全 文 ：饮片进行直观比较。已有文献报道石膏、冰硼散
等［12-13］中药及中成药的 X 衍射指纹图谱研究，在
X射线衍射法上使用相似度评价系统，可以比较直
观地看出差异，可有效应用于矿物药雄黄的鉴别及
质量控制。但由于 X 射线衍射指纹图谱采用的判
定指标与色谱指纹图谱常用的保留时间、峰面积、
峰高参数等有一定差异，如何在 X 射线衍射法上
更有效地应用相似度评价系统评价药材质量仍需深
入研究。
参考文献:
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狗脊炮制品中促进成骨细胞增殖分化成分的筛选
于海涛1， 李 慧1， 章 琦1， 鞠成国1， 贾天柱1，2，3*
(1. 辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600;2. 辽宁省中药炮制工程技术研究中心，辽宁 大连
116600;3. 国家中医药管理局重点研究室，辽宁 大连 116600)
收稿日期:2011-11-16
基金项目:国家自然科学基金 (30973938)
作者简介:于海涛，硕士生，从事中药炮制学研究。Tel: (0411)87586115
* 通信作者:贾天柱，教授，博士生导师，从事中药炮制原理研究。Tel: (0411)87586499，E-mail:jiatz@ lnutcm. edu. cn
摘要:目的 筛选狗脊炮制品正丁醇萃取物中促进成骨细胞增殖及碱性磷酸酶活性的组分;探索狗脊抗骨质疏松的机
理及具体有效组分。方法 将狗脊炮制品正丁醇萃取物的三氯甲烷-甲醇洗脱部分与成骨细胞共同培养，以 MTT 法检
测细胞的增殖，用碱性磷酸酶试剂盒测定培养液中 AKP 酶活性。结果 通过各组分与细胞共同培养，其中极性偏大
的组分对细胞增殖作用较强，尤以三氯甲烷 －甲醇 3∶ 1组和 3∶ 1-D组作用最强，且促进 AKP活性也最强。结论 能够
显著促进成骨细胞增殖及 AKP酶活性的有效成分可能存在于极性较大的 3∶ 1-D 组中，并且推测可能通过促进成骨细
胞增殖及分化的机理来发挥抗骨质疏松作用。
关键词:狗脊;成骨细胞;骨质疏松;MTT;碱性磷酸酶
中图分类号:R283，R285. 5 文献标志码:A 文章编号:1001-1528(2012)06-1139-04
Effective constituents screening of promoting osteoblastic differentiation from
processed Cibotii Rhizoma
YU Hai-tao1， LI Hui1， ZHANG Qi1， JU Cheng-guo1， JIA Tian-zhu1，2，3*
(1. Liaoning University of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China;2. Liaoning Provincial Research Center of Traditional Chinese Medicine
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Chinese Traditional Patent Medicine
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Vol. 34 No. 6
Processing Technology，Dalian 116600，China;3. The Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China)
KEY WORDS:Cibotium barometz;osteoblasts;osteoporosis;MTT;AKP
狗脊为蚌壳蕨科植物金毛狗脊 Cibotium
