全 文 ：[文章编号 ] 　1000-4718(2010)04-0725-05
　[收稿日期 ] 2009-08-11　　　　[修回日期 ] 2010-01-06
＊[基金项目 ]山东省科技攻关资助项目(No.2006GG2202037);山东省教育厅资助课题(No.J06L20)
■通讯作者 Tel:0538-6237431;E-mail:qlzhang@tsmc.edu.cn
白花丹参对大鼠脑缺血再灌注致线粒体
损伤及细胞凋亡的影响＊
张秋玲 1■ , 　孙远标 2 , 　王海英 1 , 　宋述杰3 , 　白　波 1
(1泰山医学院生理教研室 , 2泰安市中医医院脑病康复科 , 3泰山医学院临床医学系 , 山东 泰安 271000)
　　[摘　要 ] 　目的:通过观察白花丹参对局灶性脑缺血再灌注损伤大鼠脑细胞线粒体超微结构 、氧化应激功能
及脑细胞凋亡的影响 , 探讨白花丹参对抗脑缺血再灌注损伤的作用及其机制。方法:采用大脑中动脉内线栓阻断
法(MCAO)造成局灶性脑缺血再灌注模型 , 将 SD大鼠随机分为:假手术组 、单纯脑缺血再灌注组 、白花丹参组及丁
苯酞治疗对照组 , 按照 6.5 g/kgBW白花丹参生药及 15 mg丁苯酞的剂量灌胃给药 ,每天 1次 , 分别于再灌注后 12
h、24 h及 48 h取损伤侧大脑 ,应用电镜观察脑细胞超微结构的改变 、比色法检测脑组织线粒体丙二醛(MDA)含量
及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活性的变化 、流式细胞技术检测脑细胞凋亡率的变化。结果:脑缺血再灌注后
大鼠脑细胞内出现大量高电子密度中毒颗粒及空泡 , 线粒体膜崩解 、内嵴消失;MDA含量明显增高(P<0.05);
GSH-Px酶活性显著降低(P<0.05);脑细胞大量凋亡。与脑缺血再灌注组比较 ,白花丹参能够减少细胞内高电
子密度中毒颗粒及空泡 ,增强线粒体膜的稳定性 , 显著降低 MDA含量(P<0.05), 延缓 GSH-Px酶活性的下降并
保护其活性(P<0.05), 显著降低脑细胞凋亡率(再灌注后 24h及 48h组 , P<0.05)。结论:白花丹参可减轻大鼠
脑缺血再灌注所致线粒体损伤 、延缓 GSH-Px酶活性下降 , 抑制细胞凋亡 ,从而发挥脑保护作用。
[关键词 ] 　脑缺血;再灌注损伤;细胞凋亡;白花丹参
　　[中图分类号 ] 　R743　　　　　[文献标识码 ] 　A doi:10.3969/j.issn.1000-4718.2010.04.020
EffectsofSalviamiltiorrhizaBunge.f.alba.onmitochondrialdamageand
apoptosisinducedbycerebralischemiaandreperfusion
ZHANGQiu-ling1 , SUNYuan-biao2 , WANGHai-ying1 , SONGShu-jie3 , BAIBo1
(1DepartmentofPhysiology, TaishanMedicalCollege, 2PhysiatryDepartment, TaianChineseMedicineHospital,
3DepartmentofClinicalMedicine, TaishanMedicalCollege, Taian271000, China.E-mail:qlzhang@tsmc.edu.cn)
　　[ ABSTRACT] 　AIM:ToobservetheeffectsofSalviamiltiorrhizaBunge.f.alba.(Sal)onthemitochondrialultra
-structure, oxidativestressandapoptosisinducedbyischemiainjuryinaratmodeloffocalcerebralischemiaandreperfu-
sion.METHODS:Themiddlecerebralarteryocclusion/reperfusion(MCAO/R)ratmodelwasestablishedbyamodified
Longaocclusionmethod.AdultmaleSDratswererandomlydividedintocontrolgroup, simpleischemiareperfusiongroup,
Salwithischemiareperfusiongroupandbutylphthalidewithischemiareperfusiongroup.Tostudytheprotectiveefectsof
Salanditsmechanism, theinterventionofSalwasgivenandtheultra-structureofmitochondria, functionsofmitochondria
underoxidativestressandtheincidenceofapoptosisofbraincelsweredetermined.RESULTS:Manyelectrondensetoxic
granulationandvacuolusinmitochondriawereobservedintheratbrainoffocalcerebralischemiaandreperfusion.Under
theconditionofischemiaandreperfusion, themitochondriamembranewasdisaggregative, andthetubularcristaeofmito-
chondriondisappeared.MDAcontentwasobviouslyincreasedandtheactivityofglutathioneperoxidasedecreasedsignificant-
ly.Theapoptosisofbraincellswereobservedinagreatquantity.Thechangesofultra-structureofmitochondriaandtheac-
tivityofGSH-PxaseweresignificantlyimprovedbythetreatmentofSal.Furthermore, treatmentwithSaldelayedthede-
creaseofGSH-Pxaseactivity, andinhibitedtheincreaseinMDAcontentinbraintissueafterischemiaandreperfusion.The
incidenceofapoptosisofbraincellswasalsodecreased.CONCLUSION:Salprotectsthebraintissuefromischemiainjury.
