全 文 ：半边旗提取物 5F对人高转移卵巢癌细胞 HO-8910PM
ETS-1mRNA和 VEGF蛋白表达的影响
何太平1　莫丽儿2　梁念慈 1
(1.广东医学院生物化学与分子生物学研究所 ,广东湛江 524023;2.广东天然药物研究与开发重点实验
室 ,广东湛江 524023)
　　摘要　目的:研究半边旗提取物 5F(以下简称 5F)对 HO-8910PM 细胞内 VEGF蛋白及 ETS-1mRNA表达的影
响 , 探讨其抗肿瘤侵袭转移的作用机制。方法:RT-PCR分析 ETS-1mRNA的表达;W este rn b lo t分析 VEGF蛋白的表
达。结果:25 ～ 100μm o l /L 5F作用 HO-8910PM 细胞 24 h后 , 明显下调 ETS-1mRNA的表达;5F明显下调 VEGF蛋
白表达水平。结论:5F抗肿瘤侵袭转移能力与 ETS-1mRNA和 VEGF蛋白的表达有关。
关键词　半边旗提取物 5F;基因表达;肿瘤药物治疗;卵巢癌
　　半边旗 (P teri sem ipinna ta L. , PsL)又名半边莲 、
半边菊 ,属凤尾蕨科植物 ,广泛分布于南方各省 ,民
间常用于清热解毒 、利水消肿 、治疗疳积 、风湿痛等 。
半边旗有效成分 5F(以下简称 5F)是从半边旗中提
取的一种二萜类化合物 ,其化学名为 11α-羟基-15-
氧-16-烯-ent-贝克杉烷-19酸 ,分子式为 C20H28O4 ,
分子量为 332.4。 5F经我们课题组发现具有明显的
抗肿瘤活性 ,能抑制 RB磷酸化 ,增强 K562细胞
MAPK的活性及表达〔1〕 ,并影响 K562细胞中 bcl-2、
bax、c-jun、c-fos癌基因的表达 〔2〕。本文分别用 RT-
PCR方法 、蛋白印迹法研究 5F对 ETS-1mRNA表达
以及 VEGF蛋白表达的影响 ,探讨 5F抗高转移卵巢
癌细胞 HO-8910PM侵袭转移的作用机制 。
1 　材料
1.1 　实验材料 　人高转移卵巢癌细胞 (HO-
8910PM)购自上海细胞生物所 ,是由浙江省肿瘤研
究所许沈华〔3〕等建立。细胞在含 10%小牛血清 、
100U /m l青霉素和 100 μg /m l链霉素的 RPM I-1640
完全培养基中 , 37℃、5%CO2 饱和湿度孵箱培养 。
细胞经过消化传代 ,取对数生长期的细胞进行培养 。
1.2 　药品与试剂　超级小牛血清购自杭州四季青
公司;RPM I-1640培养基购自 G ibco公司;4×上样
缓冲液 (125 mmo l /L Tris-HC l, pH6.8, 4%SDS, 10%
β-巯基乙醇 , 20%甘油 , 0.04溴酚蓝 );VEGF小鼠
IgG单抗 、β-A ctin山羊 IgG多抗购自 San ta C ruz公
司 ,使用时用 TBST溶液按 1∶200 ～ 1∶2000稀释;辣
根过氧化物酶标记山羊抗小鼠 IgG、辣根过氧化物
酶标记马抗山羊 IgG购自北京中山公司 ,使用时用
TBST溶液按 1∶4000 ～ 1∶10000稀释:RT-PCR试剂
盒购自 Q iagene公司;100 bp DNA marker购自华美
生物工程公司;半边旗提取物 5F由广东医学院天然
药物开发中心提供 ,实验前 5F用 DMSO溶解 ,培养
液稀释 , DMSO终浓度为 0.1%(实验证明该浓度对
细胞无影响)。
2　方法
2.1　半定量 RT-PCR检测 ETS-1 mRNA的表达　
(1)总 RNA的提取:分别收集以 PBS、0.1%DMSO
和 25、50、100 μmo l /L 5F处理 24 h的 HO-8910PM
细胞 ,按 Trizo l试剂盒说明提取总 RNA。 (2)引物
设计与合成:ETS-1引物设计参照文献 〔4〕 ,引物序列
为:sense primer:5’ -GTTAATGGAGTCAACCCAGC-
3’ (nt702-721), antisense prime r:5’ -GGGTAGCG-
ACTTCTTGTTTG-3’ (n t 956-975),扩增产物长度为
274 bp。以 GADPH 为内参照 , 引物序列为:sense
primer:5’ -ACCACAGTCCATGCCATCAC-3’ (nt 629-
648), an tisense p rime r:5’ -TCCACCACCCTGTTGCT-
GTA-3’ ,扩增产物长度为 452 bp。引物均委托上海
生工生物工程公司合成 。 (3)扩增条件:50℃逆转
