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大叶钩藤的分子鉴定
朱 爽1，周 林1，黄晓敏1，高晓霞2，孙 悦3，曾常青3*
(广东药学院 1. 生命科学与生物制药学院;2. 药科学院;3. 中药学院，广东 广州 510006)
摘要 目的:以核糖体转录间隔区(rDNA ITS)序列为分子标记，对钩藤属的常用中药材大叶钩藤(Uncaria
macrophylla Wall.)进行遗传分析，阐明大叶钩藤的分子系统发育关系。方法:通过改良 CTAB法提取大叶钩藤植物
总 DNA，利用通用引物对 rDNA ITS序列进行 PCR扩增，经克隆、测序后，运用 Clustal X，BioEdit和 PAUP等软件进
行序列分析和构建系统发育树。结果:测序得到大叶钩藤植物的 rDNA ITS区序列长度为 718 bp，序列分析结果显
示大叶钩藤与 Genbank中已有的钩藤属植物相似，在系统发育树中与钩藤属植物 Uncaria guianensis(AJ414546)和
Unacria africana(AJ414545)聚类成为一枝，又与钩藤属的钩藤(U. rhynchophylla，AJ346900)、华钩藤(U. sinensis，
FJ980386)、毛钩藤(U. hirsute，GU937110)和无柄果钩藤(U. sessilifructus，GU937111)并排聚类成一枝。结论:基于
rDNA ITS区序列的测序分析和系统发育树构建的分子生物学方法，能够对大叶钩藤进行准确的分子鉴定分析，为
钩藤属中药材的种类鉴定和种间的分类地位提供分子生物学理论依据。
关键词 钩藤;ITS序列;分子鉴定
中图分类号:R282. 5 文献标识码:A 文章编号:1001-4454(2011)08-1206-03
收稿日期:2011-03-29
基金项目:广东省自然科学基金资助项目(8451022401001607) ;中山市科技局资助项目(2010H017)
作者简介:朱爽(1977-) ，男，讲师，主要从事中药材分子鉴定的研究;Tel(Fax) :020-39352201，E-mail:wenchengji@ yahoo. com. cn。
* 通讯作者:曾常青，Tel(Fax) :020-39352128，E-mail:gdzcq@ 163. com。
中药钩藤为茜草科钩藤属植物，始载于《名医
别录》，其性微寒，味甘，用于头痛眩晕、感冒夹惊、
高血压症等，临床常配伍入药［1］。2010 年版中国药
典规定钩藤为茜草科植物钩藤 Uncaria rhynchophyl-
la(Miq. )Miq. ex Havil. 、大叶钩藤 Uncaria macro-
phlla Wall. 、华钩藤 Uncaria sinensis (Oliv. )Havil. 、
毛钩藤 Uncaria hirsute Havil.或无柄果钩藤 Uncaria
sessilifructus Roxb. 的干燥带钩茎枝［2］。化学成分研
究表明，钩藤药材中的主要有效成分为生物碱，但不
同种的药效成分有明显的差别［3］。目前，我国的钩
藤主要分布在广西、贵州、云南、广东等西南地区，由
于钩藤药材的广泛使用，有些地区的品种面临濒危，
导致市场上销售的钩藤种类十分混乱，出现互混、互
代、以次充好的现象，影响了用药的安全性和有效
性。为了更准确更安全地使用钩藤中药材，有必要
利用 DNA 分子标记技术进一步鉴定钩藤属植物的
种间关系。分子生物学技术已在药用植物的分子系
统发育分析中广泛利用，但对于钩藤属植物的种间
关系的分子鉴定少有报道，陶刚、朱爽等〔4、5〕曾对钩
藤属植物进行分子鉴定并归类到属。
本研究采用分子生物学技术，以核糖体转录间
隔区(rDNA ITS)序列为分子标记，对一种采集自广
东鼎湖山的大叶钩藤(U. macrophylla Wall.)rDNA
ITS序列进行分析，构建其系统发育树，从遗传本质
上对大叶钩藤的分类地位和种间鉴定提供分子证
据。
1 材料来源与鉴定
大叶钩藤材料采集于广东肇庆鼎湖山龙校鸡
尾，由广东药学院曾常青教授鉴定。该植物为攀援
状大藤本，有褐色疏粗毛，茎枝呈方柱形，每一节上
有钩，叶对生，近革质，卵形或阔椭圆形。采集新鲜
