全 文 ：收稿日期:2008-01-15;　修订日期:2008-05-17
基金项目:山东省科技攻关项目(No.2007GG2NS02051)
作者简介:王健美(1976-),女(汉族),山东潍坊人 ,现任泰山医学院生物
科学系讲师 ,硕士学位 ,主要从事药用植物分子生物学的研究工作.
＊通讯作者简介:郝岗平(1970-), 男(汉族),山西临县人 , 现任泰山医学
院副教授 ,博士学位 ,主要从事中药生物技术研究工作.
高质量的泰山白花丹参根部总 RNA
的提取及 DDRT-PCR检测
王健美 ,史仁玖 ,苗　苗 ,李艳玲 ,郝岗平＊
(泰山医学院 ,山东 泰安　271016)
摘要:目的 从富含多酚和多糖的泰山白花丹参根中分离出高质量 RNA。方法 比较了 5种 RNA提取方法 , 获得了一种
以 CTAB法为基础的分离高质量完整 RNA的简便 、快速方法。结果 使用该方法从泰山白花丹参根部分离的 RNA的纯
度是:A260 /A280为 1.87, A260 /A230为 2.11, 产量为 284.62μg/g。 FW的根 , 电泳条带清晰 , RNA完整性好。 由此法所得的RNA可直接用于 cDNA文库构建等分子生物学实验。结论 该技术可有效地从富含多酚和多糖的泰山白花丹参根中分
离出高质量 RNA, 为对该山东特有药材进行分子生物学研究奠定基础。
关键词:泰山白花丹参;　根;　RNA提取
中图分类号:R284.2　　文献标识码:A　　文章编号:1008-0805(2009)02-0297-03
IsolationofHighQualityTotalRNAfromRootofTaishanSalviamiltiorrhizaBge.f.al
baandDDRT-PCRTest
WANGJian-mei, SHIRen-jiu, MIAOMiao, LIYan-ling, HAOGang-ping＊
(DepartmentofBiologicalScience, TaishanMedicalColege, Taian271016 , China)
Abstract:ObjectiveToexplorethehighqualitytotalRNAisolationmethodfromrootofTaishanSalviamiltiorrhizaBge.f.alba
C.Y.WUetH.W.Licontainingmuchpolyphenolsandamylose.MethodsSimpleandrapidprocedureforhigh-qualitytotal
RNAisolationmodifiedfromCTABbasedmethodwasobtainedbycomparingfiveRNAisolationmethods.ResultsA260 /A280 andA
260
/A
230
ofpreparedRNAwererespectively1.87 and2.11, andRNAamountwere284.62μg/gfreshweightofroot.Theresults
ofelectrophoresisshowedthatRNAbandswereclearandshowednodegradation.ThishighqualityRNAcouldmeetthedemands
ofmolecularanalysis, suchascDNAlibraryconstruction.ConclusionThismodifiedtechniquebasedonCTABmethodmaybeef-
ficientandreliableinisolatinghighqualityRNAfromTaishanSalviamiltiorhizaBge.f.albaC.Y.WUetH.W.Licontaining
muchpolyphenolsandamylase.ThisstudyestablishedthebaseforfurtherstudyofthismedicinalplantfoundonlyinShandong
province.
Keywords:TaishanSalviamiltiorrhizaBge.f.albaC.Y.WUetH.W.Li;　Roots;　RNAisolation
　　丹参(Salviamiltiorrhiza)是我国传统中药 , 具有活血化淤 、
通经止痛的功能。丹参中含有二类活性成分:脂溶性二萜醌类
化合物和水溶性酚酸类化合物 [ 1, 2] 。二萜醌类化合物 , 如丹参酮
I, 丹参酮 IA, 隐丹参酮等 ,具有抑制血小板聚集 、耐缺氧 、改善冠
状动脉供血等药理作用 , 是治疗心血管系统疾病的重要药物;酚
酸类化合物 , 如丹酚酸 A, 丹酚酸 B、紫草酸 、迷迭香酸 、原儿茶
醛 、丹参素等 , 具有很强的抗脂质氧化 、抗肝纤维化 、改善尿毒
症 、改善肾功能等作用 [ 1 , 2] 。两类物质都是颇有价值的药用资
源 , 均蕴藏着巨大的市场潜力。
生长在泰山的白花丹参 SalviamiltiorrhizaBge.f.albaC.Y.
