全 文 ：中国药房 2008年第 19卷第 6期 China Pharm acy 2008 Vol.19 No.6 · 411·
Δ安徽省优秀青年基金资助项目(06043095)
*硕士研究生。研究方向:神经药理。电话:0551-5161133
#通讯作者:教授 ,硕士研究生导师。研究方向:神经药理。电话:
0551-5161133。E-mail:lan lzhou@yahoo.com.cn
鸡矢藤提取物对尿酸钠晶体诱导大鼠急性痛风性关节炎影响的研究 Δ
马 颖 *,颜海燕 ,刘 梅 ,周兰兰 #(安徽医科大学药理教研室 ,合肥市 230032)
中图分类号 R285.5;R965 文献标识码 A 文章编号 1001-0408(2008)06-0411-04
摘 要 目的:研究鸡矢藤提取物(EPS)对尿酸钠晶体诱导大鼠急性痛风性关节炎(GA)的影响。方法:采用尿酸钠晶体制备大鼠
GA 模型 ,用足爪容积测量仪测定造模后不同时间大鼠的踝关节肿胀度;观察造模 24 h后大鼠步态并进行行为学评分;以 HE 染色
观察大鼠关节组织的病理学改变;采用放射免疫分析法测定大鼠关节组织中白介素 1β(IL -1β)和肿瘤坏死因子α(TNF -α)的水
平 。结果:EPS 能显著降低 GA 模型大鼠的踝关节肿胀度 ,改善其步态异常。病理组织学检查结果显示 ,EPS可减轻 GA 模型大鼠
踝关节的组织水肿 , 减少关节组织炎性细胞浸润 , 以及改善滑膜增生等病理改变 。放射免疫分析检测结果显示 , EPS 可显著降低
GA 大鼠滑膜组织中 TNF -α和 IL -1β的水平 。结论:EPS 对尿酸钠晶体诱导大鼠 GA 有显著的改善作用 , 其机制可能与抑制
TNF -α和 IL-1β水平有关 。
关键词 鸡矢藤提取物;尿酸钠晶体;痛风性关节炎;白介素-1β ;肿瘤坏死因子
Effect of Extracts of Paederia Scandens on Acute Gouty Arthritis Induced by Monosodium Urate Crystals
in Rats
MA Ying , YAN Hai-yan , LIU M ei , ZHOU Lan-lan(Dept.of Pharmacology , A nhui M edical University ,
Hefei 230032 , China)
ABSTRACT OBJECTIVE:To study the e ffect o f the ex trac ts o f Paederia scandens (EPS)on acute gouty a rthr itis induced
by monosodium urate in ra ts.M ETHODS:M onosodium urate crystals w ere used to establish gouty ar thritis model in ra ts , w ith
ankle joint sswe lling degree a t different time af ter mode ling measured using paw volum e measur ing m eter and gait s of rats
sco red at 24h afte r modeling.Patho log ical changes o f ar ticular tissues o f ra ts w ere observed w ith HE staining and TNF -αand
IL-1β levels w ere monito red by Radio immunoassay.RESULTS:EPS could significantly inhibit joint sw elling o f rats and im-
prove the gaits;histopa thologically , EPS could aba te tissue sw elling of ankle joints , reduce inflamm ato ry ce ll infilt ration of
ar ticlar tissues and im prove the patholog ical changes of synovial membranes.Radiommunoassay revea led that EPS could reduce
levels o f TNF -αand IL -1β in ra tssynov ial mem branes.CONCLUSION :EPS have remarkable efficacy in improving
symptoms of acute gouty ar thritis induced by m onosodium urate crystals in ra ts , w hich might be re la ted to its inhibition on
levels of IL-1β and TNF -α.
