全 文 ：包埋玻璃化法超低温保存沙生柽柳休眠茎尖的研究
刘艳萍 , 滕立平 , 段黄金 , 鲁乃增 , 王高辉　(塔里木大学植物科学学院 ,新疆阿拉尔 843300)
摘要　[目的 ]采用包埋玻璃化法 ,对沙生柽柳休眠茎尖成功地进行冷冻保存。 [方法]将沙生柽柳休眠茎尖包埋在含 3%褐藻酸钙的胶
球中 ,研究了预培养中蔗糖浓度、培养时间和不同玻璃化保护液处理的时间对沙生柽柳休眠茎尖存活率的影响。 [结果]含沙生柽柳茎
尖的胶球在 0.8mol/L蔗糖溶液中培养 24 h可获得较高的存活率;胶球经玻璃化保护液[ 40%甘油+ 45%(0.4mol/L)蔗糖 +10%聚乙
二醇(分子量 4 000)+5%二甲基亚砜]在 25℃处理 20min可以明显提高存活率 ,在优化条件下存活率可高达 48.3%。 [结论]蔗糖浓
度和预培养时间是决定沙生柽柳茎尖存活率的关键因素。
关键词　沙生柽柳;休眠茎尖;超低温保存;包埋玻璃化法
中图分类号　S793.5　　文献标识码　A　　文章编号　0517-6611(2010)11-05576-02
CryopreservationofShoot-tipsofTamarixtaklamakanensisDomantBudsbyEncapsulation-vitrification
LIUYan-pingetal　(ColegeofPlantScience, TarimUniversity, Alar, Xinjiang843300)
Abstract　[ Objective] Shoot-tipsofTamarixtaklamakanensisDomantbudsweresuccessfulycryopreservedbyusingencapsulation-vitrification.
[Method] Domantshoot-tipswereencapsulated3%calciumalginatebeads.Themainfactorsinfluencingtheviabilitysuchassucroseconcentra-
tion, preculturetime, diferentvitrificationsolutionandthetimebeadsinvitrificationsolutionwerestudied.[Result] Highviabilitycouldbeob-
tainedwhenalginatebeadswerepreculturedfor24 hin0.8 mol/Lsucrose.Thebeadsweredehydratedwithvitrificationsolution[ 40%Gly+
45%(0.4mol/L)Suc+ 10%PEG(4 000)+5%DMSO] for20minat25℃.Underoptimumconditions, theviabilityofdomantshoot-tips
couldreach48.3%atthemost.[Conclusion] SucroseconcentrationandpreculturetimewereimportantfactorsinfluencingtheviabilityofTama-
rixtaklamakanensisDomantbuds.
Keywords　TamarixtaklamakanensisDomant;Shoot-tip;Cryopreservation;Encapsulation-vitrification
作者简介　刘艳萍(1977-),女 ,辽宁沈阳人 ,讲师 ,从事植物种质保存
研究。
收稿日期　 2009-12-28
　　沙生柽柳(Tamarixtaklamakanensis)生长于远离河床和
湖盆的沙丘上 ,是我国荒漠地区流动沙丘上最抗旱耐热的固
沙造林树种。研究亚洲中部荒漠植物区系特点和本属的系
统发育 ,有重要的科学意义 [ 1-2] 。目前对沙生柽柳种质资源
保存的研究还较少 ,主要采用原生境保存和建立植物园 。野
外保存植物种质资源需要大量的土地和人力资源 ,成本高 ,
且易受各种自然灾害的侵袭 [ 3] 。近几十年来迅速发展的超
低温保存技术将生物材料在超低温下(通常用液氮 -196
℃)冷冻 ,使活细胞的一切生命活动处于停滞状态 ,从而防止
遗传变异 ,保持种质的全部优良品质 ,并实现长期保存的目