barometz (L．)J． Sm． 的干燥根茎。味苦、甘，性
温，归肝、肾经。具有补肝肾，强腰膝，祛风湿之
功效，常用于腰膝酸软、下肢无力、风湿痹痛等
症，临床常用于治疗骨质疏松症。通过前期研究狗
脊生、制品不同提取部位对成骨细胞增殖的影响，
发现狗脊制品正丁醇提取部位对成骨细胞增殖作用
最强，这与狗脊制品正丁醇提取部位抗大鼠卵巢切
除骨质疏松模型作用最强的试验结果［1］相吻合。
故本实验进一步利用成骨细胞，筛选狗脊炮制品中
促进成骨细胞增殖作用最明显的具体有效组分，并
测定细胞培养液中碱性磷酸酶 (AKP)活性，进
一步探索狗脊治疗骨质疏松症的机理，探索抗骨质
疏松的有效成分。
1 材料
1. 1 药材 狗脊药材采自四川成都，经辽宁中医
药大学药用植物教研室王冰教授鉴定为蚌壳蕨科植
物金毛狗脊 Cibotium barometz (L．)J． Sm． 的干燥
根茎。
1. 2 试剂材料 三氯甲烷、甲醇 (均为分析纯) ，
柱层析硅胶，DMEM 干粉培养基、新生牛血清、
胰酶、MTT (均为 Gibco公司) ，Ⅰ型胶原酶 (Sig-
ma公司) ，DMSO (ACS 级) ，碱性磷酸酶 (AKP)
测定试剂盒 (南京建成生物工程研究所) ，水为娃
哈哈纯净水。
1. 3 仪器设备 超净工作台 (上海智城 ZHJH-
C1112B)、倒置显微镜 (宁波永新 NIB—100)、
CO2 培养箱 (日本三洋 MCO—15AC)、酶标仪
(TECAN SUNRISE)、细胞培养用具等。
2 试验方法
2. 1 样品制备
2. 1. 1 狗脊炮制品制备 取净河砂 (饮片 8 倍
量)置锅中加热至滑利状态 (180 ～ 190 ℃) ，投入
净狗脊片，边炒边埋，炒 6 ～ 7 min，取出，筛去
砂，晾凉备用。
2. 1. 2 狗脊饮片提取物的制备 取按上述炮制方
法制备的狗脊饮片 18 kg，用 80%乙醇回流提取 3
次，第一次提取 2 h，后两次提取 1 h，合并提取
液，回收乙醇，浓缩液分别用石油醚、三氯甲烷、
乙酸乙酯、正丁醇萃取，收集正丁醇提取部位，回
收溶剂得干膏备用。
2. 1. 3 待筛选组分的分离制备 用甲醇将正丁醇
干膏溶解，与硅胶 1 ∶ 1拌样。将样品经硅胶柱层
析，以三氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得到 7 个流份，
依三氯甲烷-甲醇比例分别记为:三氯甲烷、50∶ 1、
20∶ 1、10∶ 1、5∶ 1、3∶ 1、甲醇组。其中 3∶ 1组分经
薄层色谱比对，按极性由小到大分成 4 个部分，分
别记为:3∶ 1-A、3∶ 1-B、3∶ 1-C、3∶ 1-D组。
经大孔吸附树脂富集得到制品正丁醇提取物中
的总酚酸，记为:酚酸组。
以乙基麦芽酚 (广东肇庆，纯度≥99. 2%)
作为 γ-吡喃酮类化合物的代表，并将其分成高、
中、低 3 个质量浓度，记为:麦芽酚高、麦芽酚
中、麦芽酚低组。以正丁醇提取物 (Z正)作为标
准对照进行筛选。
2. 2 成骨细胞的原代培养［2-3］ 取 24 h 以内新生
大鼠用 75%乙醇消毒后置于培养皿中，在超净台
下揭去头顶皮肤，剪下颅骨，置 PBS (磷酸盐缓冲
液)液内，清除骨膜、血管及结缔组织，再用 PBS
液清洗 3 次，在 PBS 液内将颅骨剪成约 1 mm2 的
小块;将骨片移入 5 mL 0. 25%胰酶内，37 ℃预消
化 20 min 以清除纤维细胞;弃去消化液，将骨片
移入 5 mL 0. 1%Ⅰ型胶原酶中，37 ℃消化分离细
胞 50 min;用 100 目筛网过滤消化液，将消化液移
入离心管中，加培养液终止消化，1 000 r /min 离
心 10 min;小心倾倒出上清液，加入适量含 15%
小牛血清的 DMEM培养液 (以下简称培养液) ，将
细胞混悬;用计数板调整细胞浓度 5 × 105 个 /mL，
将调整好的细胞悬液分装到培养瓶中，再加入培养