KEY WORDS Ext racts of Paederia scandens;Sodium ura te crystal;Gouty ar thritis;Interleukin-1β ;TNF -α
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(收稿日期:2007-05-10 修回日期:2007-10-20)
痛风性关节炎(Gouty ar thritis ,GA)是由于嘌呤代谢障碍
引起的血尿酸浓度过高而导致尿酸盐结晶沉积于关节所致的
一种代谢性骨关节疾病 。尿酸钠 (Monosodium urate m ono-
hydrate , MSU)晶体已被证实为 GA 的非微生物性病原体 , 由
MSU 晶体刺激诱导的免疫性炎症在 GA 的发病中起着重要的
作用[ 1 ]。
鸡矢藤提取物(Extracts o f Paeder ia scandens , EPS)是从
茜草科鸡矢藤属植物中提取的一类有效成分 , 其主要活性成分
为鸡矢藤苷 、鸡矢藤次苷 、车叶草苷 、r-谷甾醇及挥发油等 ,临
床用于风湿筋骨痛 、腹泻痢疾 、跌打损伤等症的治疗 ,有显著疗
效 。笔者采用MSU 晶体诱导制备大鼠急性 GA 模型 , 观察
EPS 对 GA 的防治作用 , 并进一步研究 EPS 对模型大鼠关节
滑膜组织的肿瘤坏死因子α(TNF -α)和白介素 1β(IL -1β)的
影响 ,以深入探讨其作用机制 。
1 材料
1.1 仪器
YLS-TA 型足爪容积测量仪 (山东省医学科学院设备
站);GC-911γ型放免免疫计数器(中国科学技术大学科技实
业总公司中佳光电仪器分公司)。
1.2 试药
· 412· China Pharmacy 2008 Vol.19 No.6 中国药房 2008年第 19卷第 6期
表 1 EPS对MSU晶体诱导大鼠急性GA关节肿胀度的影响(x ±s , n=10)
Tab 1 Effect of EPS on joint swelling in rats with acute gout arthritis induced by MSU(x ±s , n=10)
组别 剂量/m g· kg- 1
踝关节容积/m L
0 h 1 h 2 h 4 h 6 h 8 h 12 h 16 h 24 h 48 h
空白对照组 - 1.434±0.048 1.501±0.100 1.469±0.056 1.515±0.096 1.489±0.095 1.505±0.078 1.424±0.063 1.453±0.074 1.54±0.044 1.475±0.025
模型组 - 1.455±0.055 1.545±0.057 2.070±0.088* 2.062±0.154* 2.429±0.289* 2.594±0.354* 2.728±0.389* 2.905±0.292* 2.442±0.365* 2.050±0.165*
NAP组 25 1.474±0.125 1.576±0.085 1.682±0.069# # 2.027±0.114 2.157±0.165# # 1.973±0.092# # 2.199±0.104# # 2.348±0.119# # 1.984±0.122# # 1.768±0.122# #
EPS高剂量组 4 500 1.443±0.087 1.465±0.102 1.818±0.093# # 2.071±0.120 2.182±0.113# # 2.251±0.116# 2.326±0.069# # 2.442±0.062# # 2.100±0.059# # 1.859±0.253# #
EPS中剂量组 2 250 1.454±0.125 1.576±0.072 1.943±0.155 1.770±0.067 1.851±0.096# 2.299±0.068# 2.400±0.087# 2.539±0.141# 2.155±0.117# 1.994±0.092
