全 文 ：protein expression in experimental rats with myocardial
ischemia and reperfusion (ischemia / reperfusion，I /R)
and to alalyze the pathological damage in myocardial
tissue． Methods The myocardialischemia-reperfusion
injury model was established through occluding the left
anterior descending branch of coronary artery for 45
min and removing the ligation later to reperfuse for 2
hours． Sixty-four rats were randomly divided into eight
groups:normal (Normal) group，sham operation
(Sham) group， saline ischemia-reperfusion (NS)
group，solvent control(Sol)group，metoprolol(Meto)
control group，apigenin low，medium and high dose (1
mg· kg －1，2 mg· kg －1，4 mg· kg －1) treatment
group (Api1，Api2，Api4)． Hearts were quickly re-
moved after 2 h reperfusion，and myocardial cell apop-
tosis was marked by TUNEL;Bcl-2、Bax and Caspase-
3 protein expression were tested by immunohistochemi-
cal staining method;myocardial injury degree was ob-
served though histopathological biopsy． Results Myo-
cardial cell apoptosis rate in apigenin groups with dif-
ferent doses were significantly lower than that of NS
group (P ＜ 0. 05) ，and dose-dependent reduction in
myocardial ischemia / reperfusion was observed;Apige-
nin increased dose-dependently the Bcl-2 protein ex-
pression(P ＜ 0. 05)and reduced dose-dependently the
Bax and Caspase-3 protein expression(P ＜ 0. 05)in
rats with myocardial ischemia;Bathological damage of
myocardial cells in apigenin groups with different doses
were significantly lighter than that of NS group(P ＜
0. 05) ，and dose-dependent reduction was detected in
myocardial ischemia / reperfusion． Conclusion The
protective effect of apigenin on myocardial ischemia /
reperfusion may be related to the inhibition of ischemi-
a / reperfusion myocardial apoptosis;The mechanism of
apigenin against myocardial apoptosis may involve the
increased Bcl-2 protein expression and reduced Bax，
Caspase-3 protein expression;Apigenin can reduce
pathological damage of myocardial cells．
Key words:myocardial ischemia-reperfusion injury;
myocardial apoptosis;apigenin;Bcl-2 protein;Bax
protein;Caspase-3 protein;TUNEL
芒柄花素对体外培养成骨细胞缺氧损伤的保护作用
韩桂秋1，王鸣刚1，陈克明2，葛宝丰2，马慧萍3，周 建2，明磊国2，朱瑞清2
(1．兰州理工大学生命科学与工程学院，2．兰州军区兰州总医院骨科研究所，
3．兰州军区兰州总医院药材科，甘肃 兰州 730050)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2011． 05． 018
文献标识码:A 文章编号:1001 － 1978(2011)05 － 0671 － 07
中国图书分类号:R-332;R282. 71;R329. 24;R329. 25;
R845. 22
摘要:目的 研究芒柄花素在缺氧培养条件下对成骨细胞增
殖、细胞周期、凋亡和成骨分化等的影响。方法 采用酶消
化法分离培养 SD大鼠颅骨成骨细胞，并用三气培养箱建立
缺氧模型。将细胞分为常氧对照组、缺氧对照组和缺氧加药