　　[ KEYWORDS] 　Brainischemia;Reperfusioninjury;Apoptosis;SalviamiltiorrhizaBunge.f.alba
·725·中国病理生理杂志　ChineseJournalofPathophysiology　2010, 26(4):725-729
　　白花丹参(SalviamiltiorrhizaBunge.f.alba, Sal)
为丹参的白花变型 ,产地主要分布于山东境内泰山
山脉及其周边地区 ,属于珍稀频危药用植物 。野生
白花丹参现已极少 ,现在的白花丹参主要是人工栽
培生产 [ 1] 。有研究证实白花丹参与丹参的化学成分
基本相同 [ 2] ,多年来 ,人们将白花丹参雷同丹参使
用 ,广泛应用于治疗脉管炎 、心绞痛等疾病 [ 3] ,也有
研究证实白花丹参具有软化血管 、降低血糖 、增强耐
缺氧能力等药理作用 [ 4, 5] ,但对于脑中风后治疗的研
究报道较少 。本研究利用白花丹参干预大鼠局灶性
脑缺血再灌注模型 ,通过观察脑细胞线粒体超微结
构 、氧化应激功能的改变以及脑细胞凋亡发生率等 ,
探讨白花丹参对脑缺血再灌注损伤的影响及其机
制 ,为进一步挖掘白花丹参的药用价值提供实验基
础及理论依据。
材　料　和　方　法
1　材料
1.1　动物及分组　SPF级成年 SD大鼠 160只(动
物合格证号 SCXK鲁 20050015 -0001684), 体重
(210±10)g,雌雄各半 ,由山东省中医药大学实验动
物中心供应 。随机分为 4组:(1)假手术组(sham, n
=16);(2)脑缺血再灌注组(CI/R, n=48);(3)脑缺
血再灌注 +白花丹参组(CI/R+Sal, n=48);(4)脑
缺血再灌注 +丁苯酞治疗组(CI/R+N, n=48)。除
第 1组外其余 3组分为术后 12 h、24 h、48 h3个时
点 ,每个时点 16只大鼠 。
1.2　主要仪器与试剂　JEM-1200透射电镜(日本
电子株式会社 ), 3K30高速低温离心机 (Sigma),
GenequantPRO紫外分光光度计 (英国 GE医疗集
团), FACSCalibur流式细胞仪(BD), AnnexinV-
FITC/PI试剂盒(BD),丙二醛(modeldrivenarchitec-
ture, MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(glutathioneperoxi-
dase, GSH-Px酶)试剂盒(南京建成生物技术有限
公司),多聚甲醛 、乙醇等为国产分析纯试剂。丁苯
酞软胶囊 ,恩必普药业有限公司生产 ,批号为 080302。
2　方法
2.1　白花丹参粗制剂的制备及丁苯酞的配制　实
验用白花丹参采自泰山医学院药用植物园 ,经泰山
医学院生药教研室苏延友教授鉴定为白花丹参 。将
白花丹参 60 ℃充分干燥后取 650 g,粉碎 ,加蒸馏水
1 500 mL,超声波 10min、180 ℃煮沸 60 min,趁热 4
