全 文 ：·中药与天然药物·
两种大叶钩藤 ITS序列的 RFLP分析
朱　爽1 ,陈剑平1 ,刘嘉敏1 ,周 　林1 , 孙　悦2 , 曾常青2＊(1.广东药学院生命科学与生物制药学院 广州
510006;2.广东药学院中药学院 广州 510006)
摘要:目的　通过对两种不同产地大叶钩藤(Uncaria macrophylla Wall.)的核糖体内转录间隔区(rDNA ITS)序列进行 RFLP 遗传分析 , 研究不
同地理区域大叶钩藤的 rDNA ITS 序列是否具有生物地理上的差异。方法　通过 CTAB法提取样品 DNA ,利用通用引物对其 rDNA ITS 进行
PCR扩增 ,从而对连接转化后扩增得到的 rDNA ITS序列进行限制性片段长度多态性(Rest riction Fragment Length Polymorphism , RFLP)分析。
结果　获得采集自广东肇庆鼎湖山和广西植物园的两种大叶钩藤两种限制性内切酶(Msp Ⅰ & HaeⅢ)酶切图谱。结论　基于对 rDNA ITS
序列进行的 RFLP 分析 ,表明这两个地区的大叶钩藤 rDNA ITS 序列并无明显差异 ,不同地理区域的大叶钩藤其遗传本质不具有地理差异。
关键词:大叶钩藤;ITS序列;RFLP 分析
中图分类号:R282.71　文献标识码:A　文章编号:1006-3765(2012)-01-0042-03
作者简介:朱　爽 ,男(1977-)。讲师 ,主要从事中药分析与鉴定研
究。联系电话:(020)39352201 , E-mail:wenchengji@yahoo.com.cn
＊通讯作者:曾常青。 联系电话:(020)39352181 , E-mail:gdzcq@
163.com
基金项目:广东省自然科学基金资助项目(8451022401001607)
ITS sequence RFLP analysis of two Uncaria macrophylla Wall from differ-
ent regions
ZHU Shuang1 ,CHENJian-ping1 ,LIU Jia-min1 , ZHOU Lin1 , SUN Yue2 , ZENG Chang-qing2(1.School of Life Sci-
ence and Biopharmacology , Guangdong Pharmaceut ical University ,Guangzhou 510006 ,China;2.School of Phar-
macy , Guangdong Pharmaceutical University , Guangzhou 510006 ,China)
ABSTRACT:OBJECTIVE　In order to demonst rate the geog raphical and biologic dif ferences of Uncaria macro-
phylla Wall , genetic analysis of tw o Uncaria macrophy lla Wall w ith dif ferent regions w as carried out.METHODS
　Firstly , Total DNA was ex tracted with CTAB method.Secondly , rDNA ITS regions were amplified wi th uni-
versally conserved primer.Finally , the rDNA ITS amplicon w as characterized by RFLP (Restriction Fragment
Length Polymorphism ,RFLP)analyses.RESULTS　The M sp I-and Hae Ⅲ-based RFLP pat terns of rDNA ITS
from two kinds of Uncaria macrophy lla Wall w ere obtained ,which collected from Dinghushan biosphere reserve ,
Zhaoqing Ci ty ,Guangdong and Guangx i Bo tanical Garden.CONCLUSION　Based on molecular biology methods
of rDNA ITS region RFLP analysis , the two reg ions of Uncaria macrophy lla Wall have no Signif icant geog raphical
differences.
KEY WORDS:Uncaria macrophy lla Wall;ITS Sequence;RFLP analysis
　　大叶钩藤(Uncaria macrophylla Wall)为茜草科钩藤属植
物 ,为常用中药 , 自古用作清热平肝 ,熄风镇惊药。用于治疗
头晕目眩 、惊痫抽搐 、全身麻木等心脑血管和神经系统疾病。