WUetH.W.Li是紫花丹参的变型 ,系多年生草本植物。白花丹
参除具丹参的生物活性和用途外 ,对治疗血栓性脉管炎具有独特
疗效 [ 1] 。现在 , 白花丹参已作为一个新品种被收录进《山东省中
药材标准》(2000年版)[ 3] 。通过实验研究 , 证明白花丹参与丹
参的化学成分基本相同 ,含有脂溶性成分丹参酮类 , 水溶性成分
酚酸类 [ 4] 。但是白花丹参中的水溶性成分明显高于紫花丹参 ,
约为紫花丹参的 2倍 , 这是化学成分方面较大的不同 [ 3] , 另外白
花丹参中铁 、镁 、锰等 5种微量元素也高于紫花丹参 [ 5] 。因此 ,白
花丹参具有重要的医药和经济价值。
白花丹参主要分布在山东省泰山及周边地区章丘 、莱芜等
地 , 生于山坡 、林缘草丛 ,属珍稀濒危药用植物 [ 6] , 山东省有少量
栽培 , 但未形成流通商品药材 , 为山东特产药材之一。 由于丹参
有效成分在原植物根中含量低 、生长周期长 , 加之由于近年来环
境恶化和过度采挖 ,原本就罕见的泰山野生白花丹参濒临绝迹边
缘 , 同时栽培产地环境污染和农药使用等原因 , 使得原料药的供
应在数量和质量上都不能满足临床应用的需要。而应用植物基
因工程与组织细胞工程相结合的生物学方法有望成为生产这些
活性药用次生代谢产物最有效的手段。同时 , 丹参染色体数目
少(2n=14), 次生代谢产物种类多(上万种), 具有中药分子
生物学研究模式物种的各种有利条件。而高质量 RNA的获得是
进行丹参分子生物学研究的重要基础。但是由于丹参组织中富
含多糖 、多酚以及各种已知或未知的次生代谢物质 [ 7 , 8] , 用一般
植物 RNA提取方法很难从丹参中获得高质量的 RNA。 近年来 ,
关于富含多糖 、多酚药用植物组织 RNA的提取已有一些报
道 [ 9 ～ 11] ,但目前还没有关于野生白花丹参多年生根部 RNA提取
的报道 。本研究在目前使用较多的几种方法的基础上对常规的
提取方法进行了改进 ,发现改良后的 CTAB法对于提取泰山野生
的白花丹参根总 RNA具有良好的提取效果 , 且步骤较简单 、省
时。产物经琼脂糖凝胶电泳检测 , 所得 RNA质量较好 , 进一步
采用 DDRT-PCR检测分析 ,也表明 RNA的质量可以达到 DDRT
-PCR分析的要求 , 为进行泰山野生白花丹参的分子生物学实
验和保护山东特有的泰山野生白花丹参资源奠定基础。
1　材料与方法
1.1　材料 分别取泰山野生丹参多年生根 、幼茎 、嫩叶 , 采后于
液氮中快速冷冻 , -80℃冻存备用。
异硫氰酸胍 、SDS、CTAB、PVP、饱和酚(pH为 4.5)、LiCl及
PCR试剂均购于上海生工公司;反转录酶购自 TAKARA公司;其
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他试剂为国产分析纯 。
所用试剂均以 0.1% DEPC处理水配置;塑料耗材均预先用
0.1% DEPC水于 37℃下处理 12 h, 然后高压灭菌;研钵和玻璃
器皿经 180 ℃高温烘烤 12 h以上 , 以避免 RNAase的污染。
1.2　RNA提取方法
1.2.1　异硫氰酸胍方法 实验操作按照陈莉等 [ 10]报告的方法
进行。
1.2.2　Trizol试剂快速提取法 试剂购自 Invitrogen公司。取
0.5 g预先冻存的野生泰山白花多年生丹参根和 100 mgPVP放于
装有过量液氮的研钵中充分研磨 , 以下实验操作按照说明书
进行。
1.2.3　CTAB法 参照杜希华等 [ 12]的方法进行。
1.2.4　改进的异硫氰酸胍方法 参照陈莉等 [ 10]的方法 , 并略加
改进:①取 0.5 g预先冻存的野生泰山白花多年生丹参根和
100mgPVP放于装有过量液氮的研钵中充分研磨 , 用预冷的药
匙将丹参粉末转入预先装有冰冷的 3ml异硫氰酸胍缓冲液的离
心管中 , 剧烈振荡 2 min。异硫氰酸胍缓冲液的成分为:4 mol/L
异硫氰酸胍 , 25 mmol/LpH7.5的柠檬酸钠 , 0.5% 的十二烷基
肌氨酸钠 , 用前加 β -巯基乙醇至终浓度为 2%。 ② 4℃,
12 000 r/min离心 10 min, 去除沉淀 ,将上清液转移到另一离心管