组，其中缺氧加药组进一步分为 10 －6、10 －5和 10 －4 mol·L －1
收稿日期:2010 － 12 － 01，修回日期:2011 － 02 － 28
基金项目:甘肃省科技重大专项计划资助项目(No 092nkDA025)
作者简介:韩桂秋(1982 －) ，男，硕士生，研究方向:抗缺氧药物的筛
选，E-mail:jnhanqiu@ 163． com;
王鸣刚(1962 －) ，男，博士，博士后，硕士生导师，教授，研
究方向:植物分子生物学，通讯作者，Tel:0931-8994327，
Fax:0931-8994950，E-mail:mgwang@ 163． com
组，分别加入 10 －6、10 －5和 10 －4 mol·L －1芒柄花素。于缺氧
处理 36 h后分析各组的细胞存活率、LDH 漏出率、细胞凋
亡、细胞周期等，并用 RT-PCR法检测缺氧诱导因子-1α、Bcl-
2 及 Caspase-3 的基因表达情况。缺氧处理 48 h后检测 ALP
活性、钙化结节面积等成骨分化指标。结果 与缺氧对照组
比较，芒柄花素可提高细胞存活率，降低 LDH 漏出率，减少
细胞凋亡并提高 G1 期细胞百分比，提高 HIF-1α 和 Bcl-2
mRNA的表达水平，抑制 Caspase-3 mRNA 的表达水平，对
ALP活性和钙化结节面积等也有提高作用，且均呈现出剂量
依赖性特点。结论 芒柄花素对成骨细胞缺氧损伤具有明
显保护作用。
关键词:缺氧诱导因子-1α;芒柄花素;成骨细胞;细胞周期;
凋亡;Bcl-2;Caspase-3
芒柄花素(formononetin)化学名为 7-羟基-4’-
甲氧基异黄酮，是刺芒柄花、红车轴草、黑三棱等中
·176·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2011 May;27(5) :671 ～ 7
草药的主要活性成分［1］。研究表明［2］，芒柄花素具
有抑制骨吸收和促进骨形成活性，可预防绝经后骨
质疏松症的发生。有关芒柄花素及其衍生物开发为
抗骨质疏松药物的研究是近年来的一个热点［3］。
缺氧是导致股骨头坏死发生的重要因素，股骨头坏
死后爬行替代修复也与缺氧密切相关［4］。本实验
以体外培养成骨细胞为材料，采用缺氧处理和不同
浓度芒柄花素干预的方法，观察芒柄花素对缺氧成
骨细胞增殖、细胞周期、凋亡和成骨分化的影响，探
讨芒柄花素防治骨股头坏死和促进骨伤修复的作用
与机制，为芒柄花素的新药开发提供理论依据。
1 材料
1． 1 动物与仪器 出生 24 h 以内的 SPF 级 Spra-
gue-Dawly(SD)大鼠乳鼠〔甘肃中医学院实验动物
中心，合格证号 SCXK(甘)2004-0006〕;三气培养箱
(Thermo Revco，美国) ;荧光显微镜、倒置相差显微
镜(OLYMPUS，日本) ;流式细胞仪(Beckman Coul-
ter，美国) ;PCR 扩增仪(ABI 7300，美国) ;酶标仪
(Bio-RadModel 550，美国) ;紫外分光光度计(HP
8453，美国) ;各种培养皿 (Corning)。
1． 2 药物与试剂 芒柄花素(中国药品生物制品
鉴定所) ;胰酶、Ⅱ型胶原酶、RNA 酶 A、噻唑蓝
(MTT)、α-萘基磷酸钠、固蓝 B 盐、碘化丙碇(PI)、
β-甘油磷酸钠、磷酸化抗坏血酸(ASAP)、地塞米松、
二甲基亚砜(DMSO)、TritonX-100 均为 Sigma 公司
产品;α-MEM 培养基(Gibco，美国) ;碱性磷酸酶
(ALP)试剂盒、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒均为南京
建成生物工程研究所产品;RNAiso Reagent、Prime
ScriptTM reagent Kit、RT-PCR 扩增试剂盒、PCR 引物
均为 TaKaRa Biotechnology(Dalian)公司产品;胎牛
血清(兰州民海生物工程公司) ，Annexin V-FITC /PI
细胞凋亡检测试剂盒(科联生物) ;其余普通试剂均
为国产分析纯。
2 方法
2． 1 大鼠成骨细胞(ROB)的培养 采用酶解法从
出生 24 h内的 SD 大鼠颅骨中获取成骨细胞，具体
方法参照文献［5］。常规条件(37℃、5% CO2 和饱和
湿度)培养于三气培养箱内，每 3 天换一次新鲜培
养液。待细胞铺满 90%皿底时进行传代，96 孔板每
孔加 100 μl (3 × 104 ml － 1)或 6 孔板每孔加 2 ml (1
× 108 ml － 1)或中皿加 4 ml (3 × 105 ml － 1)的单细胞
悬液，常规条件培养，用此 P1 代 ROB 细胞进行下列
实验。
2． 2 成骨细胞鉴定 根据细胞形态和 ALP 组化染
色进行成骨细胞鉴定。ALP组化染色采用偶氮偶合
法。细胞传代于置盖玻片的 6 孔板中，细胞铺满皿
底后换成骨性诱导培养液(含 10 mmol·L －1 β-甘油
磷酸钠、1 × 10 －7 mol·L －1地塞米松和 50 mg·L －1
ASAP)。诱导培养 6 d 后，将细胞爬片取出，经 4%
多聚甲醛短暂固定和 1% TritonX-100 破膜处理后，
再将爬片置于基质溶液(含 α-萘基磷酸钠和固蓝 B
盐的 pH 8. 9 巴比妥 －盐酸缓冲液)中 15 min 左右，
待出现阳性结果后，停止染色，冲洗，晾干，甘油明胶
封片。
2． 3 存活率的检测 接种于 96 孔板的 ROB 培养
24 h 后分成 5 组:常氧对照组(normal control，NC
组)、缺氧对照组(hypoxia control，HC组)和缺氧加
药组 3 组:10 －6、10 －5和 10 －4 mol·L －1组，每组 6 个
复孔。NC组和 HC组加正常培养液，缺氧加药组分
