度值为纵坐标 ,浓度
为横坐标 ,绘制标准曲线 。
2.3　样品总黄酮的测定　过山枫藤提取液 5 mL,
用蒸馏水定容至 50 mL得储备液 ,分别取此储备液
1.00、2.00、3.00 mL于 10mL容量瓶中 ,按 “2.2”项
下操作 ,从加水 1.5 mL到 500 nm处测定光密度 D
(λ)值 。根据芦丁标准曲线计算样品总黄酮的含
量。
2.4　过山枫总黄酮抗氧化活性的测定
2.4.1　对 DPPH·清除活性的测定:DPPH·是一
种稳定的自由基 ,其乙醇溶液为深紫色 ,在 517 nm
处附近有强吸收峰 。当向 DPPH·溶液中加入自由
·435·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 34卷第 3期 2011年 3月
DOI :10.13863/j.issn1001-4454.2011.03.034
基清除剂时 ,溶液颜色变浅 , 517 nm光密度值变小 ,
光密度值变小程度与自由基清除程度成线性关系 。
据此可检测自由基的清除情况 ,从而评价所用样品
的抗氧化能力。抗氧化能力用清除率表示 ,清除率
越大 ,抗氧化能力越强。参照郑灵芝等 〔4〕方法 ,精
取 DPPH·标准品 0.025 g,用 95%乙醇溶解并定容
于 100mL棕色容量瓶 ,得 250 μg/mLDPPH·储备
液 。吸取 2.50mLDPPH·储备液 ,加入 2.50mL不
同浓度的提取液于 5 mL离心管中 ,室温避光反应
30 min,于 517 nm处测定光密度值 ,平行 3次 。用
同样浓度系列的 VitC溶液作阳性对照 ,根据以下
公式计算 DPPH·清除率:
DPPH·清除率 =1-[ D(λ)-D(λ)1]D(λ)0 ×100%
式中:D(λ)为供试液 2.5 mL+DPPH· 2.5 mL的光密
度值;D(λ)1为供试液 2.5 mL+95%乙醇 2.5 mL的光密度
值;D(λ)
0
为 95%乙醇 2.5 mL+DPPH· 2.5 mL的光密度
值。
2.4.2　对 ABTS+清除活性的测定:参照 Fan等 〔5〕
方法 ,将 7mmol/L的 ABTS与 2.45 mmol/L的过硫
酸钾溶液等体积混合 , 室温避光放置 16 h, 成
ABTS+储备液。临用前用无水乙醇稀释至光密度为
0.70+0.002,得 ABTS+工作液 。取 3 mLABTS+工
作液与 0.3 mL不同浓度供试液混匀 , 室温反应
6 min后迅速于 734 nm处测定光密度值。用同样浓
度系列的 VitC溶液作阳性对照 ,根据以下公式计
算 ABTS+清除率:
ABTS+清除率 =1-[ D(λ)-D(λ)1]D(λ)0 ×100%
式中:D(λ)为供试液 0.3mL+ABTS+3.0 mL的光密度
值;D(λ)1为供试液 0.3 mL+95%乙醇 3.0 mL的光密度
值;D(λ)0 为 95%乙醇 0.3 mL+ABTS+3.0 mL的光密度
值。
2.4.3　对 · OH自由基清除活性的测定:参照沈
皖梅等 〔6〕方法 ,采用 Fenton反应体系 , · OH由 ED-
TA-Na2 -Fe(Ⅱ)-H2O2产生 ,由于 · OH可特异性地
使番红花红 T褪色 ,根据褪色程度用比色法来衡量
· OH的含量。精密量取磷酸盐缓冲液 1.5 mL(pH
7.4,下同)、2.5mL蒸馏水于试管中 ,混匀后作空白
参比管 D(λ)空参;精密量取 1.5 mL磷酸盐缓冲液 、
番红花红 T(260 μg/mL,下同)0.2mL、2.3mL蒸馏
水于试管中 ,混匀后作未损伤管 D(λ)未损;精密量取
磷酸盐缓冲液 1.5 mL、EDTA-Na2 -Fe(II)0.7 mL(2
mmol/L,下同)、3% H2O2 0.8 mL、番红花红 T0.2
mL和 0.8 mL蒸馏水 ,于试管中混匀后作损伤管
D(λ)损伤;精密量取磷酸盐缓冲液 1.5mL和 0.8 mL
的样品液 , 加 1.7 mL蒸馏水 ,混匀作样品参比管
D(λ)样参;精密量取磷酸盐缓冲液 1.5mL,不同浓度
的供试液 0.8 mL、3% H2O2 0.8 mL、260 μg/mL番
红花红 T0.2mL(依次加入)于试管中 ,混匀作样品
管 D(λ)样品 , 混匀后于 37 ℃保温 30 min,然后于
552 nm处测定光密度值。每个浓度组平行测定 3
次。用同样浓度系列的 VitC溶液作阳性对照 ,根
据以下公式计算
·OH自由基抑制率 =D(λ)样品 -D(λ)样参 -[ D(λ)损伤 -D(λ)空参 ]D(λ)未损 -D(λ)损伤 ×100%
3　结果
3.1　芦丁标准曲线　图 1表明 ,芦丁浓度在 20 ～
60 μg/mL内与其光密度呈良好的线性关系 ,线性回
归方程为:y=0.0128x-0.0266, R2 =0.9991。
图 1　芦丁标准曲线
3.2　过山枫总黄酮抗氧化性的测定
3.2.1　对 DPPH·清除活性的测定:从图 2可以看
出:在较低浓度(0 ～ 20 μg/mL)区域 ,过山枫总黄酮
