全 文 ：［收稿日期］ 20110618(001)
［基金项目］ 国家自然科学基金项目(30973938)
［第一作者］ 于 海 涛，研 究 生，从 事 中 药 炮 制 学，Tel:
0411-87586115
［通讯作者］ * 贾天柱，教授，从事中药炮制原理研究工作，
Tel: 0411-87586499，E-mail: jiatz @ lnutcm．
edu． cn
狗脊生、制品不同提取部位对成骨细胞的影响
于海涛1，鞠成国1，2，章琦1，贾天柱1，2，3 *
(1. 辽宁中医药大学药学院，辽宁 大连 116600;2. 辽宁省中药炮制工程技术研究中心，
辽宁 大连 116600;3. 国家中医药管理局中药炮制工艺原理重点研究室，辽宁 大连 116600)
［摘要］ 目的:探索狗脊不同提取部位对体外培养成骨细胞的增殖作用;比较狗脊生、制品对细胞增长的影响。方法:用
狗脊生制品的石油醚层、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层及粗多糖与成骨细胞共同培养;并且将各提取部位给大鼠灌胃，取大鼠
含药血清与成骨细胞共同培养，以 MTT 法检测细胞的增殖。结果:各提取部位与细胞共同培养试验和含药血清与细胞共同培
养试验中，均以狗脊正丁醇提取部位对细胞增殖作用最明显，且制品强于生品。结论:狗脊炮制品正丁醇提取物能够显著促进
成骨细胞增殖。
［关键词］ 狗脊;成骨细胞;骨质疏松;噻唑蓝
［中图分类号］ R285. 5 ［文献标识码］ A ［文章编号］ 1005-9903(2011)24-0036-04
Effect of Different Extracts From Cibotium barometz
on Cultureing Osteoblasts
YU Hai-tao1，JU Cheng-guo1，2，ZHANG Qi1，JIA Tian-zhu1，2，3*
(1. School of Pharmacy Liaoning University of TCM，Dalian 116600，China;
2. Chinese Materia Medica Processing Engineering Center of Liaoning Province，Dalian 116600，China;
3. The Key Laboratory of State Administration of Traditional Chinese Medicine，Dalian 116600，China)
［Abstract］ Objective:To explore the effects of different extracts from Cibotium barometz on proliferation of
Osteoblasts． To compare the effects on proliferation of osteoblasts between crude and processed products，to explore
the mechanism of anti-osteoporosis for C． barometz． Method:Osteoblasts with petroleum ether layer extract，
chloroform layer extract，ethylacetate layer extract，butanol layer extract and polysaccharide from crude and processed
products of C． barometz were cultured respectively． Meanwhile，after the rats were fed with each layer extract，the
rat serum together with osteolastes was cultured． The proliferation was tested by MTT method． Result:In the
different extract with osteoblasts test and the rat serum with osteoblasts test，the butanol layer extract had the most