层纱布过滤 ,滤渣加 2倍体积 95%乙醇过夜沉淀后
取上清液 ,同样操作重复 2遍 ,收集所有滤液混合 ,
40℃真空浓缩后旋转蒸发进一步浓缩 ,蒸馏水定容
至 1 000 mL(每 1mL含白花丹参生药 0.65g), 4 ℃
保存备用。取丁苯酞胶囊 5 g,用食用花生油稀释成
浓度为 15g/L的制剂 , 4℃保存备用 。
2.2　局灶性脑缺血再灌注动物模型的制备及给药
　采用大脑中动脉内线栓阻断法(middlecerebralar-
teryocclusion, MCAO)制备大鼠局灶性脑缺血再灌
注模型 [ 6] ,缺血 30 min缓慢拔出栓子约 10 mm剪断
线栓外露部分 ,扎紧备用线的活结 ,使血流恢复形成
再灌注状态 。Sham组除线栓插入 15 mm外 ,其余操
作与模型制备步骤相同。取 CI/R+S组及 CI/R+N
组的大鼠 ,按照 10 mL/kgBW的剂量于脑缺血再灌
注术后 30min分别给予白花丹参及丁苯酞制剂灌
胃 ,每天 1次 ,最后 1次给药后 30 min取材 。 Sham
组及 CI/R组给予等量生理盐水灌胃。
2.3　取材和线粒体超微结构的观察　于脑缺血再
灌注术后 12h、24h及 48 h每组各处死 8只大鼠 ,冰
盘内取损伤侧大脑 ,以大脑中动脉为界额状面切开
分成前后 2部分 ,切取自断面往前 2mm厚的颞叶大脑
皮层 ,再切成 1mm×1mm×1 mm大小的组织块 , 30%
戊二醛缓冲液固定 24h, 10%锇酸后固定 2h,梯度浓度
丙酮脱水 , EPON812包埋 ,半薄切片 ,光镜下定位后行超
薄切片 ,醋酸铀及枸橼酸铅双重染色 ,透射电镜观察。
2.4　线粒体氧化应激功能的检测　按照蔗糖 0.25
mol/L、2-巯基乙醇 1 mmol/L、Na2EDTA1 mmol/L、
0.1%BSA、Tris-HCl为 10 mol/L的终浓度配制线
粒体缓冲 A,按照 0.25 mol/L蔗糖 、0.01 mol/LTris
-HCl的终浓度配制线粒体缓冲液 B,各配 2 000
mL,调 pH7.5, 4 ℃保存备用。
切取自断面往后 5mm厚的上述后半部分脑组
织 ,冰生理盐水清洗残血 ,参照文献 [ 5]提供的梯度离
心方法提取线粒体 ,加入 10倍相应体积的线粒体缓
冲液 A,匀浆 ,双层 400目过滤网过滤去渣 ,收集滤液
在低温离心机中 4 ℃、1 000r/min离心 30min,取上
清液 4 ℃、5 000 r/min离心 30 min弃上清 ,收集沉
淀 ,每离心管加入 2 mL0 ℃线粒体缓冲液 B洗涤 ,
4 ℃、15 000r/min离心 30 min弃上清 ,重复 2次 ,得
线粒体沉淀 ,移液管仔细量取 200 μL,加入 800 μL
0 ℃缓冲液 B配制成均匀的线粒体悬液 1 mL,按照
试剂盒说明书的操作步骤检测 MDA、GSH-Px的活
性 ,每只大鼠线粒体样本分成 2份 ,测 2遍 ,取其平
均值进行统计学处理 。
·726·
2.5　脑细胞凋亡率的检测　于脑缺血再灌注术后