别加含 10 －6、10 －5、10 －4 mol·L －1芒柄花素的培养
液。培养 4 h后，NC组常规培养条件不变;HC 组和
缺氧加药组 3 组改为缺氧培养，即在 37℃、5% CO2、
1%O2 和饱和湿度的三气培养箱内培养。缺氧处理
36 h 后，弃培养液，每孔加入含 0. 5% MTT 的 PBS
20μl，37℃孵育 4 h，每孔加入 100 μl DMSO，摇床振
荡 15 min 左右，待紫色结晶沉淀彻底溶解后，在酶
标仪上测 490 nm波长处的 OD值。
2． 4 LDH漏出率的检测 接种于 6 孔板的 ROB
细胞经缺氧处理 36 h后，收集培养液的上清液 U1;
细胞用 PBS洗 2 次，0. 25%胰蛋白酶消化处理，收集
至 0. 5 ml的 pH 7. 4 Tris缓冲液 (含 0. 1% TritonX-
100 和 2 mmol·L －1 MgCl2)中，用超声细胞粉碎仪
粉碎，10 000 r·min －1离心 5 min，收集上清液 U2。
按照 LDH试剂盒说明书操作，用紫外分光光度计测
440nm 处的 OD 值，计算出 U1 和 U2 中 LDH 的活
性。LDH漏出率 /% = U1 /(U1 + U2)。
2． 5 细胞凋亡的检测 缺氧处理 36 h 后，取出细
胞爬片，PBS 洗 2 次，均匀滴加含 FITC 的 Binding
Buffer，室温避光反应 5 min，在荧光显微镜上用
488nm波长的激发光激发出绿色荧光，每组随机选
取 3 个视野拍照，照片用 Image-Pro Plus 6. 0 软件进
行定量分析，结果用积分光密度(IOD)表示。
2． 6 细胞周期的检测 缺氧处理 36 h 后，将培养
细胞用 0. 25%胰酶消化悬浮，1 000 r·min －1离心
10 min，PBS 洗 2 次沉淀，把细胞沉淀混悬于 1 ml
预冷的体积分数为 70%乙醇中，4℃过夜，离心，收
集细胞，PBS 洗 1 次，再将细胞混悬于 500 μl DNA
染色液(pH 7. 4，含 1 g·L －1枸橼酸钠，2% TritonX-
100，50 mg·L －1 PI和 100 mg·L －1 RNA 酶 A)中。
室温避光反应 30 min，上流式细胞仪分析细胞周期。
·276· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2011 May;27(5)
2． 7 HIF-1α、Bcl-2 和 Caspase-3 mRNA 表达水平
的检测 缺氧处理 36 h 后，按 RNAiso Reagent试剂
盒要求，采用 TRIzol一步法对各孔样本进行总 RNA
的提取，紫外分光光度计检测浓度，1%甲醛变性琼
脂糖电泳检测完整性。逆转录和 Real Time PCR 扩
增均按 TaKaRa Biotechnology(Dalian)产品说明书设
定的参数进行。经内参基因 GAPDH 校正，计算出
目的基因 mRNA 相对表达水平。计算公式［6］:X =
2 －△△Ct，其中 ΔΔC t =(Ctsample － CtGAPDH)。所用引物
均委托 TaKaRa Biotechnology(Dalian)公司根据
GenBank所发布的序列设计并合成。HIF-1α:For-
ward 5-ATGAGATGAAGGCACAGATGG-3Reverse5-
TATTTGACGGATGGGAATGG-3产物长度 453 bp;
Bcl-2:Forward 5-GCTACGAGTGGGATACTGGAGA-
3 Reverse5-AGTCATCCACAGAGCGATGTT-3 产物
长度 446 bp;Caspase-3:Forward 5-TTTGTTTGTGT-
GCTTCTGAGCC-3，Reverse5-ATTCTGTGCCACCTTT
CGG-3产物长度 400 bp;GAPDH:Forward 5-GGCA-
CAGTCAAGGCTGAGAATG-3，Reverse5-AGGTGGT-
GAAGACGCCAGTA-3产物长度 143 bp。
2． 8 成骨性分化能力的检测 接种于 6 孔板或中
皿的细胞铺满皿底后，换成骨性诱导培养液。诱导
培养 6 d后缺氧处理 48 h，做以下分析:
2． 8． 1 ALP酶活性检测 缺氧处理结束后，取出 6
孔板，弃培养液，PBS 洗 2 次，用 ALP 试剂盒检测酶
活性，测定 507nm波长处 OD值，根据苯酚标准及样
本的吸光度，计算酶活性，结果以 nmol phenol·(15
min)－ 1·well － 1表示。
2． 8． 2 矿化结节分析 缺氧处理结束后，取出中
皿，缺氧加药组换不含芒柄花素的成骨性诱导培养
液继续常规培养，14 d后进行 von Kossa钙化结节染
色。观察钙化结节染色结果并拍照，照片用 Image-
Pro Plus 6. 0 软件进行矿化结节分析，结果用面积
(Area)表示［7］。
2． 9 统计学分析 结果以 珋x ± s 表示，采用
SPSS17. 0 软件的 One Way ANOVA 处理数据，两组
间比较采用单因素方差分析，多组间比较采用
Scheffe方差分析。
3 结果
3． 1 成骨细胞鉴定 培养初期 ROB 呈梭形、三角
形或多角形。随着培养时间延长，细胞体积增大、数
量增多，形态以多角形为主，细胞之间联系密切，并
逐渐融合成典型的铺路石状(Fig 1A)。ALP组化染
色后，可见培养细胞胞质内有紫黑色颗粒，细胞密集
区可见染色阳性克隆(Fig 1B) ，具有成骨细胞的典
型特征。
Fig 1 Identification of ROB
A:Morpheus of ROB (× 200) ，on day 4，cultured cells with typi-
cal morpheus of osteoblasts;B:ALP staining of ROB (× 100) ，the cul-