中。 ③在离心管中加 1/10体积 2 mol/LNaAc(pH 4.0), 充分
振荡 20s。 ④加入 3 ml饱和酸性酚(pH4.5)和 1 ml氯仿∶异
戊醇(24∶1), 旋涡振荡 3min, 冰浴 15min。 4℃ 12 000 r/min离
心 10min。 ⑤取上清液加入 1/10体积 -20℃预冷的无水乙醇 ,
颠倒混匀 , -20℃沉淀 20 min。 4℃ 12 000 r/min离心 10 min。
⑥取上清液加 1/3体积的 5 mol/LKAc, 混匀 , 冰浴 15 min, 4℃
12 000 r/min离心 10 min。 ⑦取液相加入 2倍体积的 -20℃预
冷的无水乙醇 , -80℃静置 2 h以上。 ⑧4℃ 14 000 r/min离心
15 min, 弃上清 ,沉淀中加 1mlLiCl(4 M), 枪头贴壁轻轻吹打混
匀 , 转入 1.5 ml离心管中 。 ⑨4℃ 14 000 r/min离心 15 min,弃
上清 , 沉淀用 0.4 ml0.1 % DEPC水充分溶解。 ⑩加入 200 μl
酸酚 , 振荡 10s, 200μl氯仿 , 振荡 10s。 4℃ 12 000r/min离心
5min, 吸出上清。 ★11上清中加入等体积氯仿重复抽提 1次 , 4℃
12 000r/min离心 5min。 ★12取上清液加入 1/10体积的 3mol/LNaAc(pH5.2)和等体积的异丙醇 , 混匀 , 置 -20℃冰箱 30 min。★13 4℃ 14 000 r/min离心 30 min, 沉淀用 70 % 的乙醇洗两遍 ,真空干燥。用适量 DEPC水溶解沉淀 , -70℃保存。
1.2.5　优化的 CTAB法 主要参照文献 [ 11]的方法 ,并加以改进:
①取 0.5 g预先冻存的野生泰山白花多年生丹参根和 100 mg
PVP放于装有过量液氮的研钵中充分研磨 , 用预冷的药匙将丹
参粉末转入预先装有 65℃的 CTAB提取缓冲液(W/V=1∶5),振
荡 30 ～ 60 s后 , 于 65℃水浴中继续振荡 2 ～ 5min。 CTAB提取缓
冲液的成分为:2% CTAB, 2% PVP, 25 mmol/LEDTA, 2 mol/L
NaCl, 100 mmol/LTris-HCl, 0.5 g/L亚精胺 , 0.5%皂土 , 用前
加 β -巯基乙醇至终浓度为 2%。 ② 4℃, 12 000r/min离心
10 min, 去除沉淀 ,将上清液转移到另一离心管中。 ③在离心管
中加 1/10体积 2 mol/LNaAc(pH4.0), 充分振荡 20s。 ④加一
倍提取缓冲液体积的饱和酸性酚(pH4.5), 继续振荡混匀;再加
一倍提取缓冲液体积氯仿∶异戊醇(24∶1), 振荡混匀。 4℃,
12 000 r/min离心 10 min。 ⑤取上清液到一新管 , 加入 1/2体积
的 5 mol/LKAc(pH4.8),冰上放置 10min;4℃, 12 000 r/min离
心 10min,取上清。 ⑥在上清液中加入等体积 LiCl(8M), 混匀 ,
冰上放置 1 h。 ⑦ 4℃, 14 000 r/min离心 30 min, 弃上清。 ⑧
500μl0.5% SDS溶解沉淀。 ⑨加入等体积氯仿∶异戊醇(24∶
1)抽提一次。 4℃, 12 000 r/min离心 8min。 ⑩将上清液转到新
管中 , 加入等体积的乙二醇丁醚 , 冰上放置 10 min。 ★11 4℃,
14 000 r/min离心 15 min。去液相 , 沉淀用 70%乙醇洗两次。干
燥 , 溶于适量用适量 DEPC水溶解沉淀。 -70℃保存。
1.3　RNA完整性及纯度检测
1.3.1　RNA电泳分析 RNA的非变性琼脂糖凝胶电泳在 1 ×
TAE中进行 ,琼脂糖浓度为 1%(每 100 ml凝胶中加入 2.5 μl的
EB)。 1 ～ 2μl上样量 , 80V恒压 40 min, 然后在紫外凝胶成像系
统中观察所提取 RNA的完整性。
1.3.2　RNA纯度鉴定 取 1μl样品 , 稀释一定倍数 ,紫外分光光
度计测量其在 230 nm, 260 nm和 280 nm处的紫外吸光值(A)。