EPS低剂量组 1 125 1.446±0.060 1.616±0.095 1.949±0.052 1.972±0.074 2.131±0.051 2.264±0.058 2.443±0.143 2.715±0.101 2.194±0.092 1.945±0.049
与空白对照组比较:*P<0.05;与模型组比较:#P<0.05 , ##P<0.01
v s.control group , *P<0.05;vs.model group , #P<0.05 , ##P<0.01
节肿胀度均显著增加(P <0.05), 制备模型后 2 h , 模型组大
鼠关节开始显著肿胀 ,随后急剧增加 , 16 h达峰 。与模型组比
较 , EPS 大剂量组及 NAP 组大鼠在造模后 2 、6 、8 、12 、16 、
24 、48 h 关节肿胀度均显著降低(P <0.01);EPS 中剂量组
在造模后 6 、8 、12、16 、24 h关节肿胀度也显著降低(P<0.05)。
M SU 晶体诱导大鼠痛风性关节炎关节肿胀度的动态变化见
图1。
3.3 EPS对MSU晶体诱导大鼠急性 GA行为学的影响
EPS(安徽医科大学药理学教研室自制);萘普生(Napro_
xen , NAP)胶囊(合肥久联制药有限公司 ,批号:20070128 , 每
粒 25mg), 临用前均用蒸馏水溶解至所需浓度 。MSU(美国
Sigma 公司 , 批号:120k 5305);IL -1β 、TNF -α试剂盒(北京
北方生物技术研究所 ,批号均为:20070528 , );考马斯亮蓝蛋白
质测定试剂盒(南京建成生物工程研究所 ,批号:20070314);鲎
试剂检测盒(上海伊华医学科技有限公司 ,批号:20050402)。
1.3 动物
SD普通级大鼠 , 85只 , ♂, 体重 180 ～ 200g , 由安徽医科
大学实验动物中心提供(动物许可证号:皖医实动(准)01)。
2 方法
2.1 MSU晶体溶液的配制
参照文献 [2 , 3 ] , 将 5 mL 1 mol ·L -1的 NaOH 和 800 mg
MSU 加入 155 mL 蒸馏水中煮沸 ,待MSU 完全溶解后 ,滴入1
mol ·L -1HCl调 pH值至 7.2 , 溶液呈现乳白色后 , 立即 3 000
r ·min -1离心 2 min , 将上清液反复离心至晶体不再析出 , 再
将上清液置 4 ℃冷却 1 h 后离心 ,收集晶体于 Ep 管中 , 4 ℃保
存 。使用前 180 ℃灭菌 2 h ,用无菌磷酸缓冲液(PBS)配制成 20
mg ·mL -1溶液 , 并通过超声破碎处理 , 备用 。上述配制的
MSU 晶体悬液的内毒素<0.062 5 EU ·mL -1。
2.2 实验分组与给药
85只大鼠正常饲养 1周后随机分组如下:空白对照(生理
盐水)、模型、NAP(25 mg ·kg -1)及 EPS高 、中 、低剂量(剂量
分别为 4 500 、2 250 、1 125 mg ·kg -1)组 。模型组 35只(按造
模后不同时间点又分 6小组)。其余各组每组 10只 , 各组分别
ig 相应药物 ,每天 1次 ,连续 9 d 。第 7天 ig 药物后 1 h ,制备模
型 。
2.3 模型的制备
按 Coder re [4 ]经典方法 ,将大鼠行麻醉(10%水合氯醛 0.3
mL ·100g -1 , ip )后仰卧固定 , 将左踝关节弯曲 , 扪及两骨突
起 ,局部消毒后 ,用 6号注射针自两骨突之间进针 ,感觉有脱空
感后 , 注入M SU 溶液 50μL , 以关节囊对侧鼓起为注入标准 ,
制备急性 GA 模型 。空白对照组左踝关节及模型组对侧踝关节
