全 文 ：乌蕨孢子繁殖技术的研究
张国珍1 ,2 ,李策宏2 ,谷海燕1 ,2 ,余道平1 ,2
(1.四川省自然资源科学研究院 ,四川 成都 610015;2峨眉山生物资源实验站 ,四川 峨眉 614201)
　　摘要:研究了乌蕨(Stenoloma chusanum (L.)Ching)孢子无菌繁殖和常规繁殖方法。结果表明 ,乌蕨孢子在 1/4MS 培养基培养时
的萌发率最高 ,达 85.3%;在 1/2MS培养基中的配子体成苗率最高 ,达 85.9%;1/ 2MS 培养基是培养优质孢子体苗的最佳培养基;河
沙与草炭土体积比为 1∶1 的混合基质是播种孢子的理想基质 , 孢子萌发率和配子体成苗率分别达到 82.6%和 73.4%;无菌繁殖和
常规繁殖所得的幼孢子体苗移栽成活率均达 90%以上 。
关键词:乌蕨;孢子;无菌培养;常规繁殖
中图分类号:Q94551　　文献标志码:A　　文章编号:1005-8141(2010)12-1062-03
Study on Spore Propagation of Stenoloma chusanum(L.)Ching
ZHANG Guo-zhen1 ,2 , LI Ce-hong1 , GU Hai-yan1 , 2 , YU Dao-ping1, 2
(1.Sichuan Academy of Natural Resource Sciences , Chengdu 610015 , China;
2.Mountain Emei Biotic Resource Experimental Station , Emei 614201 , China)
Abstract:The spore sterile culture and routine propagation of Stenoloma chusanum(L.)Ching were studied.The results showed that the maxi-
mum germination rate was obtained in 1/ 4MS medium , which reached 85.3%;the highest rate of gametophyte to sporophyte was achieved in 1/ 2MS
medium , which reached 85.9%;1/2MS medium was the best for cultivating high quality sporophyte.The mixed soil which the sand and the turf blend
in the volume ratio of 1 to 1 was the optimal growing medium for spore routine propagation , in which the rate of germination and gametophyte to the
sporophyte were up to 82.6% and 73.4% respectively.The transplant survival rate of all sporophytes obtained from sterile culture and routine propa-
gation reached above 90%.
Key words:Stenoloma chusanum(L.)Ching;spore;sterile culture;routine propagation
　　收稿日期:2010-10-21;修订日期:2010-11-23
基金项目:四川省财政厅基本科研业务费“峨眉山野生观赏蕨类
的开发利用”和四川省科技条件平台项目———四川省植物资源共享平
台建设项目共同资助。
第一作者简介:张国珍(1977-),女 , 四川省简阳人 , 硕士 ,助理研