significant effect on cell proliferation of osteoblasts． And the effect of the processed product was more significant
than that of crude product． Conclusion:The butanol layer extract from processed products of C． barometz had the
most significant effect on cell proliferation of Osteoblasts．
［Key words］ Cibotium barometz;osteoblasts;osteoporosis;MTT
狗脊为蚌壳蕨科植物金毛狗脊的干燥根茎。味
苦、甘，性温，归肝、肾经。具有补肝肾，强腰膝，祛风
湿之功效，常用于腰膝酸软、下肢无力、风湿痹痛等
症，临床常用于治疗骨质疏松症。祖国传统医学认
为肾与骨的关系非常密切，《素问·宣明五气论》说
“五脏所主，肾主骨”。《素问·应象大论》说“肾生骨
髓”，肾精充足，则骨髓生化有源，骨得髓的充分滋养
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第 17 卷第 24 期
2011 年 12 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 17，No． 24
Dec．，2011
DOI:10.13422/j.cnki.syfjx.2011.24.046
而坚固有力。狗脊即能补肝肾又强筋壮骨，可谓治
疗骨质疏松症之要药，已有研究［1-2］表明狗脊对摘除
卵巢所致的大鼠骨质疏松模型有良好的治疗作用，
并且以正丁醇提取部位最强。本文着眼于狗脊对成
骨细胞的增殖作用，从促进骨形成角度探索狗脊治
疗骨质疏松症的机制，探索抗骨质疏松的有效成分。
1 材料
1. 1 药材 狗脊药材采自四川成都，根据 2010 年
版《中国药典》由辽宁中医药大学药用植物教研室
王冰教授鉴定为蚌壳蕨科植物金毛狗脊 Cibotium
barometz． (L．)J． Sm．的干燥根茎。
1. 2 试剂 DMEM 干粉培养基(Gibco 公司)、新生
牛血清(Gibco 公司)、胰酶(Gibco 公司)、Ⅰ型胶原
酶(Sigma 公司)、MTT(Gibco 公司)、DMSO(ACS
级)、水为哇哈哈纯净水、细胞培养用具等。
1. 3 动物 SD 雌性大鼠购自大连医科大学实验动
物中心，合格证号 SCXK(辽)2008-0002。
2 试验方法
2. 1 样品制备
2. 1. 1 狗脊的炮制 取净河砂(约为饮片 8 倍量)
置锅中加热至滑利状态(180 ～ 190 ℃) ，保持砂温，
下药，边炒边埋，炒 6 ～ 7 min，出锅筛去砂，晾凉
备用。
2. 1. 2 狗脊饮片的提取 分别取生、制品粉末(过
60 目筛)各 100 g，8 倍量 80%乙醇回流提取 3 次，每
次 40 min，合并提取液，浓缩至 200 mL 置分液漏斗
中，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯、正丁醇各 150
mL 萃取，收集各萃取液蒸干溶剂备用。分别记为生
品的石油醚层、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层;制品
的石油醚层、氯仿层、乙酸乙酯层、正丁醇层(简称
S石，S氯，S乙，S正，Z石，Z氯，Z乙，Z正)。
2. 1. 3 粗多糖的提取 分别取生、制品粉末(过 60
目筛)各 100 g，8 倍量水煎煮 3 次，每次 40 min，浓缩
至 200 mL，加乙醇使终浓度为 80%净置过夜沉淀多
糖，抽滤收集多糖备用。将多糖用水溶解，用氯仿-
正丁醇(4∶ 1)的混合液与多糖 1∶ 4混合除蛋白，抽滤
收集多糖水溶液，浓缩至 50 mL，加乙醇使终浓度为
80%净置过夜沉淀多糖，抽滤收集粗多糖，记为生多
糖、制多糖(以下简称 S糖，Z糖)。