注射等体积的 PBS 。
2.4 指标的测定
2.4.1 大鼠行为学评分:造模 24 h 后按 Coder re [4 ]等方法观
察大鼠步态 。评分标准:0分为正常步态 ,双足均匀着地;1分为
轻度跛行 , 受试下肢略有弯曲;2分为中度跛行 , 受试下肢刚触
及地面;3分为重度跛行 ,受试下肢离开地面 ,三足着地行走 。
2.4.2 关节肿胀度测定:各组分别于造模前及造模后 1 、2 、4 、
6 、8 、12 、16 、24 、48 h测定踝关节容积 ,以造模后与造模前关节
容积差值作为关节肿胀度 。
2.4.3 大鼠关节病理改变的观察:造模 48 h 后处死各组大
鼠 , 分别取其踝关节于 10%中性福尔马林溶液固定 , 10%乙二
胺四乙酸脱钙 , 常规脱水 、透明 、包埋 、切片和苏木素-伊红
(HE)染色 。光镜下观察局部病理组织学变化 。
2.4.4 关节及周围软组织 IL -1β及 TNF -α的测定:按照
文献 [ 5 ]分别于造模后 0 、2 、6 、16 、24 h 处死模型组大鼠 ,每个时
间点处死大鼠 5只;造模 48 h 后处死其余各组大鼠 。以踝关节
为中心上下 0.5 cm处剪断 ,取下受试关节及周围软组织 ,在冰
盘上切开踝关节囊 , 快速切取关节囊 、滑膜等组织 , 称重 , 按
1∶5比例加生理盐水稀释 , 4 ℃匀浆 , 4 000 r ·min -1离心
5min ,取上清液 ,分装于 Ep 管中 ,于—80 ℃冰箱保存 ,待测 。用
放射免疫分析法测定 IL -1β 、TNF -α含量 , 具体操作步骤按
试剂盒说明书进行 。
2.4.5 组织总蛋白的测定:采用考马斯亮蓝法测定组织蛋白
含量 ,具体操作步骤按试剂盒说明书进行 。
2.5 统计学方法
采用 SPSS13.0统计软件 。计量资料数据以x ±s表示 。大
鼠足爪肿胀度采用重复测量方差分析 , 滑膜组织 IL -1β 、
TN F-α含量采用单因素方差分析 , 多重两两比较采用 LSD
或 SNK 检验 , 方差不齐者采用 Dunnet T3法检验;等级资料
以例数表示 ,采用 Kruskal-w allis非参检验法 。
3 结果
3.1 一般状态观察
在实验过程中 , EPS高 、中 、低剂量组及空白对照组大鼠皮
毛白而润泽 , 活动自如 , 反应灵敏 , 饮食及尿便正常;模型组精
神 、饮食尚可 ,体毛稍欠光泽 ,大便正常;NAP 阳性对照组则逐
渐出现体毛欠光泽 ,精神欠佳 ,懒动 ,食量减少 ,大便稀溏 。
3.2 EPS对MSU晶体诱导大鼠急性GA关节肿胀度的影响
结果显示 , 除空白对照组外 , 所有组别大鼠的关节肿胀度
在各自组内造模前后不同时间均有显著差异(P <0.01)。EPS
对 MSU 晶体诱导大鼠急性 GA 关节肿胀度的影响详见表 1。
与空白对照组比较 , 模型组大鼠造模后不同时间点大鼠关
中国药房 2008年第 19卷第 6期 China Pharm acy 2008 Vol.19 No.6 · 413·
表 3 MSU晶体诱导大鼠急性GA48 h后关节组织中 TNF-
α和 IL-1β水平的影响(x ±s , n=5)
Tab 3 Dynamic changes of levels of TNF-αand IL-1β
in ankle synovium in rats with acute gout arthrit is induced
by MSU (x ±s , n=5)
组别 剂量/mg ·kg- 1 TNF -α/fmol ·mg- 1 IL-1β/pg ·mg- 1
空白对照组 - 0.052±0.019 0.439±0.125
模型组 - 0.672±0.247* 8.738±2.812*
NAP组 25 0.283±0.158# 4.905±2.053#
