全 文 ：基 础 研究
半边旗提取物对 HL-60 细胞的细胞毒
作用及对细胞周期的影响
何承伟 , 　梁念慈 , 　莫丽儿 , 　李金华 , 　张晓
广东医学院(生物化学与分子生物学研究所:何承伟 ,梁念慈 ,李金华 ,张晓;化学教研室:莫丽儿),
广东 湛江 524023
　
【摘要】　目的:研究蕨类植物半边旗提取物对 HL-60 细胞的体外杀伤作用及对细胞周期的影响。方
法:用噻唑蓝(MTT)法测定细胞成活率;用流式细胞术测定细胞周期时相分布 。结果:半边旗乙醇总提
取物 PSE 及纯化合物 5F 、6F 及 A 对 HL-60 细胞有强烈的杀伤作用 ,具明显的时间和剂量效应;PSE 、
5F 、6F 及 A作用 HL-60细胞 24 h 后 ,G0/G1 期细胞比例明显下降 ,S 期细胞比例明显升高 ,G2/M 期轻
度升高(5F 作用组例外)。结论:半边旗提取物对 HL-60 细胞有强烈的杀伤作用 ,明显影响细胞周期时
相分布 。
肿瘤防治杂志 ,2001 ,8(4):348-350
【关键词】　半边旗;细胞毒作用;细胞周期
【中图分类号】　R273-3　　　【文献标识码】　A　　　　【文章编号】　1009-4571(2001)04-0348-03
Cytotoxicity and Cell Cycle Disturbance Effects of Pteris Semipinnata L.Extraction on HL-60 Cells 　He
Cheng-wei , LIANGNian-ci ,MO Li-er , et al .Institute of Biochemistry and Molecular Biology , Guangdong Medi-
cal College ,Zhanjiang 524023 , China
Abstract :Objective　To investigate the cytotoxicity and cell cycle disturbance effects of extraction f rom Pteris
Semipinnata L.(PSL)on HL-60 cells in vitro .Methods 　Cytotoxicity assay was tested by tetrazolium salt
(MTT)method.Cell cycle was determined using Flow Cytometry (FCM)analysis.Results　The total ethanolic
extraction(named as PSE)of PSL , compound 5F , 6F and A showed strong cytotoxicity against HL-60 cells in a
obvious time and dose dependent manner.After exposure of HL-60 cells to PSE , compound 5F ,6F andA for 24
hours , the cell cycle distribution was changed compared to control:the percentage of cells in G0/G1 phase de-
creased while increased in S phase significantly , and G2/M phase ratio increased slightly except the group of
compound 5F treatment.Conclusion　Extraction from PSL showed strong cytotoxicity and cell cycle dister-
bance effects on HL-60 cells.
China J Cancer Prev Treat ,2001 ,8(4):348-350
Key words:pteris semipinnata L.;cytotoxicity ;cell cy cle
　　半边旗(Pteris Semipinnata L .)是真蕨目凤尾蕨科
植物 ,民间用于治疗菌痢性肠炎 、肝炎 、结膜炎 、跌打肿
【基金项目】　国家自然科学基金项目(39870900)
【作者简介】　何承伟(1972-),男 , 江西省南康市人 , 讲师 , 医
学博士 , 主要从事抗肿瘤药物的生化药理 、基因工程及基因治
疗研究。
痛 、疮疡疖肿 、蛇伤等[ 1] 。我们课题组在筛选多种抗肿
瘤植物药的过程中发现半边旗的乙醇及水提取物具有
