全 文 ：1 种华钩藤植物的分子鉴定
朱爽1，周林1，杨梅宝1，黄宏靓1，孙悦2，曾常青2
(广东药学院 1．生命科学与生物制药学院;2．中药学院，广东 广州 510006)
摘要:目的 以核糖体转录间隔区(rDNA ITS)序列为分子标记，对 1 种华钩藤植物进行遗传分析与分子
鉴定。方法 通过改良 CTAB法提取样品总 DNA，利用通用引物对 rDNA ITS 序列进行 PCR 扩增，经克
隆、测序后，运用 Clustal X、BioEdit和 PAUP等软件进行序列分析和构建系统发育树。结果 测序得到样
品的 rDNA ITS区序列长度为 719 bp，序列分析结果显示其与 Genbank 中已有的华钩藤［Uncaria sinensi
(Oliv．)Havil．］rDNA ITS区序列之间相似性达 99. 4%，并且在系统发育树中并排聚类成 1 支。结论 基
于 rDNA ITS区序列的测序分析和系统发育树构建的分子生物学方法，能够对华钩藤植物进行准确的分
子鉴定，为钩藤属中药材的种类鉴定和种间分类提供分子生物学理论依据。
关键词:华钩藤;ITS序列;分子鉴定
中图分类号:R282． 5 文献标志码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1006-8783． 2012． 01． 008
文章编号:1006-8783(2012)01-0029-04
Molecular identification of one species of Uncaria sinensis (Oliv．)Havil．
ZHU Shuang1，ZHOU Lin1，YANG Mei-bao1，HUANG Hong-liang1，SUN Yue2，ZENG Chang-qing2
(1． School of Life Science and Biopharmacology;2． School of Traditional Chinese Medicine，Guangdong
Pharmaceutical University，Guangzhou 510006，China)
Abstract:Objective In order to clarify the phylogenetic relationship of one species of Uncaria sinensis(Oliv．)
Havil，molecular identification and genetic analysis were carried out by using the rDNA ITS sequence as
molecular marker．Methods Molecular identification and genetic analysis were carried out with the rDNA ITS
sequence as molecular marker． Total DNA was extracted with modified CTAB method and thereby rDNA ITS
regions were amplified with universal primer，sequenced and phylogenetic analysed with Clustal X，BioEdit and
PAUP． Results The entire rDNA ITS sequence of Uncaria was 719 bp． Sequence analysis showed that the
rDNA ITS sequence was closely related to Uncaria sinensis (Oliv．)Havil available in GenBank and the
similarity reached 99. 4% ． Conclusion Based on molecular biology methods of rDNA ITS region analysis，
molecular identification is useful in accurate classification on Uncaria sinensis (Oliv．)Havil．，which provides
