全 文 ：红树林植物尖瓣海莲内生真菌 Penicillium sp． B21
次级代谢产物的分离鉴定
罗由萍 邓鹏飞* 牛燕燕 郑彩娟 闫向阳 陈 军
(海南师范大学化学与化工学院，教育部热带药用植物化学重点实验室 海口 571158)
摘 要 研究了红树林植物尖瓣海莲叶内生真菌 Penicillium sp． B21 次级代谢产物。用硅胶柱层析、制备薄层
层析和重结晶等方法，从该菌发酵液的乙酸乙酯萃取相中首次分离获得 5 个单体化合物，运用现代波谱技术、
单晶 X射线衍射以及文献数据对照，鉴定其结构分别为 8-羟基-6 甲基-1-甲氧羰基酮(1)、大黄素(2)、ω-羟
基大黄素(3)、(3Ｒ，4S)-6，8-二羟基-3，4，5-三甲基-3，4-二氢异香豆素(4)和 3，6，8-三羟基-3，5，7-三甲基-3，4-
二氢异香豆素(5)。首次获得了 sclerotinin B单晶结构。
关键词 红树林内生真菌;Penicillium sp． B21;次级代谢产物;分离鉴定;X射线单晶衍射
中图分类号:O629 文献标识码:A 文章编号:1000-0518(2015)10-1196-05
DOI:10． 11944 / j． issn． 1000-0518． 2015． 10． 150076
2015-03-03 收稿，2015-05-12 修回，2015-06-01 接受
海南省自然科学基金资助项目(214023) ;海南师范大学校青年基金(QN1244，QN1242)
通讯联系人:邓鹏飞，副教授;Tel:0898-65887172;E-mail:dengpengfei@ gmail． com;研究方向:药物化学
植物内生菌(endophyte)是指一类在其部分或全部生活史中存活于健康植物组织内部，而不使宿主
植物表现出明显感染症状的微生物［1］。红树林植物内生真菌次级代谢产物具有结构多样性和显著的生
物活性等特征，红树林植物内生真菌已成为寻找具有生物活性的先导化合物的重要资源。国内外研究
人员对很多红树林植物包括尖瓣海莲(Bruguiera sexangula var． rhynchopetala)进行了化学成分研究
［2-3］。但截至目前尖瓣海莲内生真菌次级代谢产物的研究未见报道。本文选择海南红树植物尖瓣海莲
叶内生真菌青霉菌 Penicillium sp． B21 作为目标菌株，从其发酵液乙酸乙酯萃取相中分离得到 5 个化合
物(Scheme 1)。
Scheme 1 Structures of compounds 1 ～ 5
1 实验部分
1． 1 仪器和试剂
X4 型显微熔点仪(北京光电仪器厂) ，温度未校正;Bruker400M型核磁共振仪(瑞士 Bruker 公司) ;
G6300 型液-质联用仪(美国 Agilent科技公司) ，Gemini A Ultra型 X射线单晶衍射仪(美国 Agilent科技
公司)。石油醚、乙酸乙酯、氯仿、甲醇等为工业试剂，使用前重蒸;葡萄糖(CＲ) ，粗海盐(微生物养殖
第 32 卷 第 10 期 应 用 化 学 Vol． 32 Iss． 10
2015 年 10 月 CHINESE JOUＲNAL OF APPLIED CHEMISTＲY Oct． 2015
用) ;薄层层析硅胶 GF254和柱层析硅胶(青岛海洋化工厂)。
1． 2 微生物培养
菌株于 2013 年 8 月分离自海南东寨港红树林自然保护区的尖瓣海莲叶，经形态学和分子生物学鉴
定该菌株为青霉属真菌，该菌种现保存于热带药用植物化学教育部重点实验室。无菌状态下取尖瓣海
莲样品，用无菌水冲洗 3 遍，0. 01 升汞浸泡 1 min，无菌水冲洗 3 遍，75%酒精浸泡 30 s，无菌水冲洗
3 遍。将组织切块，置于 PDA(马铃薯 200 g、葡萄糖 20 g、琼脂 15 g、陈海水 1000 mL、pH = 7. 2)培养基
中，28 ℃恒温倒置培养。待菌丝长出后，挑取尖端菌丝转接至新的培养基上，几次纯化后得到共附生真
菌并转接到试管斜面上保存备用。发酵培养基为 PDA 培养基，添加葡萄糖 25 g /L，粗海盐 36 g /L，
1000 mL三角瓶内装 400 mL 培养液，经 121 ℃(0. 1 MPa)高温灭菌 25 min 后，在超净工作台上接种
100 L，28 ℃静置培养 40 d。
1． 3 提取与分离
将所得发酵液过滤得发酵液和菌丝体。发酵液用乙酸乙酯充分萃提，菌丝体用甲醇充分浸提。合