液共 5 mL，放入 37 ℃ 5% CO2 培养箱中培养。经
与文献［2，4-6］比较，该细胞具有明显成骨细胞特
征，呈梭形、三角形或多边形，胞核大而清楚，呈
圆形或卵圆形，含 1 ～ 2 个核仁。
2. 3 待筛选试药促进成骨细胞增殖的检测
2. 3. 1 含药培养液的制备 将上述得到的 16 种待
筛选组分 (Z正、三氯甲烷、50 ∶ 1、20 ∶ 1、10 ∶ 1、
5∶ 1、3∶ 1、甲醇、3 ∶ 1-A、3 ∶ 1-B、3 ∶ 1-C、3 ∶ 1-D、
酚酸、麦芽酚高、麦芽酚中、麦芽酚低)精密称
量，溶于 DMSO 中，配成相当于饮片含有量为 10
mg /mL的贮备液。除麦芽酚组外，其余 13 组在超
净工作台下用移液器吸取各组分 10 μL于 10 mL量
瓶中，用无血清培养液稀释至刻度，配成 1. 0 ×
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10 －2 mg /mL 的含药培养液，0. 22 μm 过滤除菌，
－ 20 ℃保存备用;麦芽酚组用相同方法配成高、
中、低质量浓度分别为 1. 0 × 10 －3 mg /mL、1. 0 ×
10 －4 mg /mL、1. 0 × 10 －5 mg /mL的含药培养液。
2. 3. 2 细胞加药培养和增殖检测［7-9］ 选择对数生
长期中生长旺盛的第 3 代细胞，用培养液将细胞调
整为 5 × 104个 /mL，铺入 96 孔板中，每孔 200 μL，
培养 24 h，弃去原培养液，换无血清培养液，饥饿
细胞 24 h，以使细胞周期同步化，弃去无血清培养
液，向 96 孔板中加入 2. 3. 1 项下制备的各含药培
养液，以无血清培养液和含 15%小牛血清的培养
液为对照，每药重复 5 个孔，每孔 200 μL，继续
培养 48 h，弃去培养液，加入 5 mg /mL 的 MTT 溶
液 50 μL，37 ℃培养 4 h 后，吸净上清液，加入
150 μL DMSO，在摇床上振摇 10 min 使结晶充分
溶解，用酶标仪在 405 nm 处，测定吸光度值。用
SPSS 15. 0 统计学软件进行加药组与对照组之间的
比较。细胞增殖率的计算如下。
增值率 = (A加药组 － A对照组) /A对照组 × 100%
2. 4 含药培养液中 AKP 酶活性的检测 吸取
2. 4. 2 项下培养 48 h后的含药培养液，按照试剂盒
操作方法，显色后在波长 492 nm，用酶标仪测定
各孔吸光度值，以无血清培养液为对照组，用
SPSS 15. 0 统计学软件进行加药组与对照组之间的
比较，根据计算公式说明 AKP酶活性。
碱性磷酸酶 (金氏单位 /100 mL) = (A测定孔 －
A空白孔) / (A标准孔 － A空白孔 ) × 0. 02 mg /mL ×
100 mL
3 结果
3. 1 细胞增殖测定结果 测定结果如表 1 所示。
在三氯甲烷-甲醇梯度洗脱得到的 7 个流份 (三氯
甲烷、50∶ 1、20∶ 1、10∶ 1、5∶ 1、3∶ 1、甲醇)中，
3∶ 1组、甲醇组对成骨细胞的增殖呈非常显著性影
响 (P ＜ 0. 001) ，由增值率可以看出 3∶ 1组分促进
成骨细胞增殖作用最明显，因此进一步筛选 3∶ 1组
分，其中的 4 个组分对成骨细胞的增殖作用均呈非
常显著性影响，而其中极性最大的 3∶ 1-D部分的增
殖作用最强，为 49. 2%，稍低于 Z正的 56. 9%。
由总酚酸和乙基麦芽酚的数据可知，总酚酸对
成骨细胞的增殖作用影响不大，无显著性差异;而
乙基麦芽酚的增殖作用呈显著性影响，且麦芽酚中
质量浓度组增值率达到 48. 3%，能有效促进成骨
细胞增殖。
表 1 含药培养液对成骨细胞增殖的影响
Tab. 1 Effects on proliferation of osteoblasts
药物组别 A (x ± s) 增殖率 /%
Z正 0. 518 ± 0. 021＊＊＊# 56. 9