的叶片，48 h内进行钩藤总 DNA 提取，或直接放进
置含有硅胶的密封袋中快速干燥备用。
2 方法
2. 1 植物总 DNA 提取 采用改良 CTAB 法［6］提
取植物总 DNA:在预冷的灭菌研钵中，将 0. 5 g新鲜
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DOI:10.13863/j.issn1001-4454.2011.08.017
干叶片或茎枝在液氮中研磨至粉末状;每 1 g 样品
加入 5 mL 65℃预热 CTAB 裂解液(CTAB 4%，Tris-
HCl 100 mmol /L，EDTA 25 mmol /L，NaCl 1. 4mol /L，
β-巯基乙醇 2%，PVP 1%，pH 8. 0) ，充分混匀后按
每 1 mL混合液分装到 1. 5 mL Eppendorf管中，并于
65℃温育 2 h，期间每隔 15 ～ 20 min 颠倒振荡 1 次;
4℃，12 000 r /min离心 5 min，吸取上清液用等体积
的 Tris饱和酚抽提 2 次，酚-氯仿-异戊醇(25∶ 24∶ 1)
和氯仿-异戊醇(24∶ 1)各抽提 1 次。可以根据情况
重复以上操作直至两相分层处没有明显的杂质，然
后 4℃，12 000 r /min 离心 5 min，取上清液并加入
NaAc(pH 5. 2) ，使溶液终浓度达到 3 mol /L，再加入
2. 5 倍体积的无水乙醇，于 － 20 ℃沉淀 1 h，吸出
DNA至 1. 5 mL 的 Eppendorf 管中，用 1 mL 70%冷
乙醇洗涤 2 次，无水乙醇洗涤 1 次，风干后溶于 50
μL无菌 TE缓冲液中，－ 20 ℃保存备用。
2. 2 PCR 扩增 选择扩增植物 rDNA ITS 序列的
通用引物(上海生工生物工程公司合成)［7］ ITS5(5
GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3)和 ITS4(5 TC-
CTCCGCTTATTGATATGC3)对钩藤总 DNA 进行
rDNA ITS 序列的扩增。在 20 μL 的 PCR 反应体系
中含有 10 × PCR buffer(2. 5 mmol /L，含 MgCl2)2
μL，dNTP(10 mmol /L)0. 4 μL，引物量为 10 pmol，
rTaq(5 U /μL)0. 2 μL，加入约 50 ng的模板 DNA，其
余体积以无菌超纯水补足。PCR 扩增反应过程为:
95 ℃预变性 3 min，94 ℃变性 1 min，52 ℃退火 50
s，72 ℃延伸 50 s，循环 35 次，最后在 72 ℃延伸 10
min。PCR仪型号为 Applied Biosystems(2720 Ther-
mal cycler PCR)。
2. 3 PCR产物纯化、连接和转化 钩藤 rDNA ITS
序列的 PCR扩增产物(大约 720 bp)在紫外灯下从
1%的琼脂凝胶进行割胶并采用 DNA凝胶回收试剂
盒回收。纯化后与 pMD18-T-Vecter 连接，连接产物
转化 Escherichia coli JM109 感受态细胞，并进行氨苄
青霉素抗性选择和蓝白斑筛选。
2. 4 测序及序列分析 挑取单克隆菌液送交华大
基因科技股份有限公司进行测序。测序得到的序列
通过与国际基因数据库(GenBank)中已有的 ITS 区
序列进行比较分析，得到该序列大概的分子系统发
育关系。DNA序列之间的比较分析通过 Bioedit 软
件完成。通过 ClustalX程序(版本 1. 8)进行序列的
比对。应用 PAUP 软件(版本 4. 0 b10)［8］，使用最
大简约法(Maximum Parsimony，MP)计算及构建系
统进化树，用 Bootstrap 值(1，000 bootstraps)检验系
统树上各节点的置信水平。使用 TREEVIEW查看。
3 结果与讨论
3. 1 总 DNA 提取结果 用 50μL TE 缓冲液回溶
钩藤的总 DNA，取 2μL总样品 DNA，用 SYBR Green
I染色 10 min后进行 1%(质量分数)琼脂糖凝胶电
泳，Tanon-4100 全自动数码凝胶图像分析系统记录