12 h、24 h、48 h每组各取另外 8只大鼠脑 ,以大脑中
动脉为界 ,取前后 5mm厚的损伤侧脑组织制备脑细
胞悬液 ,用磷酸盐缓冲液调单细胞浓度为 1 ×109
cels/L。每个大鼠样本取 100 μL细胞悬液(105个
细胞),加入 2 μLAnnexinV-FITC、5 μL碘化丙啶
(PI)混匀 ,再加入 400μLbindingbufer,进行流式细
胞分析 ,激发波长为 488 nm,计数 104个细胞 ,以二
维点阵图形式显示 ,点的密度代表细胞数的多少 ,纵
坐标为 PI荧光强度 ,横坐标为 AnnexinV-FITC荧
光强度 ,点阵图显示为 4个象限 ,分别把流式细胞仪
检测的细胞分为 4个亚群:(1)左下象限 Annexin
V- /PI-为正常细胞;(2)右下象限 AnnexinV+ /PI-
为早期凋亡细胞;(3)右上象限 AnnexinV+/PI+为中
晚期凋亡或死亡细胞;(4)左上象限 AnnexinV- /PI+
为机械损伤的细胞。所有数据由流式细胞仪自带的
CelQuest软件自动处理 ,记录右下象限 AnnexinV+/
PI-细胞数的百分比即为脑细胞的早期凋亡率[ 7] 。
3　统计学处理
所有数据用 SPSS13.0统计学软件中的单因素
方差分析系统(One-wayAnalysisofVariance)处理 ,
实验数据以均数 ±标准差( x±s)表示 ,组间用最小
显著性差异法(LSD法)进行显著性检验 。
结　　果
1　各组脑细胞线粒体超微结构的改变
假手术组神经细胞形状规则 ,胞质内线粒体丰
富 ,呈圆形或棒槌形 ,内嵴排列整齐 、清晰 ,粗面内质
网散在分布 ,表面有密集的核糖体附着 ,胞核形状规
则 ,核膜完整 ,染色质均匀 ,电子透明度高 。缺血再
灌注 12 h组:细胞外形改变不明显 ,线粒体膜轻微肿
胀 ,局部膜崩解甚至消失 ,部分内嵴残留 。缺血再灌
注 24h组:细胞外形不规则 ,多数线粒体嵴断裂 、减
少 、甚至消失 ,核糖体脱失明显 ,有少量高电子密度
中毒颗粒出现 ,染色质聚集靠边 。缺血再灌注 48 h
组:脑细胞胞质内出现大量高电子密度中毒颗粒 ,甚
至呈斑块状 ,同时出现大量空泡 ,线粒体结构难以分
辨 ,部分核膜崩解;白花丹参干预组脑细胞超微结构
损伤明显减轻 , 12h组线粒体结构基本保持完整 ,水
肿明显减轻 ,偶见局部膜崩解 。 24 h组脑细胞线粒
体膜大部分完整 ,内嵴基本消失 。 48 h组的脑细胞
内仍能分辨出部分线粒体的结构 ,高电子密度中毒
颗粒和空泡明显减少 。丁苯酞治疗 12 h组线粒体超
微结构的改变与白花丹参干预 12 h组区别不明显 ,
24h及 48h组线粒体超微结构损伤的改变比白花丹
参组明显加重 ,见图 1。
Figure1.Theultramicrostructureofbraincelsaftercerebralischemia-reperfusionandSalinterventioninrats(×25 000).