并萃取液，使用旋转蒸发仪浓缩后硅胶柱色谱分离。以石油醚-乙酸乙酯(体积比 10 ∶ 1，5 ∶ 1，3 ∶ 1，1 ∶ 1，
1∶3) ，乙酸乙酯-甲醇(体积比 10∶1，5∶1，3∶1，1∶ 1，1∶ 3)梯度洗脱，收集各组分，再经反复柱层析、薄层层
析、重结晶等方法纯化得到化合物 1(550 mg)、化合物 2(300 mg)、化合物 3(350 mg)、化合物 4
(55 mg)、化合物 5(90 mg)。
1． 4 化合物的波谱数据
化合物 1:无色块状晶体(甲醇) ，mp 197. 9 ～ 198. 2 ℃。EI-MS(m/z) :284(100%) ;1 H NMＲ
(400 MHz，CDCl3) ，δ:12. 15(s，1H，8-OH) ，7. 74(dd，J = 8. 5，7. 3 Hz，1H，H-3) ，7. 52(dd，J = 8. 5，
1. 0 Hz，1H，H-4) ，7. 28(dd，J = 7. 3，1. 0 Hz，1H，H-2) ，6. 75(d，J = 6. 69 Hz，1H，H-5) ，6. 63(d，J =
6. 69 Hz，1H，H-7) ，4. 03(s，3H，H-11) ，2. 43(s，3H，H-12) ;13 C NMＲ(100 MHz，CDCl3) ，δ:180. 5(C-9) ，
169. 7(C-10) ，161. 5(C-8) ，155. 9(C-4a) ，155. 7(C-4b) ，149. 4(C-6) ，134. 8(C-3) ，133. 6(C-1) ，122. 5
(C-2) ，119. 4(C-4) ，117. 6(C-9a) ，111. 7(C-7) ，107. 4(C-5) ，106. 9(C-8a) ，53. 2(C-11) ，22. 7(C-12)。
化合物 2:桔红色针状晶体(甲醇) ，mp 258. 0 ～ 258. 5 ℃。EI-MS(m/z) :270(100%) ;1 H NMＲ
(400 MHz，Acetone-d6) ，δ:12. 0，11. 9，11. 3(s，1H，each，OH) ，7. 4(s，1H，H-4) ，7. 1(d，J = 2 Hz，1H，
H-5) ，6. 9(s，1H，H-2) ，6. 5(d，J = 2 Hz，1H，H-7) ，2. 3(s，3H，CH3) ;
13 C NMＲ(100 MHz，Acetone-d6) ，δ:
190. 3(C-9) ，181. 6(C-10) ，167. 5(C-8) ，165. 6(C-1) ，162. 3(C-6) ，148. 3(C-3) ，135. 6(C-10a) ，133. 4
(C-4a) ，123. 9(C-4) ，120. 5(C-2) ，113. 7(C-9a) ，109. 8(C-5) ，108. 8(C-8a) ，108. 0(C-7) ，21. 1(CH3)。
化合物 3:橙色针状晶体(丙酮) ，mp 151 ～ 152 ℃。EI-MS(m/z) :286(100%) ;1H NMＲ(400 MHz，
Acetone-d6) ，δ:12. 1(s，2H，OH) ，10. 1 (s，1H，OH) ，7. 65(s，1H，H-5) ，7. 26(s，1H，H-7) ，7. 13(d，J = 4 Hz，
1H，H-4) ，6. 60(d，J = 4 Hz，1H，H-2) ，5. 58(s，1H，CH2OH) ，4. 61(s，2H，CH2OH) ;
13 C NMＲ(100 MHz，
Acetone-d6) ，δ:189. 7(C-9) ，181. 5(C-10) ，165. 8(C-6) ，164. 5(C-8) ，161. 5(C-1) ，152. 8(C-3) ，135. 2
(C-10a) ，132. 9(C-4a) ，120. 8(C-4) ，117. 1(C-2) ，114. 1(C-9a) ，108. 9(C-5) ，107. 9(C-8a) ，62. 0(CH2OH)。
化合物 4:无色针状晶体(甲醇) ，mp 217 ～ 218 ℃。EI-MS(m/z) :222(100%) ;1H NMＲ(400 MHz，
Acetone-d6) ，δ:11. 31(s，1H，8-OH) ，9. 38(brs，1H，6-OH) ，6. 21(m，1H，H-7) ，4. 59(m，1H，H-3) ，3. 02