2. 1. 4 含药血清的制备［3］ 取 SD 雌性大鼠随机
分成 10 组，每组 4 只，分别记为:S石，S氯，S乙，S正，
S糖;Z石，Z氯，Z乙，Z正，Z糖。另取 4 只灌胃生理盐水做
空白对照组。各组药物按 2. 1. 2 和 2. 1. 3 项下提
取，用纯净水溶解配成相当于生饮片含量 0. 5 g·
mL － 1的药液，以 1 mL /100 g 给药量灌胃给药，每日 1
次，连续 7 d，待最后一次给药后 2 h，用 3 g·L － 1的戊
巴比妥钠腹腔注射麻醉(3 mL·kg － 1) ，麻醉后剪开腹
部，腹主动脉取血，离心(4 000 r·min － 1，10 min)分
离血清，－ 20 ℃保存。
2. 2 成骨细胞的原代培养［4-5］ 取 24 h 以内新生
大鼠用 75%乙醇消毒后置于培养皿中，在超净台下
揭去头顶皮肤，剪下颅骨，置 PBS 液内，清除骨膜、血
管及结缔组织，再用 PBS 清洗 3 次，在 PBS 液内将
颅骨剪成约 1 mm2 的小块;将骨片移入 5 mL 0. 25%
胰酶内，37 ℃预消化 20 min 以清除纤维细胞;弃去
消化液，将骨片移入 5 mL 0. 1%Ⅰ型胶原酶中 37 ℃
消化分离细胞 50 min;用 100 目筛网过滤消化液，将
消化液移入离心管中，加培养液终止消化，1 000 r·
min － 1离心 10 min;小心倾倒出上清液，加入适量含
15%小牛血清的 DMEM 培养液(以下简称培养液) ，
将细胞混悬;用计数板调整细胞密度 5 × 105 /mL，将
调整好密度的细胞悬液分装到培养瓶中，再加入培
养液共 5 mL，放入 37 ℃ 5% CO2 培养箱中培养。
与书中［4，6］及文献［7-8］中成骨细胞的特征和图
片比较，本细胞呈梭形、三角形和多边形，胞核大而
清楚，呈圆形或卵圆形，含 1 ～ 2 个核仁。
2. 3 试药与成骨细胞的共同培养和增殖检测
2. 3. 1 培养用试药的制备 ①含药培养液:将
2. 1. 2 和 2. 1. 3 项下提取的各狗脊提取部位称重，溶
于 DMSO 中，配成相当于生饮片含量为 20 g·L － 1的
储备液。在超净工作台下用移液器吸取各提取部位
10 μL 于 10 mL 量瓶中，用无血清培养液稀释至刻
度，配成 2. 0 × 10 － 2 g·L － 1的含药培养液，0. 22 μm
过滤除菌，－ 20 ℃保存备用。
②含药血清培养液:将 2. 1. 4 项下得到的血清
室温融化，在超净工作台下用无血清培养液配成含
该血清 15%的含药血清培养液，0. 22 μm 过滤除菌，
－ 20 ℃保存备用。
2. 3. 2 细胞加药培养和增殖检测［9-11］ 选择密度
适宜的原代培养细胞，用 0. 25% 胰酶和 0. 1% Ⅰ型
胶原酶的混合酶进行传代，选择对数生长期中生长
旺盛的第 3 代细胞，用含药培养液和含药血清培养
液分别将细胞密度调整为 5 × 104 /mL，铺入 96 孔板
中，每孔 200 μL，培养 24 h 后，弃去原培养液，换无
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于海涛，等:狗脊生、制品不同提取部位对成骨细胞的影响
血清培养液，饥饿细胞 24 h，以使细胞周期同步化。
弃去无血清培养液，第一组 96 孔板加入含药培养
液，以无血清培养液和培养液为对照，每药重复 5 个
孔，每孔 200 μL;第二组 96 孔板加入含药血清培养
液，以生理盐水组大鼠血清培养液和培养液为对照，
每药重复 5 个孔，每孔 200 μL，继续培养 48 h 后，弃
去培养液，加入 5 g·L － 1的 MTT 溶液 50 μL 培养 4 h
后，吸去上清液，加入 150 μL DMSO，在摇床上振摇
10 min 使结晶充分溶解，用酶标仪在 405 nm 处，测
定吸光度。用 Spss 15. 0 统计学软件进行加药组与
对照组之间的比较(图 1 ～ 4)。细胞增殖率的计算
如下:
增殖率 =(A加药组 － A对照组)/ A对照组 × 100%
图 1 无血清培养液对照组(MTT 染色，100 ×)
图 2 空白血清组(MTT 染色，100 ×)
3 结果
MTT 测定结果如表 1，2 所示。含药培养液试验