显著的抗肿瘤作用 ,可抑制 HL-60 、K562 、S180 、HepA
等细胞的生长 ,并可增强 5-FU 的抗肿瘤作用[ 2] 。进
一步的分离纯化得到几个纯的化合物:5F 、6F 和A ,经
结构鉴定是四环二萜类化合物[ 3] 。作者以人早幼粒细
胞株 HL-60 为例 ,探讨半边旗乙醇总提取物 PSE 及化
·348· 肿瘤防治杂志 2001年 8月第 8卷第 4期　　CHINA J CANCER PREV TREAT , AUG.2001 , Vol.8　No.4
DOI :10.16073/j.cnki.cjcpt.2001.04.005
合物 5F 、6F 和A 对细胞的杀伤作用及对细胞周期时
相分布的影响。
1　材料与方法
1.1　半边旗提取物
乙醇总提取物 PSE 及化合物 5F 、6F 和A(结构式
如图 1所示)由我所植化室分离提取并鉴定结构 。
图 1　半边旗提取物 5F 、6F 和A 的化学结构
1.2　细胞株
人早幼粒白血病细胞株(HL-60)由我所细胞培养
室保存 。
1.3　细胞培养
HL-60细胞在含 10%灭活小牛血清 、100 U/mL
青霉素和 100 μg/mL 链霉素的 RPMI-1640 完全培养
基中 ,于 37℃, 5% CO2 ,饱和湿度孵箱内培养。隔天
以约 1∶3比例传代 1 次 ,控制细胞浓度在 1×105 ～ 1
×106范围内 。
1.4　受试药物的配制
PSE 、5F 、6F 和 A 用 DMSO 配制成原液 , 分装冻
存 ,临用前用生理盐水稀释至所需浓度。处理细胞时 ,
DMSO 的最终浓度小于或等于 0.1%,实验表明该浓
度对细胞的生长没有影响 。
1.5　细胞毒实验
MTT 法参照 Hansen 等[ 4]的方法 。取对数生长期
HL-60 细胞 1×105/mL , 分装入 96 孔板中 , 每孔 90
μL ,用药组加 10 μL 药液 ,每一种药设 5 个浓度。对
照组加 10 μL 相应溶剂(含 0.1%DMSO 的生理盐
水),每组均设 4个平行孔。于 37℃, 5%CO2 ,饱和湿
度孵箱中保温相应时间后 ,加 20 μL 5 mg/mL MTT 试
剂 ,孵箱中反应 5 h ,再加 20%SDS-50%二甲基甲酰
胺溶解液 , 37℃保温 3 ～ 5 h 后 , 用酶标仪 (Bio-Red
M 450)测定吸光度(A),测定波长是 570 nm ,参考波长
是 450 nm 。按下式计算药物对细胞的抑制率(IR):
抑制率 =(1 -[ A 570-A450] 用药组/ [ A 570 -A450] 对照组)×
100%。
按改良 Kaber 公式计算半数抑制率(IC50)[ 5] 。
1.6　细胞周期测定[ 6]
对数生长期 HL-60 细胞 2×105/mL ,共 15 mL ,加
半边旗各提取物 150 μL ,对照组加 150 μL 溶剂(含
0.1%DMSO 的生理盐水),于 37℃, 5%CO2 ,饱和湿度
孵箱中保温 24 h 后收集细胞 ,1 000 g ×5 min离心去
上清 ,用 Hanks Buffer 洗 2次 ,最后 1 次剩 0.3 mL 左
右 ,迅速注入 75%冰冷的乙醇中 ,轻轻混匀 , -20℃
放置 24 h以上 , 800 g ×5 min 离心完全去除乙醇 ,重
悬于 40μL 磷酸-柠檬酸缓冲液中(192份 0.2 mol/L
Na2HPO4 ,8份 0.1 mol/L 柠檬酸 , pH7.8),室温下放
置 30 min , 1 000 g ×5 min 离心去上清 ,细胞团悬于
0.3mL Hanks Buffer 中 ,加 0.7 mL 50 μg/mL 碘化丙
啶(含 50 μg/mL RNase)避光染色 30 min ,用尼龙网过
滤后 ,在流式细胞仪上分析细胞周期分布 。
2　结果
2.1　半边旗提取物对 HL-60 细胞的细胞毒作用
　　结果如表 1所示 ,半边旗乙醇总提取物 PSE 及纯
化合物 5F 、6F 和 A对 HL-60细胞生长有强烈的抑制
作用 ,作用 6 h 即可明显地抑制 HL-60细胞的生长 ,作
用 24 h 的 IC50 0.13 ～ 38 μmol/L 不等(PSE 为 11.4
μg/mL),其中化合物 6F 作用最强 ,作用 72 h 的 IC50
达 90 nmol ,其次是化合物 A 、PSE 、5F。药物的细胞毒
作用与它们化学结构的差异密切相关[ 7] 。试验中还观
察到 ,半边旗各提取物在低浓度时主要使细胞生物停
滞 ,细胞形态无明显变化 ,在中间浓度时细胞呈典型的
凋亡细胞特征(另文发表),此时死细胞仍很少 ,而在高
浓度时则直接杀死细胞 ,表现为细胞肿胀 ,台盼蓝染色