(m，1H，H-4) ，1. 96(s，3H，Me-5) ，1. 15(m，6H，Me-3，Me-4) ;13 C NMＲ(100 MHz，aceton-d6) ，δ:169. 4
(C-1) ，163. 7(C-6) ，163. 3(C-8) ，144. 1(C-4a) ，114. 8(C-5) ，101. 4(C-7) ，100. 1(C-8a) ，80. 7(C-3) ，
35. 2(C-4) ，20. 1(Me-3) ，19. 9(Me-4) ，10. 1(Me-5)。
化合物 5:无色块状晶体(甲醇) ，mp 192. 9 ～ 193. 2 ℃。EI-MS(m/z) :238(100%) ;1 H NMＲ
(400 MHz，Acetone-d6) ，δ:11. 77(brs，1H，8-OH) ，9. 56(brs，1H，6-OH) ，7. 49(brs，1H，6-OH) ，3. 10(m，
2H，H-4) ，2. 13(s，3H，Me-10) ，2. 07(s，3H，Me-9) ，1. 70(s，3H，Me-11) ;13 C NMＲ(100 MHz，aceton-d6) ，
δ:170. 1(C-1) ，160. 3(C-8) ，159. 2(C-6) ，134. 4(C-4a) ，114. 1(C-5) ，108. 1(C-7) ，102. 4(C-3) ，99. 7
(C-8a) ，35. 7(C-4) ，27. 4(C-11) ，11. 3(C-9) ，8. 7(C-10)。
7911第 10 期 罗由萍等:红树林植物尖瓣海莲内生真菌 Penicillium sp． B21 次级代谢产物的分离鉴定
1． 5 晶体培养及晶体结构测试
对化合物 1 在氯仿 /甲醇中培养 1 星期，得到无色长方体型晶体，取一片 0. 4 mm × 0. 2 mm ×
0. 2 mm的晶体进行单晶衍射分析。化合物 5 在甲醇中培养得到无色块状晶体。利用 Agilent
Technologies Gemini A Ultra X射线单晶衍射仪，用石墨单色化的 Mo-Kδ(λ = 0. 154184 nm)为衍射源，
293 K下采集单晶衍射数据。用 SHELXL-97 程序直接法解出晶体结构，数轮差值 Fourier 拟合确定非氢
原子坐标，对全部非氢原子坐标及各向异性参数进行全矩阵最小二乘法修正，氢原子位置按照理论模型
计算。
2 结果与讨论
2． 1 化合物结构的确认
化合物 1:从氢谱可以看到，δ 9. 0 以上为酚-OH的信号区，δ 12. 15 提示有1 个缔合的酚羟基;有1 个
1，2，3-三取代的苯环［δ 7. 28(dd，J = 7. 3，1. 0 Hz，1H，) ，7. 52(dd，J = 8. 5，1. 0 Hz，1H) ，7. 74(dd，J =
8. 5，7. 3 Hz，1H) ］，一个甲氧基［δ 4. 03(s，3H) ］，以及一个甲基［δ 2. 43(s，3H) ］。结合碳谱，δ 180. 5 为
一个氢键缔合羰基的信号，δ 155. 9、155. 7 为典型的连氧芳碳的位移值，猜测该化合物具有酮的母核
结构［4］。经二维谱图分析以及已报道数据比对［5］，确定该化合物的结构为 Janthinone。单晶 X射线衍射
分析进一步确证该化合物的结构。
化合物 2:该化合物的碳谱有两个羰基峰［δ 190. 3、181. 6］，此外还有 12 个芳碳信号，提示具有蒽醌
母核结构。从氢谱可以看出，低场有两个与羰基缔合的酚羟基［δ 12. 05(s，1H) ，11. 94(s，1H) ］，提示两
个羟基是 1，8-二羟基。还能明显看出苯环上的氢是间位取代(J = 2. 2 Hz) ，结合二维谱图以及已报道的
文献［6］，可以判断该化合物为大黄素。
化合物 3:该化合物的碳谱有两个羰基峰［δ 189. 7、181. 5］，此外还有 12 个芳碳信号，提示具有蒽醌
母核结构。δ 62. 0 为一个连氧碳。δ 12. 1(s，2H)提示 1，8-位有两个酚羟基;δ 7. 13(d，J = 2. 3 Hz，1H) ，
6. 59(d，J = 2. 3，1H)为同一苯环上间位的 H，δ 5. 58 的一个宽峰为醇羟基峰。结合二维谱图以及已报道
的文献［7］，可以判断该化合物为 ω-羟基大黄素。
化合物 4:从氢谱可以看出，δ 11. 3 为一个缔合的酚羟基，δ 9. 38 为一个自由的酚羟基。低场区有一
个单峰［δ 6. 21(s，1H) ］，提示有一个五取代的苯环，δ 4. 59、3. 02 为次甲基峰，其中前者与氧相连。从碳