究员 ,主要从事植物生理 、生态方面的研究。
　　乌蕨(Stenoloma chusanum (L.)Ching)为鳞始蕨科
(Lindsaeaceae)乌蕨属植物 ,别名乌韭 、雉鸡尾 、地柏枝
等[ 1] ,适生范围较广 ,在海拔 200—1900m 的山坡 、路
旁 、溪沟等均有生长 ,广布于长江以南各省(市),北达
陕西南部。乌蕨全草入药 ,主要用于解毒 ,民间素有
“万能解毒药”之称[ 2] ,植株常绿 ,叶多回分裂 ,形似羽
扇 ,孢子囊群生于裂片顶端如瓶 , 盆栽极具观赏价
值[ 3] 。
乌蕨集观赏与药用价值于一体 ,受到人们的广泛
追捧 ,野生资源远远不能满足人们的需求 。尤其是近
年来对乌蕨的过度采集 ,导致生境被破坏 ,部分地区的
野生资源匮乏。为了有效地保护和可持续利用乌蕨资
源 ,亟需对乌蕨进行人工栽培繁殖。蕨类繁殖一般采
用分株繁殖和孢子繁殖 ,前者繁殖系数低 、生产成本
高;而孢子繁殖所需材料少 、繁殖系数高 ,是快速繁育
种苗的有效途径[ 4] 。目前 ,有关乌蕨的孢子繁殖仅任
冰如等研究了温度 、光照和 GA对乌蕨孢子萌发率的
影响[ 5] ;郭治友研究了乌蕨配子体发育[ 6] ,而将乌蕨孢
子繁殖成苗的系统研究还未见报道 。作者对乌蕨孢子
繁殖技术进行了全面研究 ,以期对乌蕨资源保护及其
种苗商品化提供技术参考 。
1　材料与方法
1.1　孢子采集
实验所用乌蕨孢子 2008年 8月采集于峨眉山生
物资源实验站。将具有成熟孢子的叶片从植物体剪下
装入牛皮纸信封 ,置于干燥通风处 ,待孢子自然弹落后
收集于信封内并及时播种或接种 ,剩余部分置于 4℃
冰箱保存供重复实验所用 。
1.2　孢子消毒
称取孢子 0.2g用洁净滤纸包好 ,在超净工作台上
先用无菌水将滤纸包浸湿 ,再用 70%—75%的酒精浸
泡30—40s ,置入 0.1%的升汞溶液消毒15min ,无菌水
漂洗 5次 ,最后放在无菌的培养皿中待用 。
1.3　孢子繁殖
无菌培养:在无菌孢子里加入 10ml无菌水 ,制成
孢子悬浮液 ,用无菌的毛笔将悬浮液分别均匀地涂抹
到MS 、1/2MS 、1/4MS 、1/6MS 、1/8MS 共计 5 种培养基
上(培养基均使用MS培养基 ,内含全量的铁盐和有机
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成分 ,蔗糖浓度为 2%),同时接种 CK 培养基(无糖及
任何营养元素)作为对照 。以上所有培养基琼脂浓度
均为 0.7%,pH值为 5.7—5.8;接种后置于 25℃、光照
强度为 2500LX(光源为日光灯)、光照时间为 12h/d 的
培养室内培养。以上每种培养基各接种 6瓶。
常规繁殖:播种基质为 4种不同比例的沙土混和
物(即普通河沙与草炭土的混合物 ,混合比例分别为:
沙∶土=1∶0 、沙∶土=1∶1 、沙∶土=1∶3 、沙∶土=0∶1),
各基质的 pH 值约 6.5—7 。将各基质消毒后分别装入
有孔育苗穴盘(基质厚度约为穴深度的 3/4),压实 ,将
穴盘置入盛水托盘 ,待基质吸水饱和即可进行播种;将
收集的孢子均匀地弹落在与育苗穴盘大小相当的白纸
上 ,再将附有孢子的白纸倒扣在育苗穴盘上 ,轻轻弹
动 ,让孢子均匀地撒落在各基质上;用保鲜袋封住穴盘
保湿 ,同时可防止其他蕨类植物的孢子 、杂草种子或霉
菌等污染。播种后放置于 25℃、光照强度为 2500LX
(光源为日光灯)、光照时间为 12h/d 的培养室内培养。
以上每种基质各播种 3穴。
1.4　孢子萌发及配子体发育观察
从接种后第二天开始 ,用光学显微镜定期观察并
拍摄孢子萌发及配子体的形态发育过程 ,直至形成幼
孢子体;记录不同处理中孢子萌发的时间 、萌发率 、原
叶体形成的时间 、第一株幼孢子体苗出现的时间及配
子体发育成孢子体的百分率。孢子萌发率=瓶(穴)中