molecular evidence of taxonomy and identification of different species in genus Uncaria．
Key words:Uncaria sinensis;ITS Sequence;molecular identification
收稿日期:2011-11-10
基金项目:广东省自然科学基金(8451022401001607) ;广东省中山市科技局资助项目(20101H017)
作者简介:朱爽(1977 －) ，男，讲师，主要从事中药分析与鉴定研究，电话:020-39352201，Email:wenchengji@ yahoo． com． cn;
通信作者:曾常青，电话:020-39352181，Email:gdzcq@ 163． com。
网络出版时间:2012-01-09 15:29 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /44． 1413． R． 20120109． 1529． 004． html
钩藤为茜草科钩藤属植物，别名又叫大钩丁、双
钩藤，主产于广西、贵州、湖南、广东等地［1］。2010
年版《中国药典》规定钩藤药材来源为茜草科植物
钩藤 Uncaria rhynchophylla(Miq．)Jack．、大叶钩藤
Uncaria macrophylla Wall．、华钩藤 Uncaria sinensis
(Oliv．)Havil．、毛钩藤 Uncaria hirsute Havil．和无柄
果钩藤 Uncaria sessilifructus Roxb． 5 种 ［2］。化学成
分研究表明，钩藤的主要有效成分是生物碱，其中以
钩藤碱与异钩藤碱为主，具有降血压、镇静、抗血小
板聚集和抗血栓形成的作用［3］。
广东药学院学报
Journal of Guangdong Pharmaceutical University Feb． 2012，28(1)
钩藤以野生为主，由于过量采割，现产量锐减。
钩藤药材使用广泛，由于其来源比较复杂，且各品种
间外形极其相似，市场上销售的钩藤伪品较多，出现
互混、互代、以次充好等现象，影响了用药的安全性
和有效性。为了更准确、安全地使用钩藤中药材，利
用分子标记技术鉴定钩藤属植物的归属及种间关系
是非常必要的。分子生物学技术已在药用植物的分
子系统发育分析中广泛应用［4］，但少见钩藤属植物
种间关系分子鉴定的相关报道，仅有陶刚等人对贵
州钩藤属中药材原植物进行分子鉴定并归类到
属［5］。
本研究采用分子生物学技术，对据形态特征初
步鉴定为华钩藤的 1 种钩藤属植物的 rDNA ITS 区
序列进行序列测定并构建其系统发育树，并与
GenBank中已有茜草科钩藤属中药材 rDNA ITS 区
序列进行比对分析，将该钩藤样品归类到种，从遗传
本质上对该钩藤的分类和种间关系提供分子学依据。
1 材料、试剂与仪器
1． 1 材料
钩藤样品于 2011 年 3 月采集于贵州省麻江县，
由广东药学院曾常青教授鉴定。该植物茎枝呈方柱
形，节上有时有全缘的托叶宿存，钩端渐尖向内卷，
基部扁阔，表面黄绿色或黄棕色，折断面外层黄棕
色。将采集到的新鲜叶片直接放入含有硅胶的密封
袋中快速干燥，备用。或于 48 h内进行钩藤总 DNA
提取。
1． 2 试剂与仪器
TaqDNA 聚合酶、10 × Taq 缓冲液、dNTP、
pMD18-T-Vecter［TaKaRa宝生物工程(大连)有限公
司］，PCR 扩增引物合成(上海生工生物工程有限公
司) ，琼脂糖(BIOWEST) ，Applied Biosystems PCR仪
(2720 Thermal cycler PCR，美国 ABI 公司) ，Tanon-
4100 全自动数码凝胶图像分析系统(上海天能公
司) ，JY600C电泳仪(北京君意东方电泳设备有限
公司)。
2 方法
2． 1 钩藤样品总 DNA提取
采用改良 CTAB法［6］提取钩藤样品总 DNA:在
预冷的灭菌研钵中，将 0． 5 g 干叶片在液氮中研磨
至粉末状。每 1 g样品加入 65 ℃预热的 CTAB裂解
液［4%(质量分数)CTAB、100 mmol·L －1 Tris-HCl、
25 mmol·L －1 EDTA、1． 4 mol·L －1 NaCl、2%(质量
分数)β-巯基乙醇、1%(质量分数)PVP，pH 8． 0］