谱可以看出，δ 169. 4 为一个酯羰基，δ 163. 7 ～ 100. 1 为芳碳信号，δ 80. 7 和 35. 2 为两个次甲基碳，前者
与氧相连，此外还有 3 个端甲基信号，δ 20. 0、19. 9 和 10. 1。结合二维谱图以及已报道的文献［8］，可以判
断该化合物为 decarboxydihydrocitrinone。
图 1 化合物 1、2 的 HMBC关系图
Fig． 1 Key HMBC correlations of compounds 1 and 2
化合物 5:氢谱显示有 2 个苄基氢 δ 3. 10 (m，
2H，H-4) ，1 个甲基 δ 1. 70(s，3H，Me-11) ，2 个芳甲
基 δ 2. 13(s，3H，Me-10)和 δ 2. 07(s，3H，Me-9) ，碳
谱显示有 1 个酯羰基 δ 170. 1(C-1)以及 1 个苯环。
结合已报道的文献［9］，可判断该化合物为 Sclerotinin
B。单晶 X射线衍射分析进一步确证该化合物的结
构。
2． 2 单晶衍射分析
化合物 1 的晶体结构如图 2 所示。晶体空间群为 I2 /a，晶胞参数 a = 1. 32775(4)nm，b =
1. 04031(2)nm，c = 1. 96513(5)nm，α = 90°，β = 104. 907(3)°，γ = 90°;分子式为C16H12O5，相对分子质
量 Mr = 284. 26，晶胞体积 V = 2. 62259(12) nm
3，晶胞内分子数 Z = 8，Dx = 1. 400 g /cm
3，μ =
0. 905 mm －1，F(000)= 1184，Ｒ = 0. 0406，wＲ2 = 0. 1102(2345)。
通过 platon分析结果表明，分子中 3 个环几乎在一平面上，平面之间具有强烈的 pi-pi 堆积相互作
用(α = 3. 58°，β = 22°，γ = 22°，平面之间的垂直距离为 0. 329nm) ;同时存在一个分子内氢键(9-羰基氧
原子与 8-羟基氢原子，H—O键长为 0. 189 nm，O—H—O键长为 0. 263 nm)。晶胞堆积图如图 3 所示。
8911 应 用 化 学 第 32 卷
图 2 化合物 1 的晶体结构
Fig． 2 X-Ｒay crystal structure of compound 1
图 3 化合物 1 晶胞堆积图
Fig． 3 Packing diagram of compound 1
化合物 5 的晶体结构如图 4 所示。晶体空间群为 P 21 /c，晶胞参数 a = 0. 74894(4)nm，b =
1. 73259(10)nm，c = 1. 77508(10)nm，α = 90°，β = 96. 237(5)°，γ = 90°;分子式为C16H14O5，相对分子质
量 Mr = 238. 23，晶胞体积 V = 2. 2897(2)nm
3，晶胞内分子数 Z = 4，Dx = 1. 382 g /cm
3，μ = 0. 0108 mm －1，
F(000)= 1008. 0，Ｒ = 0. 1486，wＲ2 = 0. 4833(4680)。
图 4 化合物 5 的晶体结构
Fig． 4 X-Ｒay crystal structure of compound 5
图 5 化合物 5 晶胞堆积图
Fig． 5 Packing diagram of compound 5
通过 platon分析结果表明，该化合物形成一个分子内氢键，(1-羰基氧原子与 8-羟基氢原子，H—O
键长为 0. 189nm，O—H—O键长为 0. 260nm) ;此外 2 个分子还形成 2 个分子间氢键，即 6-羟基氧(氢)
原子分别与相邻分子的 3-羟基氢(氧)原子形成氢键(H—O 键长为 0. 204 nm，O—H—O 键长为
0. 280 nm)。由于氢键的饱和性，该晶体中存在两两成对的分子，导致晶体中非对称单元中存在 3 个相
同的分子。分子中苯环之间的 pi-pi 堆积作用(α = 2. 6°，β = 20. 8°，γ = 20. 2°，平面之间的垂直距离为
0. 353 nm)将分子串起来像个“葫芦串”。晶胞堆积图如图 5 所示。该晶体结构为首次获得，其晶体学数
据已上传于剑桥晶体数据中心(CCDC号:1047539)。
3 结 论
传统药用植物和特殊生境中的植物的内生真菌是重要的生物资源［10］。本文选择海南红树植物尖