录 30 m in, 95℃预变性 15m in,循环 35次(94℃30s,
50℃ 1m in, 72℃ 1m in),再 72℃充分延伸 10 m in。
取 5μl PCR产物加 1μl6×上样缓冲液混匀 , 1.8%
琼脂糖凝胶(含 0.5μg /m l溴化乙锭)在 100 V恒压
电泳约 40 m in,紫外透射仪观察结果并拍照。相片
经扫描仪扫描后 ,用图像分析软件 S cion Image进行
光密度积分值分析 , 计算出 ETS-1分别与内参照
GAPDH的光密度积分值之比作为 ETS-1的相对含
量值 。
2.2　W este rn b lot分析 VEGF蛋白表达　取对数生
长期的 HO-8910PM细胞 ,稀释成 1×106 /m l,接种于
50mm的培养皿中培养 ,每皿 5m l。待细胞贴壁后 ,
分别用 PBS、0.1%DMSO和 25、50、100 μmol /L 5F
处理 HO-8910PM细胞 24 h,收集细胞 , PBS洗涤 2
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DOI牶牨牥牣牨牫牳牰牫牤j牣issn牨牥牥牨牠牬牬牭牬牣牪牥牥牭牣牥牬牣牥牪牨
次 ,加入预冷的细胞裂解液 100μl,用细胞刮将细胞
刮下 ,并转移至预冷的 1.5 m l离心管中 ,置于碎冰
上冰浴 20m in后 ,于 4℃, 12000×g离心 15m in。上
清液转移至另一 1.5m l离心管中 ,参照考马斯亮蓝
微盘比色法 〔5〕测定蛋白质含量 。蛋白样品和 4×上
样缓冲液按 3∶1的比例混合 , 100℃水中煮沸 5 m in
使蛋白质变性。Weste rn blo t实验方法参考《分子克
隆实验指南》, SDS-PAGE电泳后电转移至 PVPF膜
上 , 5%脱脂牛奶封闭后加入第一抗体于室温孵育 2
h,用 TBS缓冲液洗涤 3次 ,每次 10m in,加入第二抗
体于室温孵育 2 h,再用 TBS缓冲液洗涤 3次 ,每次
10 m in,加入发光试剂 (ECL)显色 ,以 β-actin作内
参 ,用图像分析软件 Scion Image进行光密度积分值
分析。
2.3 　统计处理　采用 SPSS11.0统计软件包 One-
W ay Anova与 Bon-ferroni(方差齐)或 Tamhane’ s T2
(方差不齐)检验进行统计学处理 。
3 　结果
3.1 　5F作用 HO-8910PM 细胞 24 h后对 ETS-1
mRNA表达的影响 　分别用 PBS、0.1%DMSO和
25、50、100 μmo l /L 5F处理 HO-8910PM细胞 24 h
后 ,用 RT-PCR的方法检测 ETS-1mRNA表达情况 ,
图象经 S cion Image软件进行光密度分析 , 结果显
示:5F 处理 HO-8910PM 细胞 24 h后 , 与内参照
GADPH比较 , 5F使 ETS-1mRNA的表达明显减少 ,
见图 1。
图 1　5F作用 24 h后对 ETS-1mRNA表达的影响
M:M arke r;Lane 1:Contro l;Lane 2:0.1%DM SO;Lane 3:25
μmo l /L;Lane 4:50 μm o l /L;Lane 5:100μm ol /L
图 2　5F作用 HO-8910PM 细胞 24 h后对
VEGF和 β-A ctin蛋白表达的影响
Lane 1:Con tro l;Lane 2:0. 1%DMSO;Lane 3:25 μm o l /L;Lane
4:50 μm o l /L;Lane 5:100 μm o l /L
3.2　5F作用 HO-8910PM细胞 24 h后对 VEGF蛋
白表达的影响　分别用 PBS、0.1%DMSO和 25、50、
100 μmo l /L 5F处理 HO-8910PM细胞 24 h后 ,W est-
e rn blo t分析目的蛋白的表达。结果发现 , 5F能够
抑制细胞 VEGF蛋白的表达 ,见图 2。
4　讨论
癌基因 ETS最早是在美国马里兰的 Frederick
国家癌症研究所分子肿瘤学实验室里通过研究禽类
逆转录病毒 E26时被发现的 。此后 ,一系列细胞
ETS基因被相继发现 ,这些 ETS序列与 E26都拥有
高度保守的同源序列 ,并决定着基因结构和识别开
放阅读框及编码的蛋白 。因此 ,根据 E26(E Twenty
Six的英文缩写 )而将该基因命名为 ETS。癌基因