tures were cultured in the presence of osteogenic inducer for 6 days and
then were fixed with neutral buffered formalin and stained to visualize by
ALP staining． Cultured cells with typical characteristics of osteoblasts
3． 2 对存活率的影响 缺氧处理 36 h 后，HC 组
OD值低于 NC组，缺氧加药组 3 组也都低于 NC组，
但均高于 HC 组，其中 10 －6、10 －5和 10 －4 mol·L －1
组的 OD值依次升高，且 10 －4 mol·L －1组高于 10 －6
mol·L －1组(Fig 2)。
Fig 2 OD values at different groups revealed by MTT assay(n = 6)
The cultures of five groups were cultured in the hypoxic or normoxic
chamber for 36 hours and then cell viability was assessed by measuring
MTT activity． Each measurement is the mean of sextuple cultures． Stand-
ard deviation (SD)of the mean is shown by vertical bars． ▲▲P ＜ 0. 01 vs
NC;＊＊P ＜ 0. 01 vs HC;△P ＜ 0. 05 vs 10 －6 mol·L －1 group
3． 3 对 LDH 漏出率的影响 HC 组 LDH 漏出率
高于 NC组;缺氧加药组 3 组也都低于 HC 组，但均
高于 NC组，且呈剂量依赖性降低，其中 10 －5和 10 －4
mol·L －1组与 HC 组有差异，10 －4 mol·L －1组也低
于 10 －6 mol·L －1组(Fig 3)。
3． 4 对细胞凋亡的影响 缺氧处理 36 h 后，HC 组
凋亡高于 NC组;缺氧加药组 3 组也都低于 HC组但
均高于 NC 组，且呈剂量依赖性降低，其中 10 －5和
·376·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2011 May;27(5)
10 －4 mol·L －1组与 HC 组有差异，10 －4 mol·L －1组
与 10 －6 mol·L －1组的差异有统计学意义(Tab 1，Fig
4)。
Fig 3 LDH leakage rate of ROB(n = 4)
The cultures of five groups were cultured in the hypoxic or normoxic
chamber for 36 hours and then LDH leakage rate was measured． Each
measurement is the mean of quadruple cultures． Standard deviation (SD)
of the mean is shown by vertical bars． ▲▲P ＜ 0. 01 vs NC;＊＊P ＜ 0. 01
vs HC;△P ＜ 0. 05 vs 10 －6 mol·L －1 group
Tab 1 IOD of apoptosis and percentage of different phases
of cellular cycle(珋x ± s，n = 3)
Group Apoptosis(IOD) Phase G1 /% Phase S + G2 /%
NC 195． 4 ± 16． 9 65． 7 ± 3． 9 34． 3 ± 2． 3
HC 390． 6 ± 27． 8▲▲ 84． 6 ± 4． 3▲▲ 15． 4 ± 1． 1▲▲
10 － 6 mol·L －1 374． 6 ± 26． 4▲▲ 85． 3 ± 4． 2▲▲ 14． 7 ± 1． 0▲▲
10 － 5 mol·L －1 338． 7 ± 24． 5▲▲＊ 90． 2 ± 4． 9▲▲＊ 9． 7 ± 0． 8▲▲＊＊
10 － 4 mol·L －1 292． 1 ± 20． 3▲▲＊＊△ 92． 4 ± 4． 7▲▲＊＊△ 7． 6 ± 0． 6▲▲＊＊△
The cultures of five groups were exposed to hypoxia (1% O2)or normoxia for
36 hours． Cell apoptosis was analysed by fluorescence microscope and measured for
IOD of apoptosis by image analyzer Image-Pro Plus 6． 0． Cellular cycle was ana-
lysed by flow cytometer and measured for percentage of different phases of cellular
cycle． ▲▲P ＜0. 01 vs NC;* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01 vs HC;△P ＜ 0. 05 vs 10 － 6
mol·L －1 group
3． 5 对细胞周期的影响 由 Tab 1 和 Fig 5 可见，
缺氧处理 36 h后，HC组处于 G1 期的细胞百分比高
于 NC 组;缺氧加药组 3 组则均高于 HC 组和 NC