图 1　脑缺血再灌注后白花丹参治疗组及各对照组脑细胞的超微结构
2　各组脑组织线粒体 MDA含量的变化
脑缺血再灌注 12 h组 、白花丹参干预及丁苯酞
治疗 12 h组 MDA含量组间比较无显著差异 (P>
0.01), 与假手术组比较 , MDA含量均升高 (P<
0.01)。再灌注 24 h组 MDA含量继续增高持续到
48 h,仍然没有明显下降 ,与假手术组比较差异显著
(P<0.05)。白花丹参干预 24 h及 48 h组 MDA含
量明显低于脑缺血再灌注组 MDA含量(P<0.05),
但仍高于假手术组 MDA的含量(P<0.05)。丁苯酞
24h组 MDA含量明显低于脑缺血再灌注 24 h组(P
<0.05),但与白花丹参干预 24h组比较无明显差别
(P>0.05),丁苯酞 48h组 MDA含量明显高于白花
丹参干预 48 h组(P<0.05),见表 1。
3　各组脑组织线粒体 GSH-Px活性的改变
脑缺血再灌注术后脑组织线粒体 GSH-Px的活
性明显降低并继续降低到术后 48 h,明显低于假手
·727·
术组(P<0.01)。白花丹参干预后各时点 GSH-Px
的活性明显高于脑缺血再灌注组相同时点 (P<
0.05),且白花丹参干预 12h组与假手术组比较无明
显下降(P>0.05),显示脑缺血再灌注后白花丹参能
延迟脑组织线粒体 GSH-Px活性下降的时间及保护
GSH-Px的活性 。丁苯酞对照组各时点 GSH-Px
活性高于脑缺血再灌注组(P<0.05),低于白花丹参
治疗组(P<0.05),见表 2。
表 1　白花丹参治疗后及各对照组不同时点大鼠脑组织 MDA含量的比较
Table1.ComparisonofcontentsofSaltreatedgroupandcollatedgroupsindiferenttime(μmol/g. x±s)
Group CI/R12h CI/R24h CI/R48h
Sham(n=16) 3.61±0.87 3.61±0.87 3.61±0.87
CI/R(n=48) 10.54±2.45■■ 15.73±3.44■■ 14.24±2.68■■
CI/R+Sal(n=48) 9.65±2.57■■ 9.94±2.47■■＊ 8.75±3.21■■＊
CI/R+N(n=48) 10.21±3.19■■ 10.84±3.56■■＊ 11.62±3.11■■＊△
　■■P<0.01 vsshamgroup;＊P<0.05 vsCI/Rgroup;△P<0.05 vsCI/R+Salgroup.
表 2　白花丹参治疗后及各对照组脑组织 GSH-Px活性的比较
Table2.ComparisonofactivityofGSH-PxofSaltreatedgroupandcollatedgroups(mkat/g. x±s)
Group　　 CI/R12h CI/R24h CI/R48h
Sham(n=16) 80.72±6.57 80.72±6.57 80.72±6.57
CI/R(n=48) 60.23±4.33■■ 49.24±6.13■■ 52.11±5.12■■
CI/R+Sal(n=48) 76.24±5.32＊ 61.23±2.44■■＊ 64.32±4.78■■＊
CI/R+N(n=48) 71.11±5.43＊△ 55.33±2.44■■＊△ 59.11±5.13■■＊△
　■■P<0.01 vsshamgroup;＊P<0.05 vsCI/Rgroup;△P<0.05 vsCI/R+Salgroup.
4　各组脑细胞凋亡率的变化
流式细胞仪检测结果显示单纯脑缺血再灌注可
以诱发脑细胞大量凋亡 ,且随脑缺血再灌注时间的
延长 ,脑细胞凋亡率增加;与脑缺血再灌注组比较 ,
白花丹参及丁苯酞治疗 12 h组脑细胞凋亡率均无明
显变化(P>0.05),治疗 24 h、48 h后显示白花丹参
及丁苯酞均能有效降低脑细胞凋亡率 ,见表 3。
表 3　白花丹参治疗后大鼠脑细胞凋亡发生率的比较
Table3.Comparisonofapoptosisrateofbraincelsamongdifferentgroups(%. x±s)
Group　　 CI/R12h CI/R24h CI/R48h
Sham(n=16) 4.52±2.34 4.52±2.34 4.52±2.34
CI/R(n=48) 31.11±5.13■■ 40.43±8.99■■ 54.22±8.32■■
CI/R+Sal(n=48) 29.24±3.12■■ 32.21±5.14■■＊ 38.45±5.23■■＊
CI/R+N(n=48) 29.87±3.54■■ 34.45±4.31■■＊ 45.14±6.11■■＊△
　■■P<0.01 vsshamgroup;＊P<0.05 vsCI/Rgroup;△P<0.05 vsCI/R+Salgroup.