的 [ 4-6] 。近年来出现的包埋玻璃化法兼容包埋脱水法和玻
璃化法保存种质的优点 ,不但简化了超低温保存的设备和技
术 ,细胞化冻后有较高的存活率 ,而且保存后的茎尖不经过
愈伤组织直接形成植株 ,显示出巨大的应用潜力 [ 7-11] 。目
前 ,尚未见采用超低温方法保存柽柳属植物的研究报道 。为
此 ,笔者采用包埋玻璃化法对沙生柽柳茎尖进行超低温保存
的研究 ,主要探讨蔗糖预培养时蔗糖浓度 、预培养时间对沙
生柽柳休眠茎尖的影响以及不同玻璃化保护液处理不同时
间对沙生柽柳茎尖的影响 ,以期建立适合沙生柽柳的超低温
保存技术 ,同时为柽柳科柽柳属其他植物的超低温保存提供
参考。
1　材料与方法
1.1　材料　沙生柽柳休眠茎尖采自新疆农一师十二团沙
漠 。取深冬沙生柽柳休眠茎尖 ,用自来水浸泡 24 h后用自来
水冲洗 1 h,然后用浓度 10%NaClO浸泡 10 min,再用浓度
75%乙醇浸泡 20min,消毒后用无菌水冲洗 2 ～ 3遍 ,剥取 2
～3 mm茎尖进行包埋 。
1.2　包埋方法　将剥取好的茎尖与浓度 3%褐藻酸钠溶液
混匀 ,用胶头滴管吸取 1个茎尖后滴入 0.1mol/LCaCl2溶液
中 ,固定 30min,制成直径约 4mm的胶球。
1.3　蔗糖预培养　将不同浓度的蔗糖溶液进行灭菌后 ,将
胶球投入其中 ,振荡培养(120r/min, 25 ℃)。
1.4　玻璃化溶液处理　用 6种玻璃化保护液进行保护剂毒
性试验后 ,从中选取最优配方。 6种玻璃化保护液为:A:
30%甘油 +15%乙二醇 +15%二甲基亚砜 +0.5 mol/L蔗
糖 ,即 PVS2保护液 , B:40%甘油 +45%(0.4 mol/L)蔗糖 +
10%聚乙二醇(分子量 4 000)+5%二甲基亚砜 , C:聚乙二醇
(分子量 4 000)+葡萄糖 +二甲基亚砜(10∶8∶10, V/V), D:
15%(0.4 mol/L)蔗糖 +25%甘油 +15%乙二醇 +13%二甲
基亚砜 +2%聚乙二醇(分子量 4 000), E:50%甘油 +50%
蔗糖 , F:0.4 mol/L山梨醇 +10%(W/V)二甲亚砜。
1.5　化冻方法　将冻存管迅速取出 ,在无菌条件下打开管
盖 ,快速把冻存管中的胶球倒入 30 ℃无菌的蒸馏水中快速
振荡 ,直至最后一粒冰晶消失。
1.6　培养条件及存活率的测定 [ 12] 　将化冻后胶球用无菌水
冲洗后接种至 MS培养基上 ,暗恢复 1d后置于光强 2 000lx、
光周期 12∶12条件下进行培养 ,待茎尖成活后统计其存活率。
2　结果与分析
2.1蔗糖浓度 、预培养时间对沙生柽柳休眠茎尖存活率的影
响　图 1表明 ,未经过蔗糖预培养的沙生柽柳茎尖冰冻后没
有存活;蔗糖浓度为 0.8 mol/L时 ,冰冻前后存活率都达到或
接近最高值 ,而当蔗糖浓度超过 0.8 mol/L,冰冻前后存活率
都明显下降。图 2表明 ,预培养 6 ～ 24 h对沙生柽柳茎尖冰
冻前存活率几乎没有影响 ,但对冰冻后存活率有一定的影
响 ,预培养 48h冰冻后存活率最高 ,达 55%。
采用包埋玻璃化法 ,在预培养中蔗糖浓度和培养时间是
影响材料存活率的重要因素 。对高等植物进行预培养时所
用的蔗糖浓度一般为 0.30 ～ 0.75 mol/L,其中 0.75 mol/L更
责任编辑　刘月娟　责任校对　况玲玲安徽农业科学 , JournalofAnhuiAgri.Sci.2010, 38(11):5576-5577, 5607
DOI :10.13989/j.cnki.0517-6611.2010.11.129
为常用 [ 13] ;培养时间一般为 1 d或更长。采用超低温方法处
理柽柳科柽柳属植物尚未见报道。笔者在保存胡杨 、灰杨休
眠茎尖时发现蔗糖最适浓度为 0.8 mol/L,预培养时间为 24
h。该研究表明 ,采用 0.8mol/L蔗糖溶液对沙生柽柳茎尖预
培养 24 h也获得了较高的存活率。这说明对一些耐旱植物
进行蔗糖预培养时应采用比一般植物较高的蔗糖浓度。
　注:包埋后茎尖预培养时间为 24h,经 PVS2即玻璃化保护液 A
处理 20min。
　Note:Cultivatedtimeofshoot-tipafterembeddingis24h, treated
byPVS2, i.e., glassprotectionsolutionAwith20min.