组，且呈剂量依赖性升高，其中 10 －5和 10 －4 mol·
L －1组与 HC组差异有统计学意义，10 －4 mol·L －1
组也高于 10 －6 mol·L －1组。S + G2 期细胞百分比
的变化趋势与 G1 期细胞百分比的变化趋势相反并
具有统计学意义。
3． 6 对 HIF-1α、Bcl-2 和 Caspase-3 mRNA表达水
平的影响 RT-PCR 检测结果分析见 Tab 2。缺氧
处理 36 h后，HC组 HIF-1α、Bcl-2 和 Caspase-3 mR-
NA表达量均高于 NC 组;缺氧加药组 3 组 HIF-1α
和 Bcl-2 mRNA表达量则都高于 HC 组和 NC 组，且
呈剂量依赖性升高，其中 10 －5 mol·L －1组和 10 －4
mol·L －1组与 HC组差异有统计学意义，10 －4 mol·
L －1组也高于 10 －6 mol·L －1组。Caspase-3 mRNA表
达趋势却有所不同，缺氧加药组 3 组都高于 NC 组
但低于 HC组，且呈剂量依赖性降低。
Tab 2 Relative level of HIF-1α，Bcl-2，Caspase-3
mRNA expression(珋x ± s，n = 4)
Group HIF-1α Bcl-2 Caspase-3
NC 1． 41 ± 0． 11 3． 66 ± 0． 13 2． 20 ± 0． 20
HC 5． 04 ± 0． 17▲▲ 8． 60 ± 0． 19▲▲ 11． 82 ± 0． 28▲▲
10 － 6 mol·L －1 5． 21 ± 0． 18▲▲ 8． 75 ± 0． 26▲▲ 11． 59 ± 0． 27▲▲
10 － 5 mol·L －1 5． 33 ± 0． 19▲▲＊ 9． 35 ± 0． 23▲▲＊＊ 11． 38 ± 0． 25▲▲＊
10 － 4 mol·L －1 5． 40 ± 0． 17▲▲＊＊△ 9． 61 ± 0． 24▲▲＊＊△11． 04 ± 0． 26▲▲＊＊△
The cultures of five groups were cultured in the hypoxic or normoxic chamber
for 36 hours and then relative level of HIF-1α，Bcl-2 and Caspase-3 mRNA expres-
sion was measured by the method of Real-time PCR． Quantitification of these mR-
NA expressions normalized against the GAPDH mRNA levels． ▲▲ P ＜ 0. 01 vs
NC;* P ＜0. 05，＊＊P ＜0. 01 vs HC;△P ＜0. 05 vs 10 － 6 mol·L －1 group
3． 7 对 ALP酶活性影响 如 Fig 6 所示，缺氧处理
后，HC组 ALP活性远低于 NC 组;缺氧加药组 3 组
ALP活性均高于 HC组但低于 NC组，且呈剂量依赖
性升高，其中 10 －5和 10 －4 mol·L －1组与 HC 组比较
差异有统计学意义。
Fig 4 Fluorescence staining of apoptosis(× 200)
The cultures of five groups were exposed to hypoxia (1% O2)or normoxia for 36 hours and then cells was analysed by fluorescence microscope． C:
NC，D:HC，E:10 －6 mol·L －1 group，F:10 －5 mol·L －1 group，G:10 －4 mol·L －1 group．
·476· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2011 May;27(5)
Fig 5 Analysis graph of cellular cycle by flow cytometer
The cultures of five groups were exposed to hypoxia (1% O2)or
normoxia for 36 hours and then cells were enzymatically digested and col-
lected separately． Cellular cycle was analysed by flow cytometer． H:NC，
I:HC，J:10 －6 mol·L －1 group，K:10 －5 mol·L －1 group，L:10 －4
mol·L －1 group．
Fig 6 The ALP activity in different groups(n = 4)
The cultures of five groups were cultured in the presence of osteogen-
ic inducer for 6 days and then were exposed to hypoxia (1% O2)or nor-
moxia． ALP activity was measured after 48 hours． Each measurement is
the mean of quadruple cultures． Standard deviation (SD)of the mean is
shown by vertical bars． ▲▲P ＜ 0. 01 vs NC;* P ＜ 0. 05，＊＊P ＜ 0. 01 vs
HC
3． 8 对钙化结节数量和面积的影响 von Kossa 钙
