全 文 ：·生物技术· 北方园艺 2010(6):152～ 155
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Study on the Sterilization Materials of Lonicera nitida`Maigrun
WANG Dan , LI Hong-na, LUO Jiang-xia, CHAI Ci-jiang
(Department of Hor ticulture , Tianjin Ag ricultural University , T ianjin 300384)
Abstract:The effects of investigated by using Lonicera nitida`Maigrun as testing material.The results indicated that
the most sterilized materials could be obtained , .and the explants with lower contaminated rate ,higher survival rate , rel-
atively higher germination rate and longer shoot growth were observed when the explant treated with 70% alcohol as
surface sterilization for 15 min , then with 2%NaClO for 15 min.Contaminated rate could be declined , while germina-
tion and shoot grow th were enhanced by keeping explant with parts of leaves before inoculation.Increasing cane sugar in
the medium could promote the germination effectively.
Key words:Lonicera nitida`Maigrun ;explant;sterile method;contaminated rate;germination
第一作者简介:李雪(1968-),男 ,重庆大足人, 硕士 ,现从事园艺植
物选育和快繁及产业化研究工作。E-mail:Snow thlee@yhoo.com.
cn。
基金项目:福建省科技厅科研资助项目(2008N2003)。
收稿日期:2009-12-25
金毛狗离体培养及再生植株体系的建立
李 　雪1, 2 , 叶 清梅1 , 詹 启成1 , 康宝 莲1 , 简丽 观1 , 黄 敏玲2
(1.泉州市泉美生物科技发展有限公司,福建泉州 362012;2.福建省特色花卉工程技术研究中心, 福建福州 350013)
　　摘　要:利用金毛狗孢子进行离体培养及再生植株的研究。结果表明:孢子采用 2%次氯酸
钠消毒10～ 12 min获得无菌材料最佳。孢子萌发受培养基盐离子影响很小 ,其平均萌发率为91.
25%。形成原叶体需60～ 90 d。原叶体诱导孢子体最佳培养基为 1/10 MS ,生成孢子体需 80 ～
110 d。原叶体形成孢子体有 3种方式。孢子体增殖培养基1/4MS+KT 2mg/ L+NAA 0.1 mg/
L+蔗糖 30 g/ L+卡拉胶4.5 g/L ,pH 5.8;生根培养基为MS+0.1%AC+蔗糖30 g/L+卡拉胶
4.5 g/L ,pH5.8;组培苗移栽成活率达 98.67%。
关键词:金毛狗;孢子;离体培养;再生植株
中图分类号:S 682.35　文献标识码:A　文章编号:1001-0009(2010)06-0152-04
　　金毛狗(Cibot ium barometz(L.)J.Sm.),蚌壳蕨科
(Dicksoniaceae)金毛狗属大型树状陆生蕨类。根状茎粗
壮肥大 ,露出地面部分密被金黄色长茸毛 ,似伏地的金
毛狗[ 1-3] 。叶族生茎顶端 ,3回羽状分裂 ,叶柄长达1 m以
上。金毛狗根状茎富含淀粉 ,可食用和酿酒 ,具有补肝
肾 、除风湿 、利尿通淋 ,茎上茸毛能止血 ,入药时称金毛
狗脊[ 4] 。金毛狗也是大型的室内观赏及庭院植物 ,根状
茎可制成工艺品。目前其自然生存环境破坏严重 ,加之
过度采挖 ,野生资源日渐枯竭 ,已列入我国首批植物保
护名单[ 5] 。通过金毛狗组织培养的研究 ,对保护野生资