显绿总面积/瓶(穴)总基质面积×100%,同一基质水
平以各瓶(穴)的平均值为准 ,以孢子接种15d后统计 。
2　结果与分析
2.1　乌蕨孢子萌发及配子体形态发育
乌蕨孢子为黄色 ,二面体型 ,单裂缝 ,边缘睫毛状
(图 1 ,见封二)。孢子萌发后逐渐发育成丝状体 、片状
体和原叶体 。乌蕨孢子萌发时先长假根 ,再出现原叶
体细胞 ,孢子萌发为书带蕨型(Vittaria-type);丝状体
具4 —6个细胞 ,成熟原叶体为对称心形(图 2 , 见封
二),原叶体发育为槲蕨型(Drynaria-type)[ 7] 。
2.2　孢子无菌培养结果
培养基无机盐浓度对孢子萌发 、配子体发育和成
苗的影响:研究发现 ,乌蕨孢子在不同无机盐浓度培养
条件下的萌发情况及配子体发育情况均存在不同程度
的差异 ,较高浓度和较低浓度的无机盐均不适宜于孢
子的萌发。相对于 MS 培养基全量无机盐来说 ,适当
低浓度无机盐适宜于乌蕨孢子的萌发 ,能缩短萌发时
间 、提高萌发率 ,而无机盐浓度的适量增加又能促进配
子体发育成幼孢子体 。从表 1可见 ,在无无机盐和糖
的CK培养基中 ,部分孢子能正常萌发 ,但发育到配子
体阶段 ,其配子体在培养过程中逐渐死亡 ,不能受精形
成孢子体 ,说明其整个萌发发育需要营养才能完成;乌
蕨孢子在 1/4MS培养基培养时萌发最早 ,比其他培养
基提前 1—4d ,比 CK 提前 6d 萌发 ,接种后 5d即隐约
显绿 ,27d基本发育成原叶体(配子体), 63d便出现幼
小孢子体 ,而且孢子萌发率高达 85.3%,是本实验中
最适宜乌蕨孢子萌发的培养基配方;其次是 1/2MS培
养基和 1/6MS培养基 ,其萌发时间 、配子体大量出现
时间及第一株幼孢子体苗出现时间仅比 1/4MS 培养
基分别推迟 1d 、4d 、3d和2d 、3d 、2d ,而且孢子萌发率也
较高 ,分别为 65.5%和 78.7%;而 1/2MS 培养基是乌
蕨孢子萌发过程中配子体发育成幼小孢子体的最佳无
机盐浓度 ,其成功发育率达到 85.9%。
表 1　乌蕨孢子在不同培养基中的萌发与发育状况
培养基 萌发时间(d)
萌发率
(%)
配子体大量
出现时间
(d)
第一株幼
孢子体苗
出现时间
(d)
配子体发育
成孢子体
的百分率
(%)
MS 9 34.6 35 74 58.3
1/2MS 6 65.5 31 66 85.9
1/4MS 5 85.3 27 63 65.4
1/6MS 7 78.7 30 65 52.7
1/8MS 9 42.1 33 82 43.8
CK 11 29.8 38死亡 - -
　　培养基无机盐浓度对幼孢子体苗生长的影响:将
刚萌发出的乌蕨幼孢子体苗分别接种在上述 MS 、1/
2MS 、1/4MS 、1/6MS 和1/8MS培养基上继代培养 ,发现
培养壮苗需要适宜的无机盐浓度。接种在 1/2MS 培
养基上的幼孢子体苗生长迅速 ,根系发达 ,而且植株整
齐 ,培养 30d株高就达到 10cm ,初具观赏价值(图 3 ,见
封二)。而接种在 MS 培养基上的幼孢子体植株生长
参差不齐 ,根系发育缓慢 ,根量少 ,甚至有的无根;生长
快的大苗抑制小苗生长 ,培养一段时间(30d)后 ,部分
植株高达 9cm ,而小苗基本停止生长。接种在无机盐
浓度相对较低的 1/4MS 和 1/6MS 培养基上的幼孢子
体虽然生长整齐 ,但长速缓慢 ,接种 1个月后株高仅
1—2cm ,根系少而短 ,需培养 2—3个月才具有观赏价
值 ,大大增加了育苗成本;而接种在 1/8MS 培养基的
幼苗则因无机盐含量过低而长势较差 ,幼苗小而黄 。
试管苗的移栽:待幼孢子体分裂出 2—3个羽片且
根系相对发达时 ,将培养瓶从组培室拿出 ,置于炼苗
室 ,揭开瓶盖培养 ,炼苗一周后出瓶移栽 。移栽基质为
提前用 1%高锰酸钾溶液消毒过的混合基质(河沙∶草
炭土=1∶1),盛装于有孔育苗穴盘 。在移栽时 ,将植株