5 mL，充分混匀后按每 1 mL 混合液分装到 1． 5 mL
离心管中，并于 65 ℃温育 2 h，期间每隔 15 ～ 20 min
颠倒振荡 1 次。上述混合液于 4 ℃、12 000 r·
min －1离心 5 min，吸取上清液，用等体积的 Tris饱和
酚抽提 2 次，酚-三氯甲烷-异戊醇(体积比 25∶ 24∶ 1)
和三氯甲烷-异戊醇(体积比 24∶ 1)各抽提 1 次。重
复以上操作直至 2 相分层处无明显杂质。然后于
4 ℃、12 000 r·min －1离心 5 min，取上清液，加入
NaAc(pH 5. 2) ，使溶液终浓度达到 0． 3 mol·L －1，
再加入 2． 5 倍体积的无水乙醇，于 － 20 ℃沉淀 1 h，
吸出 DNA 至 1． 5 mL 离心管中，分别加入 70%(体
积分数)冷乙醇 1 mL洗涤 2 次，无水乙醇洗涤 1 次，
风干后溶于 50 μL 无菌 1 × TE 缓冲液中，－ 20 ℃保
存，备用。
2． 2 PCR扩增
选择扩增植物 rDNA ITS 序列的通用引物 ［7 － 8］
ITS5 (5GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG3)和 ITS4
(5 TCCTCCGCTTATTGATATGC3)对样品总 DNA
进行 rDNA ITS序列的扩增。在 20 μL的 PCR反应
体系中含有 10 × PCR buffer (2. 5 mmol·L －1，含
MgCl2)2 μL，dNTP (10 mmol·L
－1)0． 4 μL，引物量
为 10 pmol，rTaq(5 U·μL －1)0． 2 μL，加入约 50 ng
的模板 DNA，其余体积以无菌超纯水补足。
PCR扩增反应过程为:95 ℃预变性 3 min，94 ℃
变性 1 min，52 ℃退火 50 s，72 ℃延伸 50 s，循环 35
次，最后在 72 ℃延伸 10 min。
2． 3 PCR产物纯化、连接和转化
样品 rDNA ITS序列的 PCR扩增产物(大约 720
bp)在紫外灯下从 1%(质量分数)的琼脂凝胶进行
割胶并采用 DNA 凝胶回收试剂盒回收。纯化后与
pMD18-T-Vecter连接，连接产物转化 Escherichia coli
DH5-α感受态细胞，并进行氨苄青霉素抗性和蓝白
斑筛选。
2． 4 测序及序列分析
挑取重组单克隆摇菌后送华大基因科技股份有
限公司测序，序列与 GenBank 中已有的 ITS 区序列
进行比较分析。其中序列之间的比较分析通过
Clustal X(版本 1． 8)比对和 BioEdit 计算。应用
PAUP软件(版本 4． 0 b10) ，使用最大简约法计算及
构建系统进化树，用 Bootstrap 值检验系统树上各节
点的置信水平，使用 TREEVIEW进行查看。
03 广东药学院学报 第 28 卷
3 结果与讨论
3． 1 钩藤样品总 DNA提取
取钩藤样品总 DNA 2 μL，用 SYBR Green I 染
色 10 min后进行 1%(质量分数，下同)琼脂糖凝胶
电泳，Tanon-4100 全自动数码凝胶图像分析系统记
录结果，见图 1。钩藤样品的总 DNA 条带清晰明
亮，说明改良 CTAB 法提取的钩藤总 DNA 完整性
好，可进行后续实验。
1． Marker (DL2 000) ;2．钩藤样品总 DNA。
图 1 钩藤样品总 DNA的琼脂糖凝胶电泳图
Figure 1 Sepharose gel electrophoresis results of total DNA
3． 2 钩藤样品 rDNA-ITS区 PCR扩增
将钩藤样品总 DNA模板分别按 1、10、100、1 000、
10 000 倍数稀释后，进行 rDNA-ITS 序列的 PCR 扩
增。由 PCR浓度梯度扩增的结果可知，模板浓度在
稀释倍数为 1 ～ 10 时，rDNA ITS 序列能被高效扩
增。在模板最佳浓度(将钩藤样品总 DNA 模板稀
释 10 倍)下，钩藤样品 rDNA-ITS 序列 PCR 扩增产
物的 1%琼脂糖凝胶电泳结果见图 2。由图可知，在
模板最佳浓度下，钩藤样品 rDNA-ITS 序列 PCR 扩
增产物主带清晰，无非特异性条带，大小约为 720
bp。由此可知，在模板最佳浓度下，钩藤碱等抑制物
对 PCR扩增的影响较小，ITS 序列片段能得到有效