计算 A260 /A280 , A260 /A230用于纯度分析和浓度确定 , 根据浓度计算RNA的产量。
1.4　mRNA差异显示
1.4.1　cDNA第一链的合成 RT-PCR按 TaKaRa公司 AMV反
转录酶操作手册进行 ,以改进的 CTAB法提取的丹参根和叶片总
RNA进行反转录 , 合成 cDNA第一链。反转录所用的锚定引物
为 5′-T13 C-3′, 5′-T13 G-3′(上海生工生物工程技术服务公
司合成)。
1.4.2　PCR扩增及产物分离 PCR扩增采用与反转录相同的锚
定引物 ,随机引物(由上海生工生物工程技术服务公司合成)序
列分别为 S367(5′-AGCGAGCAAG-3′), S379(5′-CACAG-
GCGGA-3′), S486(5′-GAGCGCCTTG-3′), S492(5′-AG-
TAGGGACA-3′), S493(5′-GGAGTGGACA-3′)。 PCR反应体
系为 25μl,反应程序为:94℃预变性 2min,然后 94℃变性 30 s,
40℃退火 1 min, 72℃延伸 2 min, 40个循环后 72℃延伸 7 min。
取 5 μlPCR扩增产物 , 在 1.8%的琼脂糖凝胶电泳分离约 2 h,
照相。
2　结果
2.1　不同方法提取白花丹参总 RNA的质量比较 首先参照陈莉
等介绍的异硫氰酸胍法 、杜希华等报告的 CTAB法 、Trizol法 3种
方法 , 提取泰山白花丹参多年生根的总 RNA, 结果发现 Trizol法
所提取的 RNA电泳时点样孔中有大量蛋白质和多糖物质 , RNA
降解比较严重(见图 1), 陈莉等介绍的异硫氰酸胍法和杜希华
等报告的 CTAB法点样孔中虽也有大量蛋白质和多糖物质 ,也有
部分 RNA降解 ,但比 Trizol法提取的 RNA质量好(见图 1)。 因
此 , 选择对异硫氰酸胍法和 CTAB法进行优化 , 以期获得步骤较
简单 , 省时和高质量的丹参 RNA。
改进的异硫氰酸胍法中采用低浓度的乙醇(10% ～ 20% )、
高浓度的乙酸钾(pH<5.8, 5 mol/L)来沉淀多糖及次生代谢
物 , 结果发现这些步骤确能提高 RNA的质量。优化的 CTAB法
中加入 0.5%皂土 ,高浓度的乙酸钾(pH<5.8, 5 mol/L), 并采
用高浓度LiCl(8M)后 ,冰上放置短时间(1h)沉淀RNA, 电泳结
果发现大大提高了 RNA的质量 ,且缩短了提取时间。
我们选择了提取时间短的优化后的 CTAB法进一步验证该
方法对泰山白花丹参茎 、叶及多年生根 RNA的提取效果 , 电泳
结果表明 RNA质量均十分良好 ,能看到清晰的 28 S和 18S两条
主带 , 5S带也很清楚 ,但比较而言 , 叶片提取的 RNA质量好于
多年生根提取的 RNA(见图 2)。
1.优化的 CTAB法 2.改进的异硫氰酸胍法
3.杜希华等报告的 CTAB法 4.陈莉等介绍的异硫氰酸胍法 5.Trizol法
图 1　不同方法提取白花丹参总RNA的琼脂糖凝胶电泳
2.2　不同方法提取白花丹参总 RNA的纯度和产量比较 纯 RNA
溶液的 A260 /A280比值应介于 1.7 ～ 2.0, A260 /A230比值应大于 2.0。
不同提取方法获得的 RNA的纯度和产量分析显示(见表 1), 异
硫氰酸胍法 、杜希华等报告的 CTAB法 、Trizol法 3种方法的纯度
和产量均不理想。改进的异硫氰酸胍法和优化后的 CTAB法的
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A260 /A280的比值均很好 , 但改进的异硫氰酸胍法提取的 RNA的A260 /A230的比值为 1.86, 显示仍有异硫氰酸胍残留。 优化后的CTAB法的 RNA产量也高于改进的异硫氰酸胍法 ,分别是 306.62
和 201.74μg/g.FW,可能由于后者步骤繁多 , 导致改进的异硫氰
酸胍法 RNA产量较低。
1.茎　 2.叶　 3.根
图 2　优化的 CTAB法提取白花丹参不同组织的总RNA
表 1　各种方法提取白花丹参 RNA的纯度和产量比较