阳性 。PSE 、5F 、6F 及 A 作用 HL-60 在细胞 1 h 几乎
无细胞毒作用 ,作用 24 h 的 IC50 比作用 6 h 的 IC50
小 8 、32 、7 、9倍 ,而与作用 48和 72 h 的 IC50 只相差 0
～ 2倍 。半边旗提取物对 HL-60 细胞杀伤作用的时间
效应关系很相似 ,可能是其作用机理相同或相近的缘
故 。
表 1　半边旗提取物对 HL-60
细胞的细胞毒作用(μmol/L , x±s)
药物作用
时间(h)
IC 50
PSE▲ 5F 6F A
6 97.60±7.50 NT ▲▲ 4.10±0.50 18.90±7.10
24 11.40±1.20 37.70±13.00 0.13±0.02 2.90±0.10
48 6.60±0.10 28.90± 1.50 0.12±0.01 2.10±0.10
72 4.70±0.30 23.90± 1.30 0.09±0.01 2.00±0.10
注:▲μg/mL;▲▲没有测试
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2.2　半边旗提取物对 HL-60 细胞周期的影响
结果如图 2和表 2 所示 ,半边旗各提取物作用
HL-60 细胞 24 h 后 ,细胞周期发生了明显变化 ,表现
为 S 期细胞比例升高 ,从对照组的 50%升至 70%左
右 ,G2/M 期细胞比例轻度升高(5F 例外),G0/G1 期细
胞比例明显下降 ,从对照组的 35%降至 10%左右。
各提取物对细胞周期的影响趋势较为一致 。
图 2　半边旗提取物对 HL-60 细胞周期的影响
(A:Cont rol;B:8.0 μg/mL PSE;C:48.0μmol/L 5F;D:0.12μmol/L
6F;E:3.0μmol/ L A)
表 2　半边旗提取物对 HL-60 细胞周期的影响
药物 %GO/G1 %S %G 2/M
Cont rol 38.5 50.5 14.0
8.00μg/mL PSE 12.1 67.0 20.9
48.00μmol/ L 5F 10.4 75.3 14.3
0.12μmol/ L 6F 8.4 70.0 21.7
3.00μmol/ L A 3.4 64.7 31.9
3　讨论
肿瘤的治疗正朝着日益完善的综合治疗方向迈
进 ,近十几年迅速发展的生物治疗(尤其是免疫治疗和
基因治疗)给人们带来了新的希望 。但目前化学药物
治疗(化疗)仍起着重要作用。由于化疗药物的毒副作
用及耐药性的产生 ,从天然产物中筛选新的高效低毒
抗肿瘤药仍然是当务之急 。我们课题组首次发现蕨类
植物半边旗提取物具有显著的体内外抗肿瘤作用 ,进
而从植物化学 、药物化学 、生化药理学 、毒理学等方面
对其抗肿瘤作用作了较为系统的研究 。作者从细胞周
期的角度探讨半边旗提取物抗肿瘤作用的特点和可能
机制。
根据细胞动力学效应 ,抗肿瘤药可分为细胞周期
特异性药物和细胞周期非特异性药物 ,前者指选择性
杀死细胞周期特定时相的细胞或使细胞暂时聚集在细
胞周期某个时相的药物 ,或指二种作用兼有的药物[ 8] 。
这类药物需与细胞作用较长时间才能发挥其细胞毒作
用 ,但到一定限度后再延长作用时间 ,细胞毒作用强度
变化不明显[ 9] 。本文的结果显示 ,半边旗提取物作用
细胞 1 h没有表现出明显的细胞毒作用 ,作用 6 h 后
则明显抑制细胞生长 ,作用 24 h细胞毒作用进一步增
强 ,继续延长作用时间至 48和 72 h ,细胞毒作用强度
增加的幅度很小 。这一特征提示半边旗提取物可能是
细胞周期特异性药物。流式细胞仪的结果显示 ,半边
旗各提取物作用 HL-60 细胞后 ,细胞周期发生了明显
变化 ,表现为 G0/G1 期细胞比例明显下降 ,而 S 期细
胞比例升高 ,从而证实了前面的推断 。我们先前的结
果表明[ 10] ,不同浓度的化合物 6F 对 HL-60 细胞周期
的影响与本文的结果一致 ,并呈剂量依赖关系。但半
边旗提取物究竟是选择性杀死细胞周期某个时相的细
胞或使细胞暂时聚集在某个时相 ,还是指二者兼而有
之尚需作进一步研究。本文的结果提示 ,如果半边旗
提取物在临床应用时 ,宜选择治疗生长速度快的肿瘤 ,
并与细胞周期非特异性药物(如烷化剂及抗癌抗生素
等)联合应用 ,以提高疗效 。
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收稿日期:2001-05-10
(编辑:宋丽华　　校对:边莉)
·350· 肿瘤防治杂志 2001年 8月第 8卷第 4期　　CHINA J CANCER PREV TREAT , AUG.2001 , Vol.8　No.4