扩增。
3． 3 ITS区序列分析
挑取 3 个单克隆测序，获得钩藤样品 rDNA ITS
序列的长度为 719 bp。把获得的 rDNA ITS 序列与
GenBank中已有的 rDNA ITS序列进行比较分析，得
到与之亲缘关系相近的序列。通过对序列之间进行
Clustal X比对和 BioEdit计算，发现该样品与国际基
因数据库 GenBank 中已有的华钩藤 (Uncaria
sinensis，FJ980386)的相似性为 99． 4%，因此可将该
钩藤植物归类为华钩藤 Uncaria sinensis。
1．钩藤样品;2． Marker (DL2000)。
图 2 模板最佳浓度条件下 PCR扩增结果
Figure 2 PCR results of the optimal template concentration
3． 4 分子系统发育分析
将钩藤样品的 rDNA ITS 序列与 GenBank 中已
有的 rDNA ITS序列进行比较，得到与之亲缘关系相
近的钩藤属其他种的序列和与之亲缘关系相近属的
序列。采用最大简约法分析，并以 Nauclea subdita
(AJ346876)和 Nauclea xanthoxylon(AJ346877)为外
群建立样品的最大简约树，见图 3。
图 3 华钩藤样品的最大简约树
Figure 3 MP phylogenetic tree based on ITS sequences of Uncaria sinensis (Oliv．)Havil．
13第 1 期 朱爽，等． 1 种华钩藤植物的分子鉴定
从图 3 可知，样品 ITS 序列与 GenBank 中已有
的华钩藤 ITS 序列(FJ980386)聚类成为 1 支，
bootstrap可信度分析达 91%，相似性为 99. 4%，接
着又依次与钩藤属的其他 3 个种，即钩藤(U．
rhynchophylla，AJ346900)、毛钩藤(U． hirsute havil，
GU937110)和无柄果钩藤(U． sessilifructus Roxb．，
GU937111)的 ITS 序列聚类成为 1 支。另外，从遗
传学的角度分析，该样品 ITS 序列与 GenBank 中已
有的华钩藤序列(FJ980386)亲缘关系最近，其序列
之间的相似性高达 99． 4%。因此，从遗传基础上支
持了据形态特征把该钩藤属中药材鉴定为华钩藤的
初步结论。
rDNA ITS 序列是用来研究药用植物种内变异
和种间、近缘属间分子系统关系的重要分子标记之
一［9］。本研究分析了 1 种采自贵州省麻江县，据形
态特征初步鉴定为华钩藤的钩藤属植物的 rDNA
ITS序列，并结合 GenBank 中已有的钩藤属 rDNA
ITS序列，构建了钩藤属植物分子系统发育树，并确
定了该钩藤品种的分类。这丰富了钩藤属中药材的
种类鉴定和种间分类的理论依据，有利于钩藤属植
物资源的开发和有效利用。
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(责任编辑:刘晓涵
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美国 FDA批准 Zioptan用于治疗眼内高压
美国 FDA于 2012 年 2 月 10 日批准默克公司生产的 tafluprost 滴眼液(商品名为 Zioptan)用于开角型青光眼
患者降低眼内压。
该药同时获准用于普通眼内压过高的患者。眼内压过高是青光眼的重要危险因素，而青光眼在美国是导致
失明的第二大病因。Zioptan获得批准，为广大患者提供了一个新的治疗选择。
Zioptan为 0． 0015%滴眼液，其成分为一种前列腺素类似物，每晚滴用 1 次。在一项为期 24 个月的临床研究
中，患有开角型青光眼或者眼内高压的患者在滴用本药 3 个月和 6 个月时，眼内压均有下降。
最常见眼不良反应是结膜充血。滴用 Zioptan 的人虹膜颜色可能会变暗，这个改变可能是永久性的;眼睑的
颜色也可能变暗，但这个变化可能是可逆的。此外，使用 Zioptan 的人会出现睫毛生长现象，睫毛长度、厚度和睫
毛数量均出现增长。
(来源:FDA政府公告 2012-02-14 夏训明编译)
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