结果如图 1 所示。大叶钩藤样品的总 DNA 条带主
带清晰，无明显降解，提取的总 DNA片段完整性好。
图 1 总 DNA样品的琼脂糖凝胶电泳图
1. 大叶钩藤 2. Marker(DL2000)
3. 2 大叶钩藤 rDNA ITS区 PCR扩增结果 植物总
DNA模板按 1、10、102、103、104 的稀释倍数稀释后，进
行 rDNA ITS序列的 PCR 扩增。从 PCR 浓度梯度扩
增的结果可知，模板浓度在 10 ～ 102 的稀释倍数时，
rDNA ITS 序列能够被高效扩增。在最佳模板浓度
下，大叶钩藤样品 rDNA ITS序列PCR扩增产物的
图 2 最佳模版浓度条件 PCR扩增结果
1. 大叶钩藤 2. Marker(DL2000)
·7021·Journal of Chinese Medicinal Materials 第 34 卷第 8 期 2011 年 8 月
1%琼脂糖凝胶电泳结果见图 2。由图 2可知，大叶钩
藤rDNA ITS序列 PCR产物的主带清晰，无非特异性
条带，大小约为 718 bp。由此可知，在模板最佳浓度
下，钩藤碱等对 PCR扩增的抑制性最低，能够高效的
扩增出 rDNA-ITS序列。
3. 3 ITS区序列分析 挑取 3 个单克隆测序，获得
大叶钩藤样品 rDNA ITS序列的长度为 718 bp。把获
得的 rDNA ITS 序列与 GenBank 中已有的 rDNA ITS
序列进行比较分析，得到与之亲缘关系相近的序列，
序列之间通过 Clustal X比对和 BioEdit 计算，发现大
叶钩藤与 GenBank 中已有的毛钩藤(U. hirsute，
GU937110)、无柄果钩藤(U. sessilifructus，GU937111)、
钩 藤 (U． rhynchopkylla， AJ346900)与 华 钩 藤
(U． sinensis，FJ980386)的 相 似 分 别 为 97. 3%、
97. 0%、96. 5%和 97. 0%。
3. 4 分子系统发育分析 把大叶钩藤样品 rDNA
ITS序列与 GenBank中已有的 rDNA ITS序列进行比
较，得到与之亲缘关系相近的钩藤属其他种的序列和
与之亲缘关系相近属的序列。采用最大简约法(MP)
分析，并以 Nauclea subdita(AJ346876)和 Nauclea xan-
thoxylon(AJ346877)为外群建立一棵大叶钩藤样品的
最大简约树(见图 3)。
图 3 大叶钩藤的最大简约树
从图 3可以看出，大叶钩藤与 GenBank中已有的
钩藤Nncaria guianensis(AJ414546)和Nncaria africana
(AJ414545)聚类成为一枝，接着又与钩藤属的其他 4
种 常 用 钩 藤，分 别 是 钩 藤 (U. rhynchophylla，
AJ346900)、华钩藤(U. sinensis，FJ980386)、毛钩藤
(U. hirsute，GU937110)和无柄果钩藤(U. sessilifructus，
GU937111)聚类成一枝。由此可见，从分子系统发育
分析的角度，大叶钩藤与 GenBank中已有的其他 4种
常用钩藤亲缘关系较远，并不与这 4 种钩藤直接聚类
成为一枝，而是与数据中另外两种钩藤 Nncaria
guianensis(AJ414546)和 Nncaria africana(AJ414545)
的亲缘关系最近，并且与之序列的相似性分别高达
97. 6%和 98. 1%。这样，从分子水平上支持了大叶钩
藤在钩藤属药材中的分类地位。rDNA ITS 序列是用
来研究药用植物种内变异和种间、近缘属间分子标记
之一，本研究测定了一种采集自广东鼎湖山的大叶钩
藤(U. macrophylla)rDNA ITS 序列，并结合 GenBank
中已有的钩藤属 rDNA ITS 序列，构建了大叶钩藤在
其近缘物种之间分子系统发育树，并确定了该大叶钩
藤的分子分类，从而丰富了钩藤属药材的种类鉴定和
种间分类的理论依据，也有利于钩藤属植物资源的开
发和有效利用。
参 考 文 献
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