现已成为治疗高血压方剂中常用药物〔1〕。大叶钩藤正品的茎
枝呈方柱形 ,四面有纵凹陷 , 钩端有的膨大如珠 , 钩基部圆或
扁平 ,长达 2.5cm , 表面灰棕色 ,密被褐色或锈褐色长柔毛 ,节
处更密 , 折断面有髓或中空〔2〕。继 1973 年 J.David 等〔3〕报道
大叶钩藤叶含钩藤碱 、异钩藤碱 、柯诺辛碱和柯诺辛碱 B 后 ,
杨君等〔4〕在 2000 年报道了大叶钩藤钩茎中包括乌苏酸在内
的 6 个非生物碱成分 , 而在 2010 年李国成等〔5〕还报道了大叶
钩藤根部中包括 β-谷甾醇在内的 6 个化合物成分。随着众多
研究人员对大叶钩藤整个植株的化学成份研究 , 大家对其各
部分的化学成分有了进一步的了解 , 同时也引起了国内外学
者对大叶钩藤在现实生活中应用的关注 , 特别是其中乌苏酸
成分具有抗肿瘤的作用 。
由于钩藤药材的广泛应用 , 加之某些地区的品种濒危 , 导
致市场上出现钩藤互混 、互代 、以次充好的现象 ,影响了用药
的安全性和有效性。本研究采用了传统鉴定方法以外的新兴
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海峡药学　2012年　第 24卷 第 1期
分子生物学技术 ,以核糖体转录间隔区(rDNA ITS)序列为分
子标记 , 对两种采自不同区域大叶钩藤(Uncaria macrophylla
Wall)的 rDNA ITS 序列进行限制性片段长度多态性(Restric-
tio n F ragment Length Polymorphism , RFLP)分析 , 从遗传本质
上揭示大叶钩藤(Uncaria macrophy lla Wall)是否具有生物地
理差异 ,为大叶钩藤的分类地位和种内鉴定提供分子证据 ,从
而增加钩藤中药材使用的安全性和准确性。
1　材料
实验用的大叶钩藤(Uncaria macrophy lla Wall)分别采集
于广东肇庆鼎湖山和广西植物园 , 均由广东药学院曾常青教
授提供并鉴定。植物茎枝钩形状弯曲成长沟状 ,表面黄绿色 ,
叶对生。新鲜采集的叶片最好在 48h 内进行钩藤总 DNA 提
取 ,也可以直接放进含有硅胶的密封袋中快速干燥备用。
2　方法
2.1　大叶钩藤总 DNA 的提取　采用 CTAB 法提取植物总
DNA:称取 0.5g 新鲜干叶片或茎枝 , 放在预冷的灭菌研钵中 ,
加入适量的液氮研磨至粉末状。其中研磨后的每 1g 样品加
入 5mL 65℃预热的 CTAB 裂解液(CTAB 4%, T ris-HCl
100mmol· L-1 , EDTA 25mmol· L-1 , NaCl 1.4mol· L-1 ,
PVP1%,β-巯基乙醇 2%, pH 8.0), 充分混匀后按每 1mL 混
合液的量分别分装到 1.5mL Eppendo rf管中 ,并于 65℃水浴
2h ,期间每隔 10min 颠倒振荡 1 次。 室温冷却后 , 离心 5min
(4℃, 12000r·min-1),吸取上清液后用等体积的酚-氯仿-异戊
醇(体积比为 25∶24∶1)抽提两次 , 再用氯仿-异戊醇(体积比为
24∶1)抽提 1 次 , 可根据杂质情况 , 重复以上操作直至两相分
层处没有明显的杂质(每次抽提后离心 5min , 4℃, 12000r·
min-1)。取上清液并加入 0.8 倍体积的异丙醇和 1/10 体积
(最终体积)的 NaAc(pH 5.2), 使溶液终浓度达到 0.3mo l·
L-1 ,于-20℃静置沉淀 1h。弃上清 , 沉淀 DNA 先用 1mL 无
水乙醇洗涤 ,接着用 1mL 70%冷乙醇洗涤 2 次 , 最后再用无
水乙醇洗涤1 次(每次洗涤后离心 5min , 4℃, 12000r·min-1),
风干后溶于 50μL无菌 TE 缓冲液中 , -20℃保存备用。
2.2　PCR扩增　选择扩增植物 rDNA ITS 序列的通用引
物〔6 , 7〕(上海生工生物工程公司合成)ITS5(5′GGAAG-
TAAAAGTCGTAACAAGG3′)和 ITS4 (5′ TCCTCCGCT-
TATTGATATGC3′)对大叶钩藤总 DNA进行 rDNA ITS 序列
的扩增。在 20μL 的 PCR 反应体系中含有 10×PCR buffer
(2.5mmol·L-1 , 含 MgCl2)2μL , dNTP(10mmol·L-1)0.4μL ,
引物量为 10pmol , rT aq(5U·μL-1)0.2μL ,加入约 50ng的模板
DNA ,其余体积以无菌超纯水补足。 PCR 扩增反应过程为:
95℃预变性 3min , 94℃变性 1min , 52℃退火 50s , 72℃延伸
50s ,循环 35 次 ,最后在 72℃延伸 10min。 PCR 仪型号为 Ap-
plied Biosystems(2720 Thermal cycler PCR)。
2.3　PCR产物纯化 、连接和转化　在紫外灯下 , 将大叶钩藤
rDNA ITS 序列的 PCR 扩增产物(大约 720bp)从 1%的琼脂