图 1　预培养中蔗糖浓度对沙生柽柳休眠茎尖存活率的影响
Fig.1　Efectsofsugarconcentrationinpre-cultureonsurvival
rateofdomantshoot-tipofTamarixtaklamakanensis
　注:蔗糖浓度为 0.8mol/L,经PVS2即玻璃化保护液 A处理 20
min。
　Note:sugarconcentrationis0.8 mol/L, treatedbyPVS2, i.e.,
glassprotectionsolutionAwith20min.
图 2　预培养时间对沙生柽柳休眠茎尖存活率的影响
Fig.2　Efectsofpre-culturetimeonsurvivalrateofdomant
shoot-tipofTamarixtaklamakanensis
2.2　玻璃化保护液处理对沙生柽柳休眠茎尖的影响　图 3
表明 ,未经玻璃化保护液处理的沙生柽柳休眠茎尖冰冻后全
部死亡;经不同的玻璃化保护液处理后未经冰冻的茎尖随处
理时间的延长存活率降低 ,而冰冻后不同的玻璃化保护液处
理获得最高存活率。其中 ,玻璃化保护液 A、B在处理 20 min
后获得最高存活率 ,分别为 46.6%、48.3%;玻璃化保护液 C
～F在处理 30 min后获得较高存活率 ,分别为 44.8%、
37.1%、38.3%、37.3%。
玻璃化保护液可以降低冰点 ,增强溶液黏滞性 ,阻碍冰
晶生长 ,使细胞形成玻璃化状态 ,从而减轻冰冻伤害 ,提高保
存后的成活率 [ 4] 。对一些高等植物的研究表明 ,保护剂混合
使用比单独使用效果好 ,其优越性在于各种成分之间具有协
同效应和累加效应 ,但是其毒性不累加 [ 7, 9] 。该研究表明 ,减
少渗透型保护剂的含量 ,增加非渗透型保护剂的含量 ,在一
定程度上可以提高茎尖的存活率 ,且混合型保护剂的保护效
果较好 。几种玻璃化保护液相比 ,玻璃化保护液 B中渗透型
保护剂含量较少 ,对材料的毒害作用也较小 ,所以冰冻后茎
尖存活率最高 ,为 48.3%。这与笔者对胡杨和灰杨的研究结
果一致 。该研究表明 ,在采用包埋玻璃化法保存沙生柽柳茎
尖时 ,选择合适的玻璃化保护液及处理时间是提高冰冻保存
存活率的关键。玻璃化保护液 B较适合沙生柽柳休眠茎尖
培养。
　注:8mol/L蔗糖预培养 24h。
　Note:8mol/Lsugarpre-culturedwith24h.