ETS家族在肿瘤发生发展过程中起着重要作用 ,特
别是它作为转录因子在肿瘤转移中的调控作用。研
究表明癌基因 ETS影响蛋白水解酶的表达以及肿
瘤的血管生成 。 ETS-1是研究较多的 ETS家族成
员 ,作为转录因子在细胞侵袭运动 、血管生成和细胞
凋亡等中发挥重要作用 。通常 ETS-1在血管内皮细
胞中表达 ,在血管生成的起始和生成阶段 ,可作为一
个直接的血管生成调控物调控血管生成 〔6〕。 Khatun
S
〔7〕等的研究表明 ,在卵巢癌血管生成的过程中 ,
ETS-1在血管内皮细胞 、肿瘤间质细胞和癌细胞中
有高表达 ,并作为原前癌基因在卵巢癌的血管生成
中起着重要的调节作用 。一旦血管生成 , ETS-1的
表达就立即下调 ,而 VEGF和 bFGF在血管生成的
早期能诱导 ETS-1的表达 ,抑制 ETS-1的表达能阻
断血管生成。 uPA , MMP1, 3, 9均能与 ETS-1核心序
列结合 , ETS-1能诱导 uPA ,MMP1, 3 , 9基因的表达 ,
从而使血管内皮细胞向血管生成表型转变 。VEGF、
bFGF和肝细胞生长因子 (HGF)作为内皮细胞的特
异性有丝分裂原 ,具有促进肿瘤血管生成的功能 ,在
肿瘤的生长和转移过程中起着重要的调控作用 ,与
肿瘤的复发和预后紧密相关 。其中 VEGF可以增加
组织因子的产生 ,激活凝血酶原和基质金属蛋白酶-
2(MMP-2),诱导尿激酶型纤溶酶原激活剂(uPA),
组织型纤溶酶原激活剂 ( tPA), Ⅰ型纤维酶原激活
物的抑制因子 (即血浆酶原激活剂的抑制剂 PA I-I
和基质胶原酶 )的基因以及细胞粘附分子的表达 ,
促使细胞外基质 (ECM )的降解 , 使血管通透性增
加 ,血浆蛋白外渗和血管外基底膜纤维素沉积 ,为肿
瘤细胞的生长和新生毛细血管网的建立提供最佳基
质。研究表明 VEGF通过抑制树突细胞的成熟 ,逃
离机体对肿瘤细胞正常的免疫应答 , VEGF还能阻
止不成熟内皮细胞的凋亡 ,促使内皮细胞的分裂 、增
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殖 、迁移 ,形成新的血管 ,因此 VEGF在肿瘤的生长
和转移中起重要作用 ,抑制 VEGF信号转导通路的
任何一个环节 ,就可防止肿瘤的进展与转移 。至于
ETS-1在血管生成信号通路中的具体位置 ,目前的
报道十分紊乱。 Kha tun S等的研究表明 VEGF能诱
导 ETS-1的表达 ,且 VEGF位于 ETS-1的上游 ,而
Hash iya N
〔9〕的研究结果与 Kha tun S等的研究结果
相反 ,通过体内实验证明 ETS-1位于血管生成级联
的上游 ,能诱导 VEGF的表达 ,并通过自循环的方式
反馈调节血管生成。
目前 ,临床大多数抗肿瘤血管生成药品只是短
暂性抑制血管生成因子的表达 ,从而暂时阻断肿瘤
生长和血管生成 ,并引起肿瘤的二次扩散 〔8〕。本研
究结果表明 , 5F作用高转移卵巢癌细胞 24 h后能
同时抑制 VEGF蛋白和 ETs-1mRNA的表达 ,从而可
以抑制与 ETS-1相关联的血管生成替代途径的激
活 ,比单纯的抑制血管形成因子的表达来控制血管
生成的方法有效 ,因此 5F有希望成为一种有效的抗
肿瘤侵袭转移和血管生成的药物。
基金项目:国家自然科学基金资助课题 , No 39870900;湛江市
988科技兴湛计划项目
参 考 文 献
1　王京滨 , 等 .半边旗中提取物 5F对 K562细胞 MAPK活
性 、表达的影响 .中国药理学通报 , 2002, 18(3)∶294
2　王京滨 ,等 .半边旗中提取物 5F对 K562细胞几种癌基
因表达的影响 .中国药理学通报 , 2002, 18(4)∶418
3　许沈华 ,等 .高转移人卵巢癌细胞系 HO-8910PM的建立
及其生物学特性 .中华病理学杂志 , 1998, 27(6)∶451
4　Ozaki I, e t a l. Invo lvem en t of the E ts-1 gene in overexp res-
sion o f m atrily sin in hum an hepatocellu la r carcino-
ma.Cance rRes, 2000, 60(22)∶6519
5　王多宁 ,等 .考马斯亮蓝微盘比色法测定蛋白质含量 .
第四军医大学学报 , 2001, 22(6)∶528