清除 DPPH·自由基的能力比 VitC稍强。当过山
枫总黄酮浓度为 18.15 μg/mL时 ,其对 DPPH·自
由基的清除率达到 87.43%。表明过山枫总黄酮对
DPPH·自由基有明显的清除作用 ,且随过山枫总黄
酮质量浓度(试验浓度范围内)的增加 ,其清除 DP-
PH·自由基的能力增强 ,具有明显的量效关系 。
图 2　过山枫总黄酮对 DPPH·的清除率
3.2.2　对 ABTS+清除活性的测定:图 3显示 ,在较
低浓度(0 ～ 11 μg/mL)区间 , 过山枫总黄酮清除
ABTS+自由基的能力比 VitC略高;当过山枫总黄
酮浓度达到 11 μg/mL时 ,其对 ABTS+自由基的清
除率为 85.84%;在过山枫总黄酮浓度超过 11 μg/
mL时 ,其清除 ABTS+自由基的能力与 VitC相当。
显然 ,过山枫总黄酮对 ABTS+自由基具有明显的清
·436· JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 34卷第 3期 2011年 3月
除作用 ,且随过山枫总黄酮质量浓度的增加 ,其清除
ABTS+自由基的能力增强 ,存在明显的量效关系 。
图 3　过山枫总黄酮对 ABTS+清除率
3.2.3　对 ·OH自由基清除活性的测定:由图 4可
以看出 ,过山枫总黄酮对 · OH自由基有明显的抑
制作用 ,并且随着过山枫总黄酮质量浓度的增大 ,其
对 ·OH自由基的抑制能力也随之增强 ,存在明显
的量效关系 。当过山枫总黄酮浓度为 18.15 μg/mL
时 ,其对·OH自由基的抑制率为 92.56%。对比图
5,可看出 VitC对 · OH自由基要达到与过山枫总
黄酮相同的抑制率 ,其浓度远大于过山枫总黄酮 。
换言之 ,在较低浓度时 ,过山枫总黄酮抑制 · OH自
由基的能力比 VitC更强。
图 4　过山枫总黄酮对· OH自由基抑制率
图 5　VitC对· OH自由基的抑制率
4　讨论
自由基是带有未成对电子的分子或离子 ,其活
性高 ,一旦产生即迅速与周围分子发生破坏性反应 。
过量自由基的氧化及其中间产物严重伤害生物膜 、
酶 、维生素 、蛋白质及活细胞功能 。现已明确许多疾
病或症状 ,如肿瘤 、炎症 、心脑缺血 、动脉粥样硬化
等 ,都与自由基有关 。为了减轻自由基的危害 ,寻找
高效 、价廉 、低毒或无毒 、天然的抗氧化剂 ,筛选具有
抗自由基损伤的物质 ,具有重要的意义 。
本实验测定了过山枫总黄酮的体外抗氧化活
性。结果表明 ,过山枫总黄酮对 DPPH· 、ABTS+、
· OH三种自由基都表现出较强的清除或抑制作
用 ,并且在试验浓度范围内随着过山枫总黄酮浓度
的增大 ,其对 DPPH· 、ABTS+、· OH三种自由基的
清除或抑制作用增强 ,且呈明显的量效关系。通过
与 VitC体外抗氧化活性的阳性比较 ,证明过山枫
总黄酮清除或抑制自由基的能力比相同浓度下的
VitC稍强 ,这说明过山枫总黄酮具有较强的抗氧化
活性 ,具备作为天然抗氧化剂的潜在开发价值。关
于过山枫所含黄酮化合物的结构及其与抗氧化能力
之间的关系还有待进一步研究。
参 考 文 献
[ 1] KupchanSM.Ubersichtuberdiecelastraceen-inhaltsstofe:
chemie, biosynthesepharmakologie[ J] .Phytochemistry,
1978, 17:1821-1858.
[ 2] 郭远强 , 李铣 .南蛇藤属植物化学成分研究进展 [ J] .
沈阳药科大学学报 , 2003, 20(3):226-229.
[ 3] SassaH, KogureK, TakaishiY, etal.Structuralbasisof
potentantiperoxidationactivityofthetriterpenecelastrolin
mitochondria:efectofnegativemembranesurfacecharge
onlipidperoxidation[ J] .FreeRadic.Biol.Med., 1994,
17(3):201-207.
[ 4] 郑灵芝 , 李索霞 ,袁勤生 .大豆异黄酮抗氧化性质的研
究 [ J] .食品与药品 , 2006, 8(02A):48-50.
[ 5] FanY, HeX, ZhouS, etal.Compositionanalysisandan-
tioxidantactivityofpolysaccharidefromDendrobiumden-
neanum[ J].Int.J.Biol.Macromol., 2009, 45(2):169-
173.
[ 6] 沈皖梅 , 靳学远 .石榴叶总黄酮抗氧化性质的研究
[ J] .安徽农学通报 , 2008, 14(21):63-64.
《中药材 》杂志为国家首批公布的可登处方药广告的专业媒体 。
·437·JournalofChineseMedicinalMaterials　　第 34卷第 3期 2011年 3月