图 3　不同玻璃化保护液处理时间对沙生柽柳休眠茎尖存活率的
影响
Fig.3　Efectsofdifferenttreatmenttimeofglassprotectionso-
lutiononsurvivalrateofdomantshoot-tipofTamarix
taklamakanensis
3　结论
研究表明 ,蔗糖预培养是必要的。蔗糖浓度和预培养时
间是影响沙生柽柳茎尖存活率的关键 。选择 0.8mol/L蔗糖
溶液预培养 24h可以获得较好的保存效果。玻璃化溶液的
选择及处理时间也对茎尖存活率有较大影响。玻璃化保护
液 B处理 20min,可以获得较高的存活率 ,其最高存活率为
48.3%。深冬的休眠茎尖已经过低温锻炼 ,可以简化对材料
的冷驯化过程 ,且可以提高保存的存活率。但是 ,由于沙生
柽柳休眠茎尖较小且比较幼嫩 ,存活率还有待提高。
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(下转第 5607页)
557738卷 11期　　　　　　　　　　　　　　　　刘艳萍等　包埋玻璃化法超低温保存沙生柽柳休眠茎尖的研究
表 1　不同配方对双孢蘑菇菌丝体生长的影响
Table1　EffectsofdifferentformulasonmyceliumgrowthofAgaricus
bisporus
试验组
Testgroup
生长速度∥mm/d
Growthrate
满袋时间∥d
Timeforovergrowingbag
① 7.1 19
② 7.3 18
③ 7.5 16
④(CK) 6.7 20
2.2　不同配方对双孢蘑菇生长情况的影响　由表 2可以看
出 ,双孢蘑菇子实体的菌盖直径 、菌盖厚度 、菌柄长度 、菌柄
粗度都表现为配方①、②优于配方③、④,配方②优于配方
①;而单菇重和产量则是配方②最大 ,且与配方①、④之间差
异显著 ,与配方③差异极显著。究其原因可能由于酒糟内含
物大部分已被利用制酒 ,故养分后劲较差 ,加上菌蕾数目过
多 ,从而导致子实体生长缓慢 ,添加了玉米芯后提供充裕的
碳氮源 ,提高了双孢蘑菇的产量。
表 2　不同配方对双孢蘑菇子实体形态及生产性能的影响
Table2　EffectsofdiferentformulasonmorphologyandproductionperformanceofAgaricusbisporusfruitbody
试验组
Testgroup
菌盖直径∥cm
Pileusdiameter
菌盖厚度∥cm
Pileusthickness
菌柄长度∥cm
Stipelength
菌柄粗∥cm
Stipethickness
单菇重∥g
Weightpermushroom
产量∥kg
Yield
① 4.9 2.2 1.2 2.0 26.97±0.05bA 0.79±0.05bAB
② 5.0 2.4 1.2 2.0 27.87±0.04aA 1.10±0.05aA
③ 4.5 2.1 0.8 1.9 21.73±0.05c 0.22±0.04c
④(CK) 4.8 2.2 1.0 1.9 26.82±0.03bA 0.81±0.03bAB
　注:表中不同大、小写字母分别表示在 0.01和 0.05水平差异显著。下表同。
　Note:Diferentcapitalletersandlowercasesinthetablestandforsignificantdiferencesat0.01and0.05level.Thesameasfolows.
2.3　不同配方对双孢蘑菇子实体营养含量的影响　由表 3
可知 ,不同配方栽培双孢蘑菇 ,子实体的营养含量差别较明
显 。配方①碳水化合物含量最高 ,蛋白质含量适中;配方②
子实体的蛋白质 、粗纤维 、灰分含量较高;配方③、④子实体
蛋白质含量偏低 ,脂肪 、粗纤维 、灰分基本没有差别。而双孢
蘑菇的营养价值主要是蛋白质含量高 ,从此角度看 ,配方②
培养的双孢蘑菇质量最好 ,且与其他配方之间差异显著。
表 3　不同配方对双孢蘑菇子实体营养含量的影响
Table3　EfectsofdifferentformulasonthenutrientcontentofAgaricusbisporusfruitbody %
试验组
Testgroup
蛋白质
Protein
脂肪
Fat
碳水化合物
Carbohydrate
粗纤维
Crudefiber
灰分
Ash
① 30.1±0.1bA 2.5±0.1a 33.4±0.2a 5.0±0.1c 13.5±0.1ab
② 32.1±0.2aA 2.3±0.2ab 30.5±0.2b 5.8±0.1a 13.7±0.2a
③ 22.3±0.2c 2.2±0.2ab 31.2±0.3b 4.6±0.2c 13.3±0.1b
④(CK) 21.3±0.2c 2.5±0.1a 30.8±0.4b 5.5±0.1b 12.8±0.2c
3　结论
(1)酒糟中含有促进菌丝生长的生长因子 ,加强了菌丝
活性分解作用 ,从而使双孢蘑菇生长速度快 ,长势致密。
(2)利用酒糟栽培双孢蘑菇时 ,培养料易板结 ,导致产量
下降 ,加入玉米芯 ,既可增加透气性 ,又可为双孢蘑菇的生长
提供养料 ,产量较高 ,经济效益明显。
(3)应用酒糟栽培双孢蘑菇 ,双孢蘑菇子实体中的蛋白
质含量较高 ,与 “麦秸 +牛粪 ”培养的双孢蘑菇子实体的蛋白
质含量相当。
(4)应用酒糟栽培双孢蘑菇 ,综合利用了白酒酿造的副
产物 ,既环保又经济 ,对提高酿酒企业的经济效益有重要
意义。
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