EPS高剂量组 4 500 0.369±0.142# 5.251±2.04#
EPS中剂量组 2 250 0.398±0.171# 5.962±1.687#
EPS低剂量组 1 125 0.464±0.150 7.242±2.401
与空白对照组比较:*P<0.01;与模型组比较:#P<0.05
vs.con trol group:*P<0.01;vs.model group:#P<0.05
表 2 EPS对急性GA模型大鼠行为学的影响(x ±s , n=8)
Tab 2 Effect of EPS on gaits of rats with acute gout
arthritis(x ±s , n=8)
组别 剂量/mg ·kg- 1 24 h步态评分
0分 1分 2分 3分
空白对照组 - 8 0 0 0
模型组 - 0 0 3 5
NAP组 25 0 4 4 0
EPS高剂量组 4 500 0 4 3 1
EPS中剂量组 2 250 0 3 4 1
EPS低剂量组 1 125 0 1 3 4
与空白对照组比较 , 模型组大鼠造模后活动减少 , 左后肢
弯曲 ,行走时出现不同程度的跛行 ,行为学评分显著升高 ,具有显
著性差异(P<0.05)。与模型组比较 , EPS高 、中剂量组及 NAP
组大鼠活动状态显著得到改善 ,评分显著降低(P <0.05)。EPS
对急性GA 模型大鼠行为学的影响详见表 2。
3.4 EPS对MSU晶体诱导大鼠急性GA滑膜组织病理学的
影响
病理学观察结果显示 , 空白对照组大鼠关节滑膜及周围组
织正常 ,无炎性细胞浸润;模型组大鼠关节炎症较显著 ,表面充
血水肿 ,可见大量的炎性细胞浸润 ,滑膜呈现增生样改变;EPS
各剂量组和 NAP 组关节炎症均不同程度的减轻 , 周围软组织
充血不显著 ,见少量炎性细胞浸润 ,滑膜略有增生样改变 。
3.5 EPS对MSU晶体诱导大鼠急性GA关节组织 TNF-α
和 IL-1β水平的影响
模型组受试关节与对侧关节比较 , 受试关节组织中
TNF -α和 IL -1β水平于注射MSU 晶体 2 h后开始增加 , 6
h达高峰 ,然后呈下降趋势 。M SU 晶体诱导大鼠痛风性关节炎
关节组织中 TNF -α和 IL-1β水平的动态变化见图 2。
与空白对照组比较 , 注射MSU 晶体 48h后 , 模型组大鼠
关节滑膜组织中 TNF -α和 IL -1β水平显著增高 , 差异有显
著性(P<0.01)。与模型组比较 , EPS 高 、中剂量组及 NAP 组
大鼠关节滑膜组织 IL -1β和 TNF-α水平均显著降低 , 差异
有显著性(P <0.05)。EPS对MSU 晶体诱导大鼠急性 GA48 h
后关节组织中 TNF-α和 IL-1β水平的影响详见表 3。
4 讨论
20世纪 60年代即有成功应用M SU 晶体制备急性 GA 模
型的报道 ,其模型特点与临床 GA 表现极为相似 。经Mc Car ty [6 ]
改进后 ,现已成为被普遍采用的急性 GA 的经典造模方法 ,该法
简单 、快速 ,成功率高 。实验中 ,大鼠关节注射M SU 致炎后 ,关
节出现显著的肿胀 , 步态也呈现显著异常 , 病理组织学观察结果
显示大鼠关节表面充血水肿 , 可见大量的炎性细胞浸润和滑膜
增生 。上述结果说明 ,本实验 GA 模型的制备是成功的 。
实验结果同时显示 , EPS 4 500 、2 250 mg ·kg -1可不同程
度降低大鼠踝关节的肿胀度 , 改善大鼠造模后的步态异常 , 减少
大鼠踝关节的组织水肿 ,减少炎性细胞浸润 , 减轻滑膜增生等病
理改变 。上述结果说明 , EPS能够改善MSU 晶体诱导的急性
GA 大鼠的关节炎症状 ,具有一定防治GA 发生的作用 。
研究发现 , 免疫活性因子 TNF -α和 IL-1β [7 ]在GA 的发