不同方法 不同组织 A260 /A280 A260 /A230 RNA产量 /μg· g-1
异硫氰酸胍法 多年生根 1.33 1.614 322.32
CTAB法 多年生根 1.55 1.443 338.24
Trizol法 多年生根 1.38 0.986 247.85
改进的异硫氰酸胍法 多年生根 1.96 1.84 201.74
优化的 CTAB法 多年生根 1.87 2.11 306.62
茎 1.82 2.01 275.23
叶 1.93 2.13 398.12
2.3　mRNA差别显示检测 RNA的质量 以优化的 CTAB法提取
的 RNA为模板进行反转录 ,用 5′-T13 C-3′和 5′-T13 G-3′
两个锚定引物分别与上述 5个随机引物组合 , DDRT-PCR方法
比较白花丹参多年生根和叶片的 mRNA扩增带型差异(见图 3)。
从图 3可以看出 , 每对引物组合都可获得 10 ～ 30条 cDNA扩增
带 , cDNA条带长度主要集中在 250 ～ 2 000 bp之间 , 并且显示差
异带明显 , 说明这些 cDNA扩增带的丰度及长度均能满足 DDRT
-PCR技术的要求 ,进一步证明优化的 CTAB法提取的泰山野生
白花丹参多年生根总 RNA质量很好 , 能够满足后续分子生物学
实验的要求。
　　泳道 1、3、5、7、9:根提取的 RNA;泳道 2、 4、 6、 8、10:叶提取的 RNA;
泳道 M:DNA分子量标准(从上到下分子量大小:3000, 2000, 1500, 1000,
750, 500, 250, 100bp);泳道 1、 2的锚定引物:5′-T13G-3′,随机引物:
S367;泳道 3、4的锚定引物:5′-T13G-3′,随机引物:S379;泳道 5、6的锚
定引物:5′-T13G-3′,随机引物:S492;泳道 7、 8的锚定引物:5′-T13C
-3′,随机引物:S486;泳道 9、 10的锚定引物:5′-T13C-3′, 随机引
物:S493
图 3　白花丹参根和叶 mRNA差异显示
3　讨论
分离纯净 、完整的 RNA对于分子克隆实验是很重要的 ,而且
是进行基因表达分析的基础。但由于不同的药用植物的次生代
谢产物随种质和生长环境不同而存在较大差异 , 多糖 、酚类物质
等影响 RNA提取的主要因素的种类和含量存在差异 , 所以一般
来说 , 不同的植物材料必须经过摸索和实践而采取不同的 RNA
提取方法。
本实验首先在异硫氰酸胍法的基础上 , 通过酸酚变性法 [ 13]
综合 NaAc选择沉淀法 [ 14] , 去除 DNA彻底 , 排除了其对后继实
验的干扰。多糖及次生代谢物的污染是提取植物总 RNA时 , 常
遇到的一个棘手问题。本实验分别用低浓度乙醇 、醋酸钾共同沉
淀匀浆上清液中的多糖及次生代谢物 , 取得较好的效果。同时 ,
采用 LiCl选择性地沉淀 RNA, 获得的 RNA纯度也较高 , 多糖去
除的也较好 [ 15] , 但由于此方法步骤繁琐 , 需要较长时间 , 导致
RNA产量较低。
为此 , 我们又继续在 CTAB法的基础上优化该方法。皂土具
有吸附蛋白质及有效抑制 Rnase的特性 [ 16 , 17] 。 利用这些特性 ,
将皂土加入到 RNA提取缓冲液 ,早期抑制及吸附样品中的 Rnase
等蛋白质 ,从而减少了后期用酚 /氯仿抽提去蛋白的次数 ,节省了
实验时间 ,有利于减少 RNA的降解 , 降低 RNA的损耗。另外在
沉淀之前加入 1/2体积的 5MKAc(pH4.8),有利于去除样品中
的多糖 ,提高样品的质量 [ 18];而沉淀使用乙二醇丁醚代替传统的
异丙醇和无水乙醇能有效的去除样品中的多酚类物质 [ 19] 。另外
我们还采用高浓度 LiCl(8M), 冰上放置短时间(1 h)沉淀 RNA,
大大节省了提取时间。可见本研究采用优化的 CTAB法提取到
了高质量的泰山白花丹参多年生根总 RNA, 具有简单 、经济 、高
效的特点 , 提取的 RNA可用于 cDNA文库的构建 、RT-PCR和
Northern杂交等分子生物学实验。
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