讨　　论
线粒体作为细胞内的能量生成和储存的主要场
所 ,对缺血缺氧极为敏感 [ 8] 。正常生理情况下 , 95%
以上的氧分子在线粒体中被消耗 ,其中大约 2%O2
不能被完全还原 ,而是和呼吸链底物端漏出的电子
反应生成超氧阴离子等活性氧自由基 [ 9] (reactiveox-
ygenspecies, ROS),线粒体是细胞内 ROS产生的主
要场所 ,正常情况下 ,细胞内部和线粒体基质中有完
善的抗氧化防御体系 ,如超氧化物歧化酶(superoxide
dismutase, SOD)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)
等;抗氧化剂如 VitC、VitE以及机体自身的调控机
能如脂酶 、蛋白酶 、DNA修复酶 、酞基转移酶等 ,体内
自由基处于生成和清除的平衡状态中 ,不损害机体 。
脑缺血时线粒体被破坏 ,不能进行有氧氧化 ,线粒体
ATP产生不足 ,再灌注时血液突然增加带入的氧只
能在黄嘌呤氧化酶 、髓过氧化物酶 、蛋白激酶 C等酶
催化生成主要包括单线态氧(O2)、超氧化物阴离子
(O-2 )、过氧化氢(H2O2)、氢氧根(OH-)和氢过氧基
(HO-2 )等 ,并使缺血期因氧耗竭而停止的烷自由基
向脂质过氧化自由基的转化得以延续 ,从而产生一
些脂类过氧化中间产物 , 大量增加的 ROS超出了
·728·
GSH-Px、SOD等的防御清除能力 [ 10] ,超量的 ROS
攻击线粒体抗氧化酶及自由基清除酶 ,自由基产生
急剧增多 ,形成恶性循环 ,过剩的 ROS攻击线粒体膜
磷脂中不饱和脂肪酸双键而导致脂质过氧化 , MDA
含量增加 , MDA是自由基引起不饱和脂质过氧化作
用的特征产物。由于神经组织具有较高的氧化代谢
水平及含有丰富的高密度不饱和脂肪酸 ,特别易受
氧自由基攻击造成损伤 ,同时产生的脂质过氧化物
代谢产物 MDA使大分子物质交联 ,细胞功能丧失 ,
进一步引起脑损伤。
丁苯酞是由芹菜和芹菜籽提取的绿色植物性药
品 ,具有较强的抗脑缺血作用 [ 11] 。本实验用白花丹
参治疗脑缺血再灌注 ,用丁苯酞作为实验对照 ,显示
白花丹参能有效地保护脑细胞线粒体的超微结构 ,
保护并延缓脑缺血再灌注后 GSH-Px酶的活性及下
降速度 ,维持 GSH-Px酶较高的活性水平显然有利
于清除缺血再灌注脑损伤时增加的自由基。说明白
花丹参通过保护线粒体 GSH-Px的活性 ,缓解脑细
胞的氧化应激 ,降低脑组织脂质过氧化反应 ,减少自
由基的形成 ,从而减少脑缺血再灌注后脑细胞的凋
亡 ,保护受损脑细胞 ,这可能是白花丹参对抗脑缺血
再灌损伤的机制之一 。
[参　考　文　献 ]
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酵母基因组中基础转录因子 TATA结合蛋白的启动子动力学特征
　　真核细胞的转录调控包括转录因子在基因启动子部位的快速募集和适当组装。 TATA结合蛋白(TATAbindingprotein,
TBP)直接通过 3种核糖核酸聚合酶参与转录 ,是真核基因转录的重要调节物。 DNA序列和许多不同的调控因子控制 TBP的
激活 , TBP与相关启动子的结合是基础转录体系组装的关键 ,并直接影响基因转录的产量。 为了测定 DNA中转录体系的动
态变化 , 科学家通过差异染色质免疫沉淀技术与全基因组微阵列检测相结合 , 测定了 TBP的动力学特性 , 发现 TBP在核糖核
酸聚合酶 I启动子中更新率(turnoverrateofTBPexchange)较慢 ,而在核糖核酸聚合酶 II中的更新较快 , 在核糖核酸聚合酶 III
启动子的更新率则居于两者之间。聚合酶 II启动子中的高水平的 TBP更新率与 Spt-Ada-Gcn5乙酰转移酶(SAGA)共激活
物结合相关联 , 并和 Mot1p依赖性及标准的 TATA盒序列相关联。相反 , TBP在聚合酶 II启动子中的更新率的减缓依赖于
TFIID和基因特异性因子 Rap1p。这些结果表明TBP更新率受蛋白因子而不是 DNA序列的调控 , TBP的更新率是调控基因表
达的重要因素。
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