琼脂洗净 ,尽量避免损伤根部 。移栽后注意喷水 、遮
阴 ,保持炼苗室内湿度在 70%以上 ,以防幼苗缺水萎
蔫;培养 2—3周 ,待幼苗生长稳定后即可再次带土移
栽到花盆 。乌蕨试管苗移栽成活率可达 90%以上 。
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2.3　孢子常规繁殖结果
栽培基质对孢子萌发及配子体发育的影响:乌蕨
孢子撒播于几种栽培基质后 8—9d均显绿萌发 ,最终
都能发育成幼孢子体并具有较高的移栽成活率 ,但不
同基质培养下其萌发率及配子体发育成孢子体的百分
率差异较大(表 2)。沙土体积比为 1∶1的混合基质最
适宜乌蕨孢子萌发 ,其萌发率高达 82.6%,是纯草炭
土基质的 2.3倍;其配子体发育成孢子体的百分比为
73.4%,是纯河沙的 3.7倍。
表 2　乌蕨孢子在不同培养基质中的萌发与发育状况
基质
基质表面
显绿时间
(d)
萌发率
(%)
第一株幼孢
子体苗出现
时间(d)
配子体发育
成孢子体
的百分率
(%)
幼孢子体苗
移栽成活率
(%)
沙∶土=1∶0 9 64.6 89 19.6 90.4
沙∶土=1∶1 8 82.6 68 73.4 98.6
沙∶土=1∶3 9 52.3 74 59.7 92.1
沙∶土=0∶1 9 35.8 86 31.3 90.5
　　孢子常规繁殖的管理:乌蕨孢子常规繁殖操作简
便。在适宜的培养条件下 ,其成苗率和幼孢子体移栽
成活率均较高 ,在幼苗大规模繁殖中具有较高的推广
价值 ,但需加强以下几个环节的管理。一是播种孢子
前基质一定要压紧 、压实 ,吸水饱和 ,盛装高度略低于
容器;二是孢子在整个萌发过程中需要水分 ,尤其是在
配子体发育阶段一定要保证水分的供给 ,以促进受精
形成幼孢子体;三是幼孢子体苗的间苗 ,密度过大不宜
培育壮苗 ,而且抑制配子体发育成幼孢子体;四是幼孢
子体苗的移栽及管理 ,移栽时尽量不损伤根系 ,同时加
强水分管理 ,保持环境湿度。
3　结论与讨论
乌蕨孢子在不同无机盐浓度的 MS培养基上都能
萌发 ,这与Miller 报道的从蒸馏水到复杂的营养液都
适宜孢子萌发的研究结果一致[ 8] 。研究发现 ,无机盐
浓度比较低的 1/4MS 培养基适宜乌蕨孢子的萌发 ,可
缩短萌发时间 、提高萌发率 ,这与 Khoo 等报道的高浓
度无机盐抑制铁线蕨(Adiantum raddianum`Tassel )孢
子萌发的结果一致[ 9] ,而与孙锐等对粗梗水蕨(Cer-
atopteridacea pteridoide)和翟国燕等对蕨菜(Pteridium
aquilinum)孢子萌发的研究结果相反[ 10 ,11] ,这种差异应
该是由研究对象的种属不同造成的 。乌蕨孢子在没有
无机盐的培养基中最终不能发育成幼孢子体 ,而在 1/
2MS培养基中其成苗率最高 ,说明适量增加无机盐浓
度能促进乌蕨配子体发育成幼孢子体 ,这与孙锐等对
粗梗水蕨配子体发育的研究结果一致[ 10] 。
与无菌繁殖相比较 ,在适宜的培养基质条件下 ,乌
蕨孢子的萌发速度 、萌发率以及配子体发育成孢子体
的百分率差异不大 ,是孢子人工繁殖的有效途径。但
两者各有优势 ,常规繁殖具有操作简便 、繁殖系数大 、
幼苗成活率高 、成本低等优点 ,是孢子体苗规模化生产
的较好途径 ,能创造可观的经济效益;而无菌繁殖人为
可控性强 ,是开展相关理论研究的有效途径。
本研究完成了对乌蕨生活史的详细观察 ,通过对
乌蕨孢子无菌繁殖和常规繁殖技术探讨 ,建立了乌蕨
孢子的人工繁殖方法 ,为乌蕨理论研究 、资源保护和开
发利用提供参考 。
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2010年 12月 20日
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