源 、扩大该物种分布的数量 ,对该物种的开发利用等具
有重要意义。
1　材料与方法
1.1　试验材料
成熟孢子(图1)于2002年12月采自泉州市五台山
林场。
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北方园艺 2010(6):152～ 155 ·生物技术·
1.2　试验方法
用镊子将孢子囊取下让其失水收缩 ,轻压孢子囊取
出孢子 ,过细筛并去掉杂质[ 2] 收集好孢子。用 2%次氯
酸钠消毒 ,无菌水冲洗3 ～ 4次 ,按孢子 5～ 10个/cm2 接
种在不同培养基上。孢子萌发形成原叶体后 ,转接到含
不同激素 、营养成份的孢子体诱导培养基中。经孢子体
增殖培养基筛选 ,再诱导生根 ,最后组培苗移栽。培养
温度24 ～ 26℃,光强 1 500 ～ 2 500 lx ,光照13 h/d。
2　结果与分析
2.1　孢子萌发率
2.1.1　不同消毒时间对孢子萌发率的影响　金毛狗孢
子适宜消毒时间 10 ～ 12 min ,时间加长污染下降 ,但孢
子受损越严重 ,表现为死亡率升高(表 1)。35 d观察孢
子有零星萌发 ,呈淡绿色 ,42 d时大量孢子萌发 ,60 d时
萌发达到高峰 ,容器布满绿色扁平的似心形 3 ～ 10 mm
原叶体(图 2),原叶体腹面长有密集绒毛状的褐色假根 ,
贴着培养基表面生长。孢子萌发持续时间长达2个月 ,
92 d时孢子萌发完毕 ,萌芽率为91.25%。
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·生物技术· 北方园艺 2010(6):152～ 155
　　表1　　不同消毒时间对孢子萌发率的影响
消毒时间
/ min
接种孢子数
粒
真菌感染率
/ %
细菌染率
/ %
死亡率
/ %
成活率
/ %
6
10
12
15
280
276
286
281
65.55
14.55
9.25
4.75
18.32
13.25
7.25
1.55
1.00
0.00
5.00
29.00
15.00
72.00
78.55
63.75
2.1.2　不同培养基对孢子萌发率的影响　由表2可知 ,
盐子浓度对孢子萌芽率及原叶体形成的影响小 ,孢子萌
发所需的营养成份不十分严格 ,在未加任何盐离子
(0MS)中也能萌发。KT 、GA3 对金毛狗萌发率未有任何
影响。
　　表2 不同培养基对孢子萌芽率的影响
萌发培养基 接种孢子数量/粒 最初萌发时间/ d 萌芽率/ %
MS
1/2MS
1/8MS
0MS＊
1/8MS+KT 0.01 mg/ L
1/ 8MS+GA3 0.01 mg/L
100
140
140
140
140
120
35.00
36.00
31.00
32.00
35.00
35.00
94.00
94.29
95.00
94.29
90.00
92.50
　　注:蔗糖 30 g/L ,琼脂6.0～ 10 g/ L,pH 5.8 ,下同。＊仅蔗糖 、琼脂。
2.2　原叶体诱导成孢子体
孢子体诱导率受培养基中盐离子浓度 、不同生长调
节剂种类配比影响(见表3)。低盐离子浓度有利于孢子
体的诱导 ,1/10MS 孢子体诱导最高达 28.30%,1/4MS
为20.83%,MS为4.08%。加少量的KT 、NAA ,有利于
孢子体的形成;未加任何生长调节剂 ,配子体也能分化
出孢子体 ,但分化率最低。加入0.1 mg/ L的 KT 、NAA
的1/2MS培养基上孢子体诱导率较 MS培养基上诱导率
高。MS 、1/2MS培养基仅加入 0.1 mg/ L BA 对形成孢
子体无明显效果 ,0.1 mg/L KT 比 NAA 的诱导孢子体
的效果更好。无任何激素的培养基中孢子体形成时间
最短在85 ～ 86 d ,加入 BA 或KT ,孢子体形成的时间较
未加任何激素的培养基长1周左右 ,加入NAA则介于2
者之间。原叶体诱导培养 3个月后形成含 1 ～ 2片幼叶
的孢子体。
诱导孢子体过程中原叶体发生 5种变化。一是原
叶体继续生长 ,形成浅裂具有分枝的相互交织连在一起
大小为1 ～ 2 cm的原叶体丛(图 3)。二是从原叶体中部
长出1 ～ 2片呈拳状幼叶 ,密被金黄色绒毛 ,基部带丝状
的须根 ,形成独立的孢子体小苗(图 4)。三是原体叶边
缘变厚 ,慢慢生成细小球形的胚状体 GGB(Green Global
Body),GGB会分化小芽 ,形成多个孢子体(图 6)。四是
原叶体形成密集的绿色原丝体组织 ,丝状组织形成孢子
体 、或原叶体 、或GGB 、或丝状体(图 4)。五是原叶体出