中，各组试药对细胞增殖均有一定作用，且除 S乙 和
Z糖 组外，均有特别显著的作用，尤其是生、制品正丁
醇组增殖率达到了 116. 2%，184. 3%，说明狗脊正丁
醇提取部位直接与成骨细胞共同培养时，促进细胞
生长的作用最强，且制品作用大于生品。含药血清
培养液试验中，S氯，S乙，Z乙，Z正 和 Z糖 组对细胞增殖
图 3 含药培养液试验 Z正 组(MTT 染色，100 ×)
图 4 含药血清培养液试验 Z正 组(MTT 染色，100 ×)
有一定作用，且呈显著作用，制品正丁醇组增殖率最
大，为 59. 2%，说明狗脊炮制品正丁醇提取部位的
含药血清与成骨细胞共同培养时，促进细胞生长的
作用最强。
表 1 含药培养液对细胞增殖的影响(珋x ± s，n = 12)
药物 A(珋x ± s) 增殖率 /%
S石 0. 530 ± 0. 0503) 92. 4
S氯 0. 447 ± 0. 0733) 62. 2
S乙 0. 380 ± 0. 0431) 37. 7
S正 0. 596 ± 0. 0643) 116. 2
S糖 0. 499 ± 0. 0803) 80. 9
Z石 0． 494 ± 0. 0783) 79. 4
Z氯 0. 526 ± 0. 0563) 90. 9
Z乙 0. 693 ± 0. 0993) 151. 5
Z正 0. 783 ± 0. 0503) 184. 3
Z糖 0. 367 ± 0. 0421) 33. 2
无血清培养液对照组 0. 276 ± 0. 043
小牛血清培养液对照 0. 805 ± 0. 0823) 191. 9
注:与无血清培养液对照组相比1)P ＜ 0. 05，2)P ＜ 0. 01，3)P ＜
0. 001，表 2 同。
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第 17 卷第 24 期
2011 年 12 月
中国实验方剂学杂志
Chinese Journal of Experimental Traditional Medical Formulae
Vol． 17，No． 24
Dec．，2011
表 2 含药血清培养液对细胞增殖的影响
药物 A(珋x ± s) 增殖率 /%
S石 0. 364 ± 0. 042
S氯 0. 713 ± 0. 048 3) 23. 9
S乙 0. 687 ± 0. 036 3) 19. 4
S正 0. 606 ± 0. 050 5. 2
S糖 0. 593 ± 0. 033 3. 1
Z石 0. 293 ± 0. 035
Z氯 0. 357 ± 0. 048
Z乙 0. 805 ± 0. 045 3) 39. 8
Z正 0. 917 ± 0. 052 3) 59. 2
Z糖 0. 757 ± 0. 051 3) 31. 6
空白血清组 0. 576 ± 0. 041
小牛血清培养液对照 0. 800 ± 0. 052 3) 39. 0
由 2 种试验方法可以看出，狗脊炮制品正丁醇
提取部位对成骨细胞的增殖作用最强，可作为进一
步分析狗脊有效成分的基础。
4 讨论
狗脊制品正丁醇提取部位对成骨细胞增殖作用
最强，这与前期研究［1-2］狗脊制品正丁醇提取部位抗
大鼠卵巢切除骨质疏松模型作用最强的试验结果相
吻合。大鼠卵巢切除骨质疏松模型虽然是国内外公
认的骨质疏松经典动物模型，但其周期长，在药物的
筛选中应用较少，更多的是用在药效学评价中。本
试验结果与大鼠卵巢切除骨质疏松模型的试验结果
相吻合，因其均以制品正丁醇提取部位作用最强，故
认为可以用成骨细胞试验作为高通量的筛选，能够
筛选出抗骨质疏松的具体有效成分，且方法周期较
短，试验方法简便快捷，可用来筛选有效成分。
由前期研究及本研究可以看出，狗脊能够促进
成骨细胞生长，并且能够抗大鼠卵巢切除型骨质疏
松，这提示狗脊抗骨质疏松作用可能是通过促进骨
细胞生长，增加骨量，以增加骨密度的机制来实
现的。
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［责任编辑 蔡仲德］
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于海涛，等:狗脊生、制品不同提取部位对成骨细胞的影响