化结节染色结果如 Fig 7A 所示，扫描分析见 Fig
7B。HC组钙化结节面积明显大于 NC组;缺氧加药
组 3 组钙化结节面积随芒柄花素浓度升高而增大，
且均大于 HC 组，但小于 NC 组，其中 10 －5和 10 －4
mol·L －1组与 HC 组比较差异有统计学意义，10 －4
mol·L －1组也高于 10 －6 mol·L －1组。
Fig 7A Calcified nodules by von Kossa staining in different groups
On day 14，the cultures of different groups were fixed with neutral
buffered formalin and stained to visualize by the method of von Kossa stai-
ning．
Fig 7B Area of Calcified nodules by von Kossa staining(n = 3)
Calcified nodules in the five group cultures were subjected to von
Kossa staining on day 14 and measured for area of nodule by image analy-
zer Image-Pro Plus 6. 0． Standard deviation (SD)of the mean is shown
by vertical bars． ▲▲P ＜ 0. 01 vs NC;* P ＜ 0. 05，＊＊ P ＜ 0. 01 vs HC;
△P ＜ 0. 05 vs 10 －6 mol·L －1 group
4 讨论
股骨头的解剖结构和生理特点决定了其血液循
环系统的脆弱性，在激素、酒精、骨质疏松、创伤等因
素的作用下极易造成股骨头血液供给不足，进而形
成局部缺血缺氧的环境，最终导致骨股头坏死［8］。
股骨头坏死的病理生理学机制说明各种危险因素最
终通过共同的途径———血管内凝血导致股骨头缺血
·576·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2011 May;27(5)
缺氧而坏死［9］。研究表明［10］，缺氧引起的骨细胞凋
亡和成骨性分化能力下降既能促进股骨头坏死的发
生，又能引起股骨头塌陷区修复的中断。因此，减少
缺氧引起的成骨细胞凋亡和提高成骨性分化能力是
治疗股骨头坏死的重要方法。
缺氧使细胞产生缺氧应激反应。HIF-1α 是缺
氧适应性应激反应体系的重要基因，通过调控一系
列基因的表达来减轻缺氧造成的细胞损伤并增强细
胞缺氧适应能力［11］。本研究发现，在缺氧条件下，
芒柄花素提高细胞存活率、降低 LDH漏出率和细胞
凋亡率，并提高 HIF-1α 基因表达水平，且呈剂量依
赖性缺氧保护作用。芒柄花素还能提高成骨细胞抗
凋亡基因 Bcl-2 的表达水平，并且抑制促凋亡基因
Caspase-3 mRNA表达，说明其以多种途径发挥对缺
氧损伤的保护作用。
G1 期到 S期和 G2 期到M期是细胞周期中调节
因子变化的活跃时期，对外界条件的变化非常敏
感［12］。本实验结果显示缺氧明显抑制成骨细胞增
殖，芒柄花素更进一步降低缺氧成骨细胞的增殖指
数(即 G2 + S 期细胞百分比) ，抑制细胞分裂，可能
是其抗缺氧损伤的机制之一。
成骨细胞的成骨性分化能力是影响股骨头坏死
修复的重要因素［10］。在芒柄花素的干预下，成骨细
胞 ALP酶活性较完全缺氧时提高，形成钙化结节的
面积明显增多，说明保持了较高的成骨性分化能力。
本研究表明，芒柄花素能减轻缺氧条件下成骨
细胞的损伤和凋亡，促进成骨性分化能力的保持，具
有治疗骨股头坏死的新药价值。其详细的抗缺氧机
制有待进一步研究。
参考文献:
［1］ Chen H Q，Jin Z Y，Tao G J，et al． Determination of isoflavones in
different parts of Trifolium pratense by high performance liquid
chromatography［J］． Food Sci，2004，25:150 － 3．
［2］ Deng Y，Chen H F． Effects of astragalus injection and its ingredi-
ents on proliferation and Akt phosphorylation of breast cancer cell
lines［J］． J Chin Integr Med，2009，7(12) :1174 － 80．
［3］ Huh J E，Seo D M，Baek Y H． Biphasic positive effect of form-
ononetin on metabolic activity of human normal and osteoarthritic
subchondral osteoblasts［J］． Int Immunopharmacol，2010，10:500
－ 7．
［4］ Michael M，Lynne J，David H． Nontraumatic osteoneerosis of the
femoral head:ten years later［J］． J Bone Joint Surg Am，2006，88
(5) :1117 － 32．
［5］ Ma H P，Jia Z P，Chen K M，et al． Effects of rat serum contai-
ning total flavonoid extract of Epimedium sagittatum on develop-