凝胶进行割胶并采用 DNA 凝胶回收试剂盒回收。纯化后与
pMD18-T-Vecter 连接 , 连接产物转入 Escherichia coli JM109
感受态细胞 ,并进行氨苄青霉素抗性选择和蓝白斑筛选。
2.4　菌落 PCR及酶切分型　用 ITS5 和 ITS4 引物对含有
rDNA ITS 序列插入片段的单克隆菌落进行 PCR , 其 PCR 产
物用于限制片段长度多态性(RFLP)分析 ,分别用两种限制性
内切核酸酶(MspⅠ和 HaeⅢ)于 37℃恒温水浴 1.5h ,再 65℃
水浴 10min。最后经过酶切的 DNA 片段用 SYBR GreenⅠ染
色后 , 用 1.5%琼脂糖凝胶电泳分离 , 经 Tanon-4100 全自动数
码凝胶图像分析系统扫描成相 , 对得到的目的 DNA 片段带
型图谱进行比较 , 分析电泳结果。
图 1　样品总DNA 的
琼脂糖凝胶电泳图
1:大叶钩藤(广东肇庆鼎湖
山);2:Marker(DL2000);3:大
叶钩藤(广西植物园)
图 2　最佳模板浓度
条件下 PCR结果
1:Marker (DL2000);2:大叶
钩藤(广东肇庆鼎湖山);3:大
叶钩藤(广西植物园)
3　结果与讨论
3.1　总 DNA 提取结果　用 50μL TE 缓冲液回溶两种大叶
钩藤的总DNA , 各取2μL总样品 DNA ,用 SYBR GreenⅠ染色
后进行 1%琼脂糖凝胶电泳 , 经 Tanon-4100 全自动数码凝胶
图像分析系统记录结果(见图 1)。 两种大叶钩藤样品的总
DNA主条带清晰 , 无明显降解 , 提取的总 DNA 片段完整性
好 , 而且两种大叶钩藤的总 DNA 条带位置一致 , 说明它们的
总 DNA分子量大小是一样的。
3.2　大叶钩藤 rDNA ITS 区 PCR 扩增结果　大叶钩藤总
DNA模板按 1 、10、102、103、104 的稀释倍数稀释后 ,进行 rD-
NA ITS 序列的 PCR 扩增。从 PCR浓度梯度扩增的结果可
知 , 模板稀释倍数在 10 ～ 102 之间时 , rDNA ITS 序列能够被
高效扩增。在最佳模板浓度下 , 大叶钩藤样品 rDNA ITS 序
列 PCR扩增产物的 1%琼脂糖凝胶电泳结果(见图 2)。由图
可知 , 大叶钩藤 rDNA ITS 序列 PCR 产物的主带清晰 ,无非
特异性扩增条带 , 大小约为 720bp , 而且两种大叶钩藤 rDNA
ITS 序列 PCR产物的条带大小一致。由此可知 , 在模板最佳
浓度下 , 钩藤碱 、EDTA等抑制物对 PCR扩增的抑制性最低 ,
能够高效地扩增出大叶钩藤 rDNA ITS 序列。
3.3　酶切分型结果　如图3所示 ,泳道 1 、2 分别是用核酸限
制性内切酶 Msp I 对采集自广东肇庆鼎湖山 、广西植物园两
种大叶钩藤 rDNA ITS 序列 PCR 扩增产物进行酶切后得到
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Strait Pharmaceutical Journal Vol 24 No.1 2012
图 3　两种大叶钩藤 rDNA ITS
序列片段的 RFLP 带型图谱
1:大叶钩藤(广东肇庆鼎湖山 ,
MspⅠ);2:大叶钩藤(广西植物
园 , Msp Ⅰ ); 3: Marker
(DL2000);4:大叶钩藤(广东肇
庆鼎湖山 , HaeⅢ);5:大叶钩藤
(广西植物园, HaeⅢ)
的 RFLP 带型图谱;泳道 4、5
分别是用核酸限制性内切酶
HaeⅢ对采集自广东肇庆鼎湖
山 、广西植物园两种大叶钩藤
rDNA ITS 序列 PCR 扩增产
物进行酶切后得到的 RFLP
带型图谱。MspⅠ 、HaeⅢ分别
进行单酶酶切的图谱条带主
带清晰 , 而且各条带的位置相
一致 , 我们认为这两种大叶钩
藤 rDNA ITS 区 Msp Ⅰ 、Hae
Ⅲ的 RFLP 带型图谱没有明
显的生物地理差异。从两种
限制性内切酶(MspⅠ & Hae
Ⅲ)酶切图谱可以得知:采集
自广东肇庆鼎湖山 、广西植物
园的两种大叶钩藤 rDNA ITS
序列并没有明显的生物地理
差异 , 不同生长区域的同种大
叶钩藤具有相同或相似的分
子系统发育关系。 rDNA ITS 序列是用来研究药用植物种内
变异和种间 、近缘属间分子系统关系的重要分子标记之一〔8〕 ,
rDNA ITS 序列在大多数生物中趋于保守 , 在生物种间变化
小 ,而内转录间隔区 ITS1 和 ITS2作为非编码区 ,承受的选择
压力较小 , 碱基替换速率较快 , 进化速度快 , 加上片段长度变
异很小 , ITS1 和 ITS2 的长度均不足 300bp ,在绝大多数被子
植物中不足 700bp ,非常适合进行各种分子操作〔9〕 , 所以能够
提供详尽的系统学分析所需要的可遗传性状。通过对 rDNA
ITS 序列进行 RFLP 分析的分子生物学方法 , 能够为大叶钩
藤的种类鉴定和种间的分类地位提供分子生物学理论依据。
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