现黄化 ,周围出现褐色物质 ,最后死亡(图 5)。形成孢子
体可由原叶体变化的二 、三 、四途径3种方式 ,形成孢子
体所需80～ 110 d ,途径二原叶体直接形成孢子体最短为
80 d左右 ,途径四形成孢子体需要最长约 110 d。
　　表3 植物激素NAA 、KT 、BA及
无机盐浓度对孢子体诱导影响
培养基
/ mg·L-1
接种原叶体数
/个
孢子体诱导时间
/d
孢子体分化率
/团%
MS
MS+NAA 0.1
MS+BA 0.1
MS+KT 0.1
1/ 2MS+NAA 0.1
1/ 2MS+BA 0.1
1/ 2MS+KT 0.1
1/ 4MS
1/ 10MS
49
51
50
52
51
50
50
48
53
85
89
94
93
86
95
96
86
85
4.08
6.12
4.00
7.69
11.76
10.00
21.56
20.83
28.30
2.3　孢子体增殖
1/4MS较1/2MS 、MS培养基更有利于孢子体增殖
(见表 4)。孢子体增殖大部份是以GGB途径不断产生
丛生幼芽。在相同离子浓度的培养基中 ,KT 对孢子体
的增殖较 NAA更有利 ,BA对其增殖效果不明显。未加
激素的MS中 ,孢子体增殖率 1.2 ,长出新芽极为缓慢。
1/10MS培养基中 ,虽然加有相关激素 ,但孢子体培养30
d时叶片开始枯黄 ,45 d整个团块表现淡黄 ,大部份叶片
枯死 ,偶有个别新叶长出 ,但培养90 d后芽团枯死。增
殖培养基以 1/4MS+KT 2 mg/ L+NAA 0.1 mg/L 最
佳 ,新长丛生芽多 、叶片生长整齐。经过 6周的培养增
殖率5.6(图8),完全可满足商业生产要求。
　　表4 植物激素 NAA 、KT 、BA及无机盐
浓度对孢子体增殖的影响
培养基 生长调节剂/mg·L-1
NAA BA KT
孢子接种数 增殖率(PC)
MS
MS
1/2MS
1/2MS
1/4MS
1/4MS
1/ 10MS
1/ 10MS
0.00　　0.00　　0.50
0.01　　0.10　　2.00
0.01　　0.10　　0.50
0.05　　0.00　　0.50
0.05　　0.00　　0.50
0.05　　0.00　　2.00
0.05　　0.10　　0.50
0.05　　0.10　　2.00
20
21
22
20
20
23
22
23
1.2
1.8
2.6
4.0
3.1
5.6
＊
＊
　　注:＊材料最后死亡。
2.4　孢子体不定根诱导
将含有3～ 5片幼叶的孢子体 ,幼叶高度5 mm时转
入诱导生根培养基。10 d后幼叶开始迅速生长 ,不定根
从基部茎上陆续长出。诱导根的速度受激素的种类和
培养基盐离子浓度的影响不明显(表 5)。6周统计结果
表明 ,所有孢子体生根率均为100%,每团生根的数量达
10条以上 ,植株叶片达到50～ 80 mm。
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北方园艺 2010(6):152～ 155 ·生物技术·
　　表5　不同NAA 、IBA 、AC浓度对金毛狗生根影响
培养基 生长激素/ mg ·L-1
IBA NAA
活性炭 AC/g ·L-1 生根率/ %
MS
MS
MS
1/2MS
1/2MS
1/2MS
0.00　　　　0.00
0.05　　　　1.00
0.10　　　　1.00
0.00　　　　0.00
0.05　　　　1.00
0.10　　　　1.00
1.0
0.0
0.0
1.0
0.0
0.0
100
100
100
100
100
100
2.5　组培苗移栽
生根好的植株经 5 ～ 7 d练苗后 ,洗净培养基 ,移
栽于 72目穴盘 ,基质为泥炭∶珍珠岩∶河沙∶苔藓
(4∶1∶1∶1),湿度 80%～ 95%,光强 1 000 ～ 2 000
lx ,温度22 ～ 28℃, 6周调查苗成活率 98.67%, 2个
月后筛苗可长满穴盘(图 11)。组培苗种植的整齐度
好 、凑丛生强 、株形叶片紧 ,叶色更浓绿 , 7 ～ 10个月
可种植成观赏性极高的盆苗(图 12)。目前该课题组
通过以上方法已大批量生产并投入国内外市场 。
3　讨论
外植体采用孢子体 ,取材通常有茎段 、茎尖 、嫩叶
或叶原基 ,因幼嫩位含大量的绒毛 ,获得无菌外植体
较难[ 6] 。采用孢子 ,外植体易获得 ,解决了外植体高
污染及容易褐化死亡问题 ,对野生资源也不会破坏。
原叶体边缘变厚诱导出 GGB ,GGB形成多个孢
子体植株 ,表明金毛狗已进行了无配子体生殖直接由
配子体产生了孢子体 ,这可能受植物激素 、盐离子成