三氯甲烷 0. 326 ± 0. 018 －
50∶ 1 0. 335 ± 0. 011 1. 3
20∶ 1 0. 338 ± 0. 014 2. 4
10∶ 1 0. 359 ± 0. 028 8. 6
5∶ 1 0. 379 ± 0. 037* 14. 8
3∶ 1 0. 554 ± 0. 026＊＊＊# 67. 8
甲醇 0. 443 ± 0. 030＊＊＊ 34. 3
3∶ 1-A 0. 416 ± 0. 020＊＊＊ 26. 0
3∶ 1-B 0. 426 ± 0. 031＊＊＊ 29. 0
3∶ 1-C 0. 443 ± 0. 020＊＊＊ 34. 1
3∶ 1-D 0. 493 ± 0. 030＊＊＊ 49. 2
酚酸 0. 353 ± 0. 013 6. 8
麦芽酚高 0. 409 ± 0. 016＊＊＊ 24. 0
麦芽酚中 0. 490 ± 0. 019＊＊＊ 48. 3
麦芽酚低 0. 464 ± 0. 018＊＊＊ 40. 6
无血清培养液对照组 0. 330 ± 0. 023
15%小牛血清培养液对照组 0. 455 ± 0. 034＊＊＊ 37. 9
注:与无血清培养液对照组相比* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01，＊＊＊P ＜
0. 001;与 15%小牛血清培养液对照组相比#P ＜ 0. 05。
3. 2 AKP酶活性测定结果 AKP 酶活性见图 1。
经统计学分析，与无血清对照组相比，各组药物
AKP酶活性并无显著性差异 (P ＞ 0. 05) ，但由图
可以看出，筛选出的促进成骨细胞增殖作用较强的
组分 (3∶ 1组、3 ∶ 1-D 组等) ，其培养液中 AKP 酶
的活性较高;但同样对成骨细胞增殖作用较强的 Z
正组，其 AKP 酶活性却较低，甚至低于对照组，
而促进细胞增殖作用较弱的酚酸组却体现出较高的
AKP酶活性。
图 1 AKP酶活性图
Fig. 1 Activity of AKP
4 讨论
大鼠卵巢切除致骨质疏松模型虽然是国内外公
认的骨质疏松经典动物模型，但其周期长，在药物
的筛选中应用较少，更多的是用在药效学评价
中［10］。因此本实验利用成骨细胞实验作为高通量
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的筛选模型，筛选 14 种狗脊炮制品正丁醇提取部
位中的组分，以 MTT 测定方法周期较短，简便快
捷，首次利用细胞实验筛选中药狗脊的有效成分。
结果显示极性较大的 3 ∶ 1-D 组分对细胞增殖
作用最明显，因此初步判断狗脊促进成骨细胞增殖
作用的具体成分可能集中在大极性组分中，并且作
为吡喃酮类化合物代表的乙基麦芽酚在本实验中体
现出具有良好的促进细胞增殖作用，因此推测促进
成骨细胞增殖的成分可能是吡喃酮类化合物［11］，
需进一步深入研究。
AKP酶是成骨细胞分化的特异性标志之一，
可以反映成骨细胞分化的程度［12］。本实验中，3∶ 1
组、3∶ 1-D 组、麦芽酚中组促进 AKP 酶活性作用
最强，且这些组分促进成骨细胞增殖的作用也较
强，提示可能通过促进成骨细胞增殖、增加骨量，
促进成骨细胞分化、增加骨密度的机理来发挥治疗
骨质疏松的作用，其具体影响哪些细胞因子，作用
靶点在何处，以及发挥功效的具体成分还有待进一
步的分子生物学研究。
试验结果中还出现了对成骨细胞增殖作用较强
的正丁醇提取物组的 AKP 酶活性却较低，而促进
细胞增殖作用较弱的酚酸组却体现出较高的 AKP
酶活性的现象，究其原因，可能因为狗脊中某些成
分的作用体现在促进成骨细胞的增殖上，而某些成
分的作用体现在促进成骨细胞的分化上，这些成分
共同发挥作用，综合治疗骨质疏松症，这体现了中
药发挥整体、全面治疗作用的优势。
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