ment of osteoblasts［J］． Chin J Chin Mater Med，2008，33(8) :
829 － 32．
［6］ Thomas D，Schmittgen L，Kenneth J． Analyzing real-time PCR
data by the comparative CT method［J］． Nature Protocol，2008，
13:1101 － 8．
［7］ Yamamoto N，Furuya K，Hanada K． Progressive development of
the osteoblast phenotype during differentiation of osteoprogenitor
cells derived from fetal rat calvaria:model for in vitro bone forma-
tion［J］． Biol Pharm Bull，2002，25(4) :509 － 15．
［8］ Jones L C，Hungerford D S． nepathogenesis of ostconeerosis［J］．
Instr Course Leer，2007，56:179 － 96．
［9］ 赵海燕，夏亚一，康鹏德． 股骨头坏死病因与发病机制研究进
展［J］．中国矫形外科杂志，2009，17(8) :604 － 7．
［9］ Zhao H Y，Xia Y Y，Kang P D． Etiology and pathogenesis of os-
teonecrosis of the femoral head［J］． Orthop J China，2009，17
(8) :604 － 7．
［10］ Lee J S，Lee J S，Rob H L，et al． Alterations in the differentiation
ability of mesenchymal stem ceils in patients with nontraumatic os-
teonecresis of the femoral head:comparative analysis according to
the risk factor［J］． J Orthop Bes，2006，24:604 － 9．
［11］ Wang G L，Semenza G L． Purification and characterization of hy-
poxia inducible factor 1α［J］． J Biol Chem，1995，270:1230 － 7．
［12］ Sakajiri S，Kumagai T，Kawamata N，et al． Histone deacetylase
inhibitors profoundly decrease proliferation of human lymphoid
cancer cell lines［J］． Exp Hematol，2005，33:53 － 61．
Protective effect of formononetin on hypoxic injuries of osteoblasts in vitro
HAN Gui-qiu1，WANG Ming-gang1，CHEN Ke-ming2，GE Bao-feng2，MA Hui-ping3，
ZHOU Jian2，MING Lei-guo2，ZHU Rui-qing2
(1． School of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology;2． Institute of Orthopedics，
3． Dept of Pharmacy，Lanzhou General Hospital，Lanzhou Command，PLA． Lanzhou 730050，China)
Abstract:Aim To investigate the effects of formonon-
etin on survival rate，cellular cycle，apoptosis and dif-
ferentiation of osteoblasts induced by hypoxia． Meth-
ods Rat osteoblasts were isolated from calvarias of
newborn Sprague-Dawly by enzyme digestion，and hy-
poxic environment was made by triple-gases incubator．
Rat osteoblasts was induced by hypoxia． After 36
hours，cell viability，LDH leakage rate，analysis of
cellular cycle and apoptosis rate were compared among
10 －6mol·L －1group，10 －5mol·L －1group，10 －4mol·L －1
·676· 中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2011 May;27(5)
group，hypoxia control and normal control． Total RNA
was isolated and the gene expression of HIF-1α，Bcl-2
and Caspase-3 was investigated by RT-PCR． 48 hours
after hypoxia，osteogenic differentiation markers inclu-
ding ALP activity and nodules were detected． Results