份或培养条件影响正常的世代交替。原叶体大量增
殖形成一原叶体体团 ,最终不能形成孢子体 ,可能配
子体发育不全 ,引起受精率低[ 7] ,具体原因还需要进
一步的探讨。
增殖培养基以1/4MS+KT 2 mg/ L+NAA 0.1 mg/ L
最佳 ,新长丛生芽多 、叶片生长整齐。经过 6周的培养
增殖率5.6 ,完全可满足商业生产要求。
生根最好的是 IBA与NAA搭配使用 ,10 d就开始
生根;生根苗最理想的是培养基是 MS+AC 1.0 g/L ,孢
子体生长整齐好 ,叶色浓绿 ,有利于后期苗的种植。经
过42 d的生根培养 ,均形成了5～ 9片叶组培苗(图8、图9)。
4　结论
孢子采用 2%次氯酸钠消毒 10 ～ 12 min获得无菌
材料最佳;孢子萌发受培养基盐离子影响很小 ,其平均
萌发率为91.25%;形成原叶体需60 ～ 90 d;原叶体诱导
孢子体最佳培养基为1/10MS ,生成孢子体需80～ 110 d;孢
子体增殖培养基1/4MS+KT 2 mg/L+NAA 0.1 mg/ L+
30 g/ L蔗糖+卡拉胶4.5 g/L ,pH5.8;生根培养基为 MS+
0.1%AC+30 g/L蔗糖+卡拉胶 4.5 g/L ,pH5.8;组培
苗移栽成活率达 98.67%。
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In Vitro Culture and Plant Regeneration of Cibotiumbarometz(L.)J.Sm.
LI Xue1 , 2 , YE Qing-mei1 ,ZHAN Qi-cheng1 , KANG Bao-lian1 , JIAN Li-guan1 , HUANG Min-ling 2
(1.Sunshine Horticulture CO , LTD , Quanzhou , Fujian 362012;2 Fujian Engineering Research Center for Characteristic Flo riculture , Fuzhou ,
Fujian 350013)
Abstract:Using spores of Cibotiumbarometz(L.)J.Sm as explant , we studied In Vitro culture and plant regeneration.
The results showed that the best effects of aseptic spores were gained by pret reatment with NaClO 2%for 10 to 12 mi-
nutes.Spores had no dormancy and theirs average germination rate was 91.25%.Spores germinated and formed prothal-
lus were not influenced by the inorganic salts.The best medium for inducement of the sporophyte was 1/10 streng th MS
without any hormone.That sporophy tes induced from the prothallus need 80 to 110 days and was influenced by the con-
centration of plant regulators and inorganic salts.There were there kinds of paths to form sporophytes.The medium for
sporophyte multiplication w as 1/4 streng th MS with KT 2 mg/L and NAA 0.1 mg/L containing 30 g sucrose , pH5.8.
Adding 1 g/ L active carbon was benefit for sporophytes rooting.The rate of survival for it tissue culture plant grow th
was 98.67 percent.
Key words:Cibotiumbarometz(L.)J.Sm.;spore;in vitro culture;plant regeneration
155