6　Teruyam a K, e t a l.Ro le of transcription factor E ts-1 in the
apoptosis o f hum an vascular endo the lial ce lls. J C ell Phy si-
o l, 2001, 188(2)∶243
7　Kha tun S, et a l.C linica l im plica tions o f expression o f ETs-1
in re lation to ang iogenesis in ova rian cancers.Cance r Sci,
2003, 94(9)∶769
8 P rager GW , e t a l. V ascu lar endo thelial grow th fac to r
(VEGF) induces rapid prourokinase (pro-uPA) activa tion
on the surface o f endothe lia l ce lls. B lood, 2004, 103(3)∶
955
9　H ashiya N, et a l. In v ivo ev idence of ang iogenesis induced
by transc rip tion factor E ts-1∶E ts-1 is loca ted upstream of
angiogenesis cascade.C ircu la tion, 2004, 109(24)∶3035
(2004 - 11 -05收稿)
Effects of5F from P teri sem ipinnata on the Expression ofETS-1mRNA and VEGF
Protein ofH ighlyM etastatic Ovar ian Carc inoma HO-8910PM Cells
H e Ta iping1 , Mo L ier2 , Liang N ianc i1
(1. Institu te o f B io chem istry andM o lecular B io logy, GuangdongM edical Co llege, Zhanjiang 524023;2.Guangdong Key Laboratory fo r
Re search and Deve lopm ent of Na tural D rug s, Zhan jiang 524023)
Abstrac t　Objec tive:To study the effec t o f 5F from Pteri sem ipinnata L on the expression o fETS-1mRNA and VEGF pro te in, and
to investig ate the antitumo rmechanism s o f 5F from P teri sem ipinnata L.M ethods:RT-PCR assay was used to asse ss the expression leve l
o fETS-1 mRNA.The expression leve l o fVEGF pro te in wa s a ssessed byW este rn b lo t analy sis.Resu lts:The expression leve l o f o fVEGF
prote in obv iously decreased in HO-8910PM cells trea ted w ith 25 ～ 100μmo l /L 5F for 24 hours. 5F significan tly down-regu la ted the ex-
pression o fETS-1mRNA.Conclusion:The antitum or activ ity of 5F from P teri sem ipinnata L is invo lved in the expression o fETS-1 mR-
NA and VEGF pro tein.
K ey words　5F from P teri sem ipinnata L;Gene exp ression;Tumo r /pharm aco the rapy;Ova rian carcinom a
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