Formononetin could significantly improve survival
rate，ALP activity，area of calcified nodules and de-
crease LDH leakage rate，apoptosis，percentage of S +
G2 phases． Besides，the mRNA level of HIF-1α and
Bcl-2 was enhanced，and the mRNA level of Caspase-3
was inhibited． Conclusion Formononetin can protect
osteoblasts from hypoxia and enhance the osteogenic
differentiation of osteoblasts induced by hypoxia signifi-
cantly．
Key words:HIF-1α;formononetin;osteoblast;cellu-
lar cycle;apoptosis;Bcl-2;Caspase-3
柚皮苷对乳鼠成骨细胞增殖及 c-fos、c-jun表达的影响
武密山1，赵素芝2，任立中3，王 茹1，白 霞1，韩红伟1，李 彬4
(1．河北医科大学中医学院方剂学教研室，河北 石家庄 050091;2．石家庄市桥东区医院，
河北 石家庄 050041;3．河北医科大学第一医院骨科，河北 石家庄 050031;
4．河北医科大学生物化学教研室，河北 石家庄 050017)
doi:10． 3969 / j． issn． 1001 － 1978． 2011． 05． 019
文献标识码:A 文章编号:1001 － 1978(2011)05 － 0677 － 05
中国图书分类号:R-332;R284. 1;R329. 24;R394. 2;R681
摘要:目的 研究柚皮苷(naringin)对体外培养的小鼠成骨
细胞增殖及 c-fos 和 c-jun 表达的影响。方法 取第 1 代
BALB /c小鼠颅盖骨成骨细胞，将柚皮苷以 0. 1、1、10 μmol·
L －1 3 种浓度分别加入新生大鼠颅骨成骨细胞培养液中，
MTT 法观察各组对成骨细胞的增殖作用并绘制细胞生长曲
线，用 PNPP 法测定成骨细胞内碱性磷酸酶(alkaliphos-
phatase，ALP)活性，RT-PCR法检测成骨细胞 c-fos和 c-jun的
转录水平。结果 细胞生长曲线显示各组成骨细胞数量均
随时间延长而增加，中、高浓度的柚皮苷能提高成骨细胞的
ALP活性，促进 c-fos mRNA 表达(P ＜ 0. 01) ，对成骨细胞 c-
jun mRNA表达增强作用不明显(P ＞ 0. 05)。结论 低浓度
柚皮苷(0. 1 μmol·L －1)对骨更新作用不明显，而中、高浓度
的柚皮苷(1、10 μmol·L －1)能通过上调 c-fos mRNA 表达，
促进成骨细胞的生成功能，增强骨更新。柚皮苷不是通过促
进 c-jun表达来促进成骨细胞增殖与分化的。
关键词:柚皮苷;骨质疏松;成骨细胞;细胞增殖;c-fos;c-jun
收稿日期:2011 － 02 － 28，修回日期:2011 － 03 － 16
基金项目:国家自然科学基金资助项目(No 81073074，30472200) ;河
北省引进留学人员经费资助项目(No 200828)
作者简介:武密山(1966 －) ，男，博士，教授，硕士生导师，研究方向:
补肾中药治疗骨质疏松症作用机制，Tel:0311-86265481，
E-mail:sjzwms1966@ hotmail． com;
赵素芝(1966 －) ，女，副主任医师，研究方向:中西医结合
治疗骨病，通讯作者，Tel:0311-85996845，E-mail:ok-
good888@ 163． com
骨碎补(rhizoma drynariae)是水龙骨科植物槲
蕨 Drynaria fortunei(Kunze)J． Sm．的干燥根茎，性味
苦、温，入肝、肾经，功用补肾壮骨、活血、止血，主治
跌打损伤、骨折、肾虚腰痛。骨碎补主要成分为柚皮
苷(naringin)、北美圣草苷(neocriocitrin)等黄酮类化
合物，还含有淀粉、葡萄糖等。以往研究提示［1 － 3］，
由骨碎补组成的补肾复方在抑制骨量丢失，改善骨
密度，增强生物力学抗压性能方面有明显疗效。通
过骨碎补总黄酮、淫羊藿总黄酮、菟丝子总黄酮 3 种
中药黄酮对成骨细胞活性促进作用比较，骨碎补总
黄酮作用最强，淫羊藿总黄酮次之，菟丝子总黄酮最
差［4］，到目前为止柚皮苷促进细胞增殖的分子机制
仍不十分清楚。c-fos、c-jun 蛋白分别由原癌基因 c-
fos、c-jun编码，参与转录因子 AP-1 的组成，调节细
胞的生长分化［5］，c-fos、c-jun 在骨细胞成熟及分化
过程中起着重要作用［6］。本研究采用离体新生小
鼠头盖骨成骨细胞进行培养，观察不同浓度柚皮苷
(naringin)对成骨细胞增殖及 c-fos、c-jun 表达的影
响，为进一步研究黄酮类植物雌激素防治骨质疏松
作用提供实验依据。
1 材料与方法
1． 1 材料
1． 1． 1 主要试剂、药物与动物 胰蛋白酶(Sigma
USA) ，Collagenase type Ⅱ(Worthington，USA) ，噻唑
蓝、碱性磷酸酶(ALP)试剂盒(日本 Wako 公司) ;
DMEM培养基(Gibco 公司) ，胎牛血清(Hyclone 公
司) ，α-minimal essential medium (α-MEM，Gibco，
·776·中国药理学通报 Chinese Pharmacological Bulletin 2011 May;27(5) :677 ～ 81