病过程中起着非常重要的作用 。一般认为 ,中性粒细胞-内皮细
胞粘连是急性痛风产生的本质 , 而 T NF-α和 IL -1β [9 ]可上调
内皮细胞 E-选择素活性及增加中性粒细胞的募集 , 活化的中
性粒细胞与内皮细胞表面黏附分子黏附 , 进而向关节部位浸润 ,
释放炎性介质 ,引起 GA 关节局部炎症反应的发生 。Chen CJ [10 ]
等认为 , TNF -α和 IL -1β两因子作为炎症的启动因子 , 通过
与滑膜细胞上 IL -1受体相互作用 ,激活结头蛋白MyD88 ,继
· 414· China Pharmacy 2008 Vol.19 No.6 中国药房 2008年第 19卷第 6期
而启动 NF-κB触发继发性的炎性细胞因子转录 ,加重关节损
伤 。提示降低GA 关节组织中 TNF -α、IL -1β水平 ,终止炎性
细胞因子的恶性循环 ,是有效治疗 GA 的作用环节之一 。
TNF-α和 IL-1β在 GA 发病的进程中 , 相互作用 , 协同
促进 GA的发生和发展。研究认为 , TNF-α是前炎症网链中一
级细胞因子 , IL-1β是由 TNF-α等诱导的二级前炎症细胞因
子 ,并能提高 TNF-α活性。在M SU 晶体体外诱导人单核细胞
实验中[ 3 ] 发现 , 单独使用抗 TNF -α单克隆抗体或抗 IL -1β
单克隆抗体都不能阻断 E -选择素活性 , 而联合使用抗
TNF -α单克隆抗体和抗 IL -1β单克隆抗体可完全阻断 E-
选择素活性 。提示 TNF -α与 IL -1β之间可能存在反馈机制 ,
二者相互作用 , 共同参与内皮细胞的激活和炎性细胞在体内的
募集而加重炎性损伤 。
本实验结果显示 , 模型组大鼠滑膜组织的 T NF -α和
IL-1β水平显著高于空白对照组 , 于 2 h开始增加 , 6 h达高
峰 ,然后呈下降趋势 。这与国外文献报道一致 ,提示 TNF-α和
IL-1β水平的升高与 GA 的发病关系密切 , 说明免疫机制参与
急性 GA 的关节组织损伤 。实验中 , 剂量为 4 500 、 2 250 mg ·
kg
-1的 EPS 可降低 GA 大鼠滑膜组织 TNF -α、 IL-1β水平 ,
对关节病理损伤也具有一定的改善作用 。提示 EPS 对急性 GA
的保护作用可能与其抑制关节滑膜组织中的 TNF -α和IL-1β
的生成有关。但其具体的机制还有待进一步深入研究 。
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(收稿日期:2007-05-11 修回日期:2007-10-20)
本刊讯 为确保 2008年春节和全国 “两会”期间的安全 ,
卫生部副部长陈啸宏 2008年 2月 1日带队检查了北京协和医
院和中国疾病预防控制中心的安全生产工作 。
陈啸宏首先视察了在建中的协和医院干部医疗保健基地 ,
并听取了施工方的情况介绍 。他要求协和医院配合施工方认真
落实安全生产的各项规定;做好施工工人的安全生产宣传教育
工作 ,做到文明施工;加强医院与工地的安保联动 ,预防节日期
间可能出现的安全问题;注意工地食堂的餐饮卫生 。
陈啸宏对协和医院加强氧气储存罐安全防护的措施表示
肯定 。他强调 , 像协和医院这样地处重要商业繁华地区的医疗
机构 , 安全保障工作关系到周边众多机构和人民群众的生命财
产安全 , 各单位负责人要亲自参与 , 及时发现生产中的安全隐
患 ,认真整改 ,确保安全生产责任落到实处 。
在视察中国疾病预防控制中心时 , 陈啸宏听取了中心关于
安全保卫工作和实验室管理有关工作的汇报 。陈啸宏对中心所
做的工作表示赞赏 。他要求中心各下属单位在节前开展安全自
查和互查 , 确保各实验室的安全运行 , 为可能出现的突发公共
卫生事件的应对做好积极准备 。
卫生部副部长陈啸宏带队检查卫生部直属单位安全生产工作