瓣海莲叶内生真菌青霉菌 Penicillium sp． B21 作为目标菌株，从其发酵液乙酸乙酯萃取相中分离得到 8-
羟基-6 甲基-1-甲氧羰基酮(1)、大黄素(2)、ω-羟基大黄素(3)、(3Ｒ，4S)-6，8-二羟基-3，4，5-三甲基-
3，4-二氢异香豆素(4)和 3，6，8-三羟基-3，5，7-三甲基-3，4-二氢异香豆素(5)。所有化合物均为首次从
尖瓣海莲叶内生真菌得到，并首次获得 sclerotinin B 单晶结构。其中大黄素是一种蒽醌类化合物，具有
免疫调节、抗菌、抗炎和抗肿瘤等多方面的药理作用，目前主要是从蓼科植物虎杖中提取。通过生物发
酵的办法，可高效廉价的得到大黄素单体，具有广阔的应用前景，值得进一步研究。
9911第 10 期 罗由萍等:红树林植物尖瓣海莲内生真菌 Penicillium sp． B21 次级代谢产物的分离鉴定
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Isolation and Structure Elucidation of Secondary Metabolites
from Mangrove Endophytic Fungus Penicillium sp． B21
LUO Youping，DENG Pengfei* ，NIU Yanyan，ZHENG Caijuan，YAN Xiangyang，CHEN Jun
(Key Laboratory of Tropical Medicinal Plant Chemistry of Ministry of Education，
College of Chemistry and Chemical Engineering，
Hainan Normal University，Haikou 571158，China)
Abstract The secondary metabolites of the medicinal mangrove endophytic fungus Penicillium sp． B21 were
investigated． Five compounds were firstly isolated from the ethyl acetate extract of the fermentation mixture
using silica gel column chromatography，preparative thin-layer chromatography and recrystallization． The
structures of these compounds were identified as janthinone (1) ，emodin (2) ，citreorosein (3) ，
decarboxydihydrocitrinone(4)and sclerotinin B(5) ，by comprehensive spectroscopic characterizations，X-ray
single crystal diffraction as well as comparison with reported data． The single crystal structure of compound 5
was firstly obtained．
Keywords mangrove endophytic fungus;Penicillium sp． B21;secondary metabolites;isolation and
elucidation;X-ray single crystal diffraction
Ｒeceived 2015-03-03;Ｒevised 2015-05-12;Accepted 2015-06-01
Supported by the Natural Science Foundation of Hainan Province(No． 214023)
Corresponding author:DENG Pengfei，associate professor;Tel:0898-65887172;E-mail:dengpengfei @ gmail． com;Ｒesearch interests:
pharmaceutical chemistry
0021